一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法
【專利摘要】一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法。赤蘚糖醇(Erythrito)是迄今發(fā)現(xiàn)的自然界中相對分子質(zhì)量最小的糖醇，具有結(jié)晶性好、入口清涼等特點(diǎn)，為國際上較流行的新型功能性甜味劑。由于赤蘚糖醇具有良好的食品加工適應(yīng)性和保健功能，目前廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品及化工等領(lǐng)域。本發(fā)明以蔗糖為原料，以NTG誘變獲得的高產(chǎn)埃西托叢梗孢酵母為發(fā)酵菌株，通過對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化，赤蘚糖醇的最終濃度可達(dá)220g/L，發(fā)酵濃度高，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法 一、

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及微生物發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的技術(shù)。 二、

【背景技術(shù)】
[0002] 赤蘚糖醇（Erythrito)是迄今發(fā)現(xiàn)的自然界中相對分子質(zhì)量最小的糖醇，具有結(jié) 晶性好、入口清涼等特點(diǎn)，為國際上較流行的新型功能性甜味劑。除與其他多元糖醇同樣具 有防齲齒以及適于糖尿病患者食用等保健功能外，赤蘚糖醇還有兩個重要特性，即低熱量 (< 1.66kJ/g)和高耐受量（無副作用）。由于赤蘚糖醇具有良好的食品加工適應(yīng)性和保 健功能，目前廣泛用于食品、醫(yī)藥、化妝品及化工等領(lǐng)域。
[0003] 自赤蘚糖醇被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)對其物理化學(xué)性質(zhì)、生理功能及其作用機(jī)理、代謝途 徑和在食品中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了較為深入的研究。近年來，對其分子生物學(xué)方面的研究 也引起了科技界的廣泛關(guān)注。赤蘚糖醇生產(chǎn)方法包括生物抽提法、化學(xué)合成法以及發(fā)酵法。 生物抽提法是指赤蘚糖醇可以從海藻、苔鮮及某些草類中提取。用化學(xué)法，氫化還原合成， 可由丁烯二醇與過氧化氫反應(yīng)，其中丁烯二醇是由乙炔和甲醛先制成2-丁炔-1，4-二醇， 然后將其水溶液與雷氏鎳混合并加入阻化劑氨水，在〇. 5MPa左右通氫，氫化后得赤蘚糖醇 產(chǎn)品。
[0004] 發(fā)酵法為用一定基質(zhì)培養(yǎng)微生物，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇。如將淀粉乳酶 解成葡萄糖后，由微生物在高濃度條件下發(fā)酵后提純精制、濃縮、結(jié)晶、分離、干燥而得。上 述三種方法，其中，生物抽提法成本相當(dāng)高，得率極低；化學(xué)合成法污染嚴(yán)重、質(zhì)量不穩(wěn)定， 食用安全系數(shù)較低。因此，發(fā)酵法是最為理想的生產(chǎn)方法。
[0005] 1956年，加拿大spencerj. F. T等在研究高滲酵母產(chǎn)生甘油時(shí)，發(fā)現(xiàn)因菌種生長 速度、培養(yǎng)條件不同，可產(chǎn)生赤蘚糖醇。80年代，日本農(nóng)水省食品綜合研究所與日研化學(xué) (株）共同研究開發(fā)成功赤蘚糖醇生產(chǎn)技術(shù)，并有產(chǎn)品上市。從90年代起，日本在克服以往 赤蘚糖醇發(fā)酵研究中存在的菌種耐糖性差、發(fā)泡性強(qiáng)、發(fā)酵產(chǎn)率低以及副產(chǎn)品多等問題的 情況下，率先實(shí)現(xiàn)了赤蘚糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)。其他一些工業(yè)發(fā)達(dá)國家如法國Ceerstar公司 也有赤蘚糖醇產(chǎn)品。國內(nèi)目前有山東保齡寶、淄博中食歌瑞等公司采用發(fā)酵法生產(chǎn)赤蘚糖 醇，但因規(guī)模和技術(shù)等因素尚不能滿足市場的需求。近幾年，國內(nèi)外為獲得赤辭糖醇的生產(chǎn) 而進(jìn)行了利用高滲酵母生產(chǎn)赤蘚糖醇研究，但多數(shù)還停留在生產(chǎn)菌株的分離篩選、培養(yǎng)條 件優(yōu)化以及赤蘚糖醇的分離純化技術(shù)等實(shí)驗(yàn)室研究階段，菌種的生產(chǎn)性能較低，產(chǎn)量一般 在24. 8-54. 6mg/mL之間，難以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。 三、


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過利用化學(xué)誘變劑N-甲基-N-亞硝基胍（NTG)誘變親代菌株，選擇相對 于親代菌株有增高的赤蘚糖醇轉(zhuǎn)化率的菌株而獲得突變體。發(fā)酵中以蔗糖為原料，將高產(chǎn) 埃西托叢梗孢酵母YZ0806通過一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，生產(chǎn)赤蘚糖醇 (注：埃西托叢梗孢酵母（Moniliella acetoabutans)保藏在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2012年8月7 日，保藏編號：CGMCC No. 6415)。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)包括：
[0008] 1.誘變后得到赤蘚糖醇的高產(chǎn)菌株
[0009] 利用化學(xué)誘變劑N-甲基-N-亞硝基胍（NTG)誘變Moniliella菌株得到高產(chǎn)赤蘚 糖醇的埃西托叢梗孢酵母YZ0806,克服了野生菌株產(chǎn)率低純度低的缺點(diǎn)，通過發(fā)酵工藝優(yōu) 化調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流，可實(shí)現(xiàn)赤蘚糖醇的高得率。
[0010] 2.無其他雜糖醇類物質(zhì)
[0011] 根據(jù)本方法生產(chǎn)的赤蘚糖醇純度高，不含其他雜糖醇類物質(zhì)。
[0012] 3.原料環(huán)保，避免石油污染
[0013] 采用蔗糖為原料，產(chǎn)生的赤蘚糖醇轉(zhuǎn)化率高且不累積甘油、戊五醇和乙醇等副產(chǎn) 物，同時(shí)可以避免從石油帶來的不可食的污染成分。
[0014] 4.適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)
[0015] 生物發(fā)酵法生產(chǎn)赤蘚糖醇，赤蘚糖醇的最終濃度可達(dá)220g/L，發(fā)酵濃度高，適合產(chǎn) 業(yè)化生產(chǎn)。 四、【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 發(fā)酵菌株：埃西托叢梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806
[0018] 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖200g，酵母膏10g，尿索lg，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，ρΗ6· 0 ;
[0019] 種子培養(yǎng)基：鹿糖25g，牛肉膏5g，酵母膏7g，蛋白胨35g，蒸饋水1100mL ;
[0020] 埃西托叢梗孢酵母YZ0806接種于斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)72h進(jìn)行活化，活化2 次；將3塊0. 5cm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)，32°C，160rpm培養(yǎng)48h ; 培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)基以10%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，32°C，通氣量 0. 5vvm，菌體生長期控制溶氧為30%，50h后調(diào)整溶氧為15%，pH范圍在6. 0，180rpm培養(yǎng) 144h ;菌株發(fā)酵液在4000r/min的條件下離心20-30min，上清液即為赤蘚糖醇的粗提液，赤 蘚糖醇含量為221g/L。
[0021] 實(shí)施例2
[0022] 發(fā)酵菌株：埃西托叢梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806
[0023] 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖200g，酵母膏10g，尿索lg，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，ρΗ6· 0 ;
[0024] 種子培養(yǎng)基：鹿糖20g，牛肉膏3g，酵母膏5g，蛋白胨30g，蒸饋水1000mL ;
[0025] 埃西托叢梗孢酵母YZ0806接種于斜面培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)72h進(jìn)行活化，活化2 次；將3塊0. 5cm2活化后的菌株接入滅菌冷卻后的種子培養(yǎng)基內(nèi)，32°C，160rpm培養(yǎng)48h ; 培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)基以10%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌冷卻后的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，32°C .通氣量 0. 5vvm，菌體生長期控制溶氧為30%，50h后調(diào)整溶氧為15%，pH范圍在5. 0，180rpm培養(yǎng) 144h ;菌株發(fā)酵液在4000r/min的條件下離心20-30min，上清液即為赤蘚糖醇的粗提液，赤 蘚糖醇含量為225g/L。
[0026] 實(shí)施例3
[0027] 發(fā)酵菌株：埃西托叢梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806
【權(quán)利要求】
1. 一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法，其特征在于：利用化學(xué)誘變劑N-甲基-N-亞硝基 胍（NTG)誘變親代菌株獲得高產(chǎn)菌株，通過一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)，采 用陰、陽離子交換樹脂對產(chǎn)品進(jìn)行精制，濃縮結(jié)晶后獲得赤蘚糖醇晶體。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法，其特征在于：NTG誘變處理為 取0. 1 % -0. 5%的亞硝基胍（NTG)處理液8-10mL，加入8-10mL孢子懸浮液，34?35°C保溫 振蕩處理50-60min，先稀釋800-1000倍終止反應(yīng)，適當(dāng)稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，34? 35°C保溫培養(yǎng)1?2d，挑取生長較好透明水解圈較大的單菌落接于斜面上，搖瓶初篩獲得 正突變株。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法，其特征在于：高產(chǎn)菌株為埃 西托叢梗抱酵母（Moniliella acetoabutans)YZ0806,其菌種保藏編號為CGMCC Νο·6415。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法，其特征在于：種子培養(yǎng)和發(fā) 酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基分別為，種子培養(yǎng)基：蔗糖20g-25g，牛肉膏3g-5g，酵母膏5g-7g，蛋白胨 30g-35g，蒸饋水 lOOOmL-llOOmL ;發(fā)酵培養(yǎng)基：鹿糖 100g-120g，酵母膏 5g-7g，脲 lg-2g， MgS04 · 7H20 0· 5g-0. 8g，蒸餾水 lOOOmL-llOOmL 上述培養(yǎng)基在 0· IMPa，121°C條件下滅菌 20min_25min〇
5. 如權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵法制取赤蘚糖醇的方法，其特征在于：赤蘚糖醇的發(fā) 酵濃度可達(dá)220g/L以上。
【文檔編號】C12R1/645GK104120154SQ201310143795
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】王福清, 王福華, 殷紅 申請人:中科醫(yī)藥行業(yè)生產(chǎn)力促進(jìn)中心有限公司