專利名稱：脫氮細(xì)菌組合物及其應(yīng)用的制作方法
發(fā)明所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有脫氮生物學(xué)活性的細(xì)菌組合物及該細(xì)菌組合物在水體生物脫氮中的應(yīng)用
背景技術(shù)：
氮素是所有生命必須的營(yíng)養(yǎng)元素，也是全球生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分。使用氮肥已經(jīng)成為農(nóng)作物特別是糧食作物高產(chǎn)和增產(chǎn)的主要手段。但氮肥的使用在大幅度提高作物產(chǎn)量的同時(shí)也帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題如飲用水硝酸鹽積累的不斷增長(zhǎng)，湖泊等封閉半封閉水域的富營(yíng)養(yǎng)化，NH4+-NH3進(jìn)入水體危害魚(yú)貝等水產(chǎn)資源；以及溫室氣體N2O不斷排放加劇了大氣溫室效應(yīng)和對(duì)臭氧層的破壞等。提高氮素利用率、降低氮肥損失和對(duì)環(huán)境的不良影響已經(jīng)成為目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。同時(shí)，氮素形態(tài)轉(zhuǎn)化又與污水污泥脫氮效率、脫氮工藝的改良，水體富營(yíng)養(yǎng)化的解決密切相關(guān)。目前解決水體的氮素富營(yíng)養(yǎng)化有物理方法、化學(xué)方法和生物方法。隨著氮素污染的不斷加劇和人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的日益重視，除氮技術(shù)，特別是生物脫氮技術(shù)已經(jīng)成為控制水體污染的重要方向和手段。
氨氮是造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要氮素污染物之一。目前普遍認(rèn)為，在生物脫氮過(guò)程中，廢水中的氨氮首先被自養(yǎng)硝化菌在好氧條件下氧化為NOx-，然后NOx-在缺氧條件下被反硝化細(xì)菌還原為氣態(tài)氮如N2等從水中逸出。硝化和反硝化既可在活性污泥反應(yīng)器中進(jìn)行，又可在生物膜反應(yīng)器中進(jìn)行，而實(shí)際應(yīng)用最多的還是活性污泥法，硝化菌和反硝化菌處在同一活性污泥中。由于目前發(fā)現(xiàn)和使用的硝化菌的好氧和自養(yǎng)特性與反硝化菌的缺氧和異養(yǎng)特性明顯不同，脫氮過(guò)程通常需在兩個(gè)反應(yīng)器中獨(dú)立進(jìn)行，如Bardenpho工藝、UCT(University ofCapetwon)工藝、雙溝式氧化溝工藝等，或在一個(gè)反應(yīng)器中順次進(jìn)行如SBR(Sequencing Batch Reactor，序批式反應(yīng)器)。當(dāng)混合污泥進(jìn)入好氧池或處于好氧狀態(tài)時(shí)情況則相反，硝化菌工作，反硝化菌處于抑制狀態(tài)；當(dāng)混合污泥進(jìn)入缺氧池或處于缺氧狀態(tài)時(shí)，反硝化菌工作，硝化菌處于抑制狀態(tài)。
但是不管傳統(tǒng)的微生物附著型污水處理構(gòu)筑物，如生物濾池、生物轉(zhuǎn)盤(pán)和淹沒(méi)式生物濾池，還是新開(kāi)發(fā)的一些高效生物膜處理系統(tǒng)，如兩相流化床、三相流化床、厭氧流化床，電極-生物膜法，這些方法所采用的硝化菌群多為自養(yǎng)菌，增殖速度慢且難以維持較高生物濃度，需先經(jīng)曝氣處理以降低有機(jī)物濃度，菌株才能生長(zhǎng)并表現(xiàn)生物學(xué)活性，抗沖擊能力弱；高濃度氨氮和亞硝酸鹽會(huì)又抑制硝化菌的生長(zhǎng)，使硝化作用不完全，導(dǎo)致總氮去除率很低。
目前，國(guó)外有研究者對(duì)好氧條件下的生物脫氮過(guò)程進(jìn)行了研究，利用某些微生物種群在好氧條件下具有反硝化的特性來(lái)實(shí)現(xiàn)同步硝化與反硝化。研究結(jié)果表明，泛養(yǎng)硫球菌(Thiosphera pantotroph)、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenea faecalis)、假單胞菌(Pseadonmonas sp)、叢毛單胞菌(Comamonos sp.)等微生物在好氧條件下可利用NOx-N進(jìn)行反硝化。將硝化菌和反硝化菌置于同一反應(yīng)器如曝氣池內(nèi)混合培養(yǎng)，可達(dá)到單個(gè)反應(yīng)器的同步硝化反硝化。但反硝化結(jié)果不盡人意，大量氮被轉(zhuǎn)化成氧化態(tài)氮，這種氧化態(tài)氮又是大氣溫室氣體效應(yīng)和臭氧空洞形成的罪魁禍?zhǔn)祝菀自斐啥挝廴尽?br> 國(guó)內(nèi)也進(jìn)行了一些相關(guān)的研究工作，利用好氧反硝化菌群和自養(yǎng)硝化菌群組合脫氮(耿金菊，劉登如等，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2002，8(1)78-82)。細(xì)菌組合物雖然具有較好的氨氮脫除能力，但抗沖擊能力較弱，氨氮濃度高于0.3克/升的高濃度的氨氮能抑制菌體的生長(zhǎng)，并且氨氮濃度高于0.2克/升時(shí)，脫氮后氨氮?dú)堄嗔枯^多；同時(shí)不耐高的有機(jī)碳濃度，并且0.5克/升的有機(jī)碳濃度能抑制菌體生長(zhǎng)并降低脫氮效果。而且這種組合菌群中的各類細(xì)菌培養(yǎng)與生長(zhǎng)條件不一致，一方發(fā)揮功能時(shí)另一方卻被處于抑制狀態(tài)，導(dǎo)致彼此不協(xié)調(diào)，生物脫氮過(guò)程時(shí)間延長(zhǎng)，成本增大，更重要的是，脫氮效率一般，脫氮后的水體離環(huán)保要求還有距離。
發(fā)明技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種細(xì)菌組合物，該細(xì)菌組合物通過(guò)協(xié)同作用能有效地脫除水體中的氮素，將有害氮素轉(zhuǎn)化成對(duì)水體無(wú)污染的生物菌體和對(duì)大氣環(huán)境無(wú)污染的氮?dú)?，而且脫氮時(shí)間大為縮短。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供細(xì)菌組合物在水體生物脫氮中的應(yīng)用。
一種具有脫氮生物學(xué)活性的細(xì)菌組合物，其特征在于它含有(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌，
(B)異養(yǎng)好氧反硝化細(xì)菌，其中組份(A)與組份(B)可按任意比例混合就可實(shí)現(xiàn)水體聯(lián)合脫氮的目的。在組份(A)中有微量的組份(B)或在組份(B)中有微量的組份(A)，這種細(xì)菌組合物通過(guò)協(xié)同作用能有效地脫除水體中的氮素，將有害氮素轉(zhuǎn)化成對(duì)水體無(wú)污染的生物菌體和對(duì)大氣環(huán)境無(wú)污染的氮?dú)狻?br> 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明提供的組份(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌是是球形節(jié)桿菌WR-2，(Arthrobacter globiformis WR-2)，其保藏登記號(hào)為CCTCCM202043。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明公開(kāi)的組份(B)異養(yǎng)反硝化細(xì)菌是植物短小桿菌WO-8，(Curtoacterium plantarum WO-8)，其保藏登記號(hào)為CCTCC M202044。
一種具有脫氮生物學(xué)活性的細(xì)菌組合物，其特征在于它含有下列組份(體積比)(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌 1-99％，(B)異養(yǎng)好氧反硝化細(xì)菌 99-1％，其中異養(yǎng)硝化細(xì)菌是球形節(jié)桿菌的一類細(xì)菌，異養(yǎng)反硝化細(xì)菌是植物短小桿菌的一類細(xì)菌。在本發(fā)明中，本發(fā)明研究者以河南省封丘的華北潮土這種堿性石灰性土壤為供試土樣，經(jīng)PM平板分離、純化、活性檢驗(yàn)，格利斯試劑鑒定，獲得了格利斯反應(yīng)呈陽(yáng)性的異養(yǎng)菌株，初步確認(rèn)它們具有氨氧化能力。在這些菌株中進(jìn)一步篩選，挑選性能穩(wěn)定而且硝化活性和單株氨氮脫除能力強(qiáng)的菌株作為目的菌株，我們發(fā)現(xiàn)球形節(jié)桿菌WR-2具有這種性能。經(jīng)鑒定為球形節(jié)桿菌WR-2，Arthrobacter globiformis WR-2。該菌株具有以下特征1.菌落形態(tài)特征在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板(PM平板)上恒溫28℃好氣培養(yǎng)7天后形成很小的菌落，圓形，扁平，全緣；表面不光滑有皺紋、菌苔表面呈土黃色，基質(zhì)未見(jiàn)明顯的可溶性色素產(chǎn)生。
2.菌體形態(tài)特征革蘭氏陽(yáng)性；培養(yǎng)早期，細(xì)胞呈不規(guī)則的桿狀，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間則出現(xiàn)球形，老化的細(xì)胞幾乎全為球狀；多以鏈狀形式排列；不運(yùn)動(dòng)，不形成內(nèi)生孢子。
3.主要生理生化特性見(jiàn)表1最適培養(yǎng)溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
4.氨氧化活性在90-100r/min搖床培養(yǎng)14天積累的亞硝酸鹽濃度均高于60.0mg NO2-NL-1，個(gè)別單株可高達(dá)95mg NO2-NL-1以上。
5.脫氮活性以濃度為0.075mol L-1乙酸鈉為碳源時(shí)，C/N為5∶1，培養(yǎng)28
表1 WR-2菌株的生理生化特性檢測(cè)項(xiàng)目 結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目 結(jié)果生長(zhǎng)需生物素 + 液化明膠 +硫胺素 - 水解淀粉 +NO3→NO2+ D-木糖 -/+尿酸 + 松三糖 +m-羥基苯甲酸 + D-葡萄糖醛酸鹽 -/+α-酮基-戊二酸 + 環(huán)己六醇 -棉子糖 - D-甘露糖 -D-甘氨酸 + 蔗糖 -/+乳糖 -注+表示陽(yáng)性反應(yīng)或能利用-表示陰性反應(yīng)或不能利用。天，氨氮脫除率為65％，全氮去除率為62％；丙酮酸為碳源時(shí)，濃度為0.050molL-1時(shí)，C/N為5∶1，培養(yǎng)28天，氨氮脫除率為90％，全氮去除率為68％。所殘余的全氮幾乎為菌體細(xì)胞。
參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版的分類鑒定，該菌株為球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)。因此將其命名為球形節(jié)桿菌WR-2。球形節(jié)桿菌WR-2已于2002年11月5日在中國(guó)專利局指定的保藏單位-中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏登記號(hào)CCTCC M202043。
在本發(fā)明中，本發(fā)明人還從河南省封丘的華北潮土中分離到的一株植物短小桿菌屬細(xì)菌，進(jìn)一步反復(fù)篩選檢測(cè)比較，結(jié)果這株細(xì)菌具有異養(yǎng)好氧反硝化性能，經(jīng)鑒定為植物短小桿菌WO-8，Curtoacterium plantarum WO-8。該菌株具有以下特征1.菌落形態(tài)特征在PM營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上恒溫28℃好氣培養(yǎng)2天后，形成的菌落為圓形、扁平、全緣，表面光滑；菌苔表面呈桔黃色，基質(zhì)未見(jiàn)明顯的可溶性色素產(chǎn)生。
2.菌體形態(tài)特征革蘭氏染色為陽(yáng)性反應(yīng)；短桿狀、粗狀、菌體兩端鈍圓，多以單個(gè)排列形式出現(xiàn)；未見(jiàn)內(nèi)生孢子形成；運(yùn)動(dòng)。
3.主要生理生化特性見(jiàn)表2，最適培養(yǎng)溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
4.菌株的反硝化活性具有強(qiáng)反硝化活性，具有硝酸鹽、亞硝酸鹽還原能力，實(shí)驗(yàn)測(cè)得在7天內(nèi)將200mg N L-1NO2-脫除99％；10天內(nèi)將280mg N L-1
表2 WO-8菌株的生理生化特性檢測(cè)項(xiàng)目 結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目 結(jié)果α-環(huán)狀糊精 - 土溫40+糊精+ 土溫80+糖原+ N-乙酰-D-葡糖胺 -苦杏仁苷- N-乙酰-D-甘露糖胺 -L-阿拉伯糖 - 對(duì)苯二酚葡糖苷-D-阿拉伯糖 + 纖維二糖 -果糖+ 墨角藻糖 -D-半乳糖- 龍膽二糖 -α-D-葡萄糖 + α-D-乳糖 -m-肌醇 - 乳糖 -麥芽糖 -/+D-甘露醇 +D-甘露糖-/+D-蜜二糖 -α-甲基-D-半乳糖苷 - α-甲基-D-葡萄糖苷-β-甲基-D-半乳糖苷 - β-甲基-D-葡萄糖苷-β-甲基葡萄糖 - D-阿洛酮糖-D-棉子糖- L-鼠李糖 -D-核糖 + 蔗糖 -D-塔格糖- 海藻糖-松二糖 - 木糖醇-D-木糖 -/+醋酸 +α-羥基-丁酸+ β-羥基-丁酸 +α-酮基-戊二酸 + 甲基丙酮酸+單-甲基琥珀酸 + 丙酸 +丙酮酸 + 檸檬酸-琥珀酸 + N-乙酸-L-谷氨酸 +丙酰胺 + D-丙氨酸 +L-丙氨酸+ L-丙氨酰-甘氨酸 +L-天冬酰胺 + L-谷氨酸 +甘氨酸-L-谷氨酸 + L-焦谷氨酸-L-絲氨酸- 2，3-丁二醇 -甘油+ 肌苷 -胸腺嘧啶核苷- 尿苷 -/+1-磷酸葡萄糖- 2-磷酸葡萄糖 -D-L-α-甘油磷酸 -注表中+表示結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)，-表示表示結(jié)果呈陰性反應(yīng)。NO3-脫除97％，并以氣態(tài)氮的形式逸失。以銨鹽為氮源時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有亞硝酸鹽的生成，無(wú)異養(yǎng)硝化活性。
參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版的分類鑒定，該菌株為植物短小桿菌(Curtobacterium plantarum)。因此將其命名為植物短小桿菌WO-8。植物短小桿菌WO-8已于2002年11月5日在中國(guó)專利局指定的保藏單位-中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏登記號(hào)CCTCC M202044。
在本發(fā)明中，通過(guò)液體搖床分別培養(yǎng)球形節(jié)桿菌WR-2和植物短小桿菌WO-8，并分別測(cè)菌液OD600值，調(diào)相同菌體OD600值，按體積百分比量取細(xì)菌混合，獲得本發(fā)明所提供的細(xì)菌組合物。在本發(fā)明中，在組份(A)中有微量的組份(B)或在組份(B)中有微量的組份(A)，由這兩株菌組成的細(xì)菌組合物通過(guò)協(xié)同作用能有效地脫除水體中的氮素，將有害氮素轉(zhuǎn)化成對(duì)水體無(wú)污染的生物菌體和對(duì)大氣環(huán)境無(wú)污染的氮?dú)猓@種生物脫氮過(guò)程是在有氧條件和異養(yǎng)狀態(tài)下進(jìn)行的，細(xì)菌以有機(jī)碳作為能源，將氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化成雙氮的氣體，而且這種生物轉(zhuǎn)化過(guò)程不需要物理與化學(xué)的曝氣處理，與傳統(tǒng)的方法相比，生物反應(yīng)的時(shí)間大為縮短。
本發(fā)明的組合物中除含有球形節(jié)桿菌WR-2和植物短小桿菌WO-8這兩種組份外，本發(fā)明的細(xì)菌組合物還可含有(體積比)(C)水體脫氮工藝中可接收的載體0-10％；其中水體脫氮工藝中可接收的載體是指聚乙烯醇，硝化和反硝化細(xì)菌。在本發(fā)明中，聚乙烯醇是指重量比為20％的聚乙烯醇，20％的聚乙烯醇溶液配制時(shí)取20克聚乙烯醇常規(guī)溶解即得，然后根據(jù)需要量取適量的體積，形成組合物。在本發(fā)明中，硝化和反硝化細(xì)菌是指蠟狀芽孢桿菌NBB-135，(CGMCC No.0560)；短小芽孢桿菌NBB-112，(CGMCC No.0561)；環(huán)狀芽孢桿菌NBB-295，(CGMCCNo.0557)；地衣芽孢桿菌NBB-072，(CGMCC No.0562)；糞產(chǎn)堿菌，(CGMCCNo.1.1799)；熒光假單胞菌，(CGMCC No1.1802)等。這些菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行專利程序保藏或可向該菌種保藏機(jī)構(gòu)索取。常用的硝化細(xì)菌與反硝化細(xì)菌在測(cè)菌液OD600值后，調(diào)相同菌體OD600值，按體積百分比量取細(xì)菌后混合。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，該細(xì)菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌30-70％，(B)異養(yǎng)反硝化細(xì)菌 70-30％。
在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選方案中該細(xì)菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌40％，(B)異養(yǎng)反硝化細(xì)菌 60％。
本發(fā)明提供的異養(yǎng)硝化細(xì)菌主要是指在有氧狀態(tài)下將水體中的NH4+通過(guò)硝化作用轉(zhuǎn)化成NO2-和NO3-，或氧化態(tài)N以及將水體中的NH4+轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣蜓趸瘧B(tài)氮。本發(fā)明提供的異養(yǎng)反硝化細(xì)菌主要是在有氧狀態(tài)下將水體中的將氧化態(tài)氮如NO2-和NO3-轉(zhuǎn)化為氮?dú)馀懦觯愷B(yǎng)硝化細(xì)菌和異養(yǎng)反硝化細(xì)菌二者聯(lián)合作用水體，可有效地將水體中的氮素污染轉(zhuǎn)化對(duì)大氣也無(wú)二次污染的氮?dú)庖莩霾⑶铱s短污水處理時(shí)間。一般地采用本發(fā)明的細(xì)菌組合比單株水體脫氮時(shí)間縮短7天，本發(fā)明的優(yōu)選細(xì)菌組合比WR-2單株在水體脫氮時(shí)間縮短17天。比傳統(tǒng)的自養(yǎng)的硝化與反硝化工藝過(guò)程脫氮速率提高19-30％。
在本發(fā)明中的銨態(tài)氮或氨態(tài)氮是指可溶性的銨根離子NH4+-NH3；氮氧化物是指NO和N2O。
在本發(fā)明中硝化作用是指微生物將NH4+氧化為NO2-，繼而NO2-再氧化為NO3-的過(guò)程，或者由于微生物作用導(dǎo)致氧化態(tài)氮增多的過(guò)程。它是自然界氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，也是農(nóng)田氮素?fù)p失的關(guān)鍵途徑之一。生物硝化作用可以分為三大類型化能自養(yǎng)型硝化作用、異養(yǎng)型硝化作用和甲烷營(yíng)養(yǎng)型硝化作用。
在本發(fā)明中異養(yǎng)硝化廣義上是指有機(jī)和無(wú)機(jī)氮化合物從還原態(tài)經(jīng)生物氧化為多種氧化態(tài)的過(guò)程，狹義上的是指異養(yǎng)微生物在好氧條件下將氧化態(tài)-3的銨氮或有機(jī)態(tài)氮氧化為羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的過(guò)程。
在本發(fā)明中反硝化是指微生物將NO3-還原為NO2-，繼而NO2-再還原為N2O、NO或N2的過(guò)程。
在本發(fā)明中碳/氮比，又稱C/N比是指碳元素的摩爾濃度與氮元素的摩爾濃度之比，如C/N＝1相當(dāng)于硫酸銨0.015mol L-1乙酸鈉0.015mol L-1。
在本發(fā)明中脫氮是指水體中可溶性氮的去除，可溶性氮是指NH4+，NO2-和NO3-。
在本發(fā)明中水體脫氮工藝中可接收的載體包括吸附劑，硝化和反硝化細(xì)菌等。在本發(fā)明中使用的各種單位，有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的一律采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，亞硝酸鹽濃度為60.0mg NO2-N L-1，表示每升溶液中含60毫克亞硝態(tài)氮，硝酸鹽含量為0.18mg N L-1表示每升溶液中含0.18毫克硝態(tài)氮，


附圖1球形節(jié)桿菌WR-2的菌體顯微照片附圖2植物短小桿菌WO-8的菌體顯微照片附圖3細(xì)菌組合物的不同時(shí)間的脫氮效果圖。其中NH4，TN，NO2分別表示體系中氨氮?dú)埩魸舛龋獨(dú)埩魸舛群蛠喯跛猁}的積累濃度。
下面結(jié)合具體實(shí)施例。進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如土壤微生物研究會(huì)〖日〗編，葉維青等譯，科學(xué)出版社，1983，土壤微生物實(shí)驗(yàn)法；許光輝等編，北京農(nóng)業(yè)出版社，1986，土壤微生物分析方法手冊(cè)；以及中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所微生物室編，科學(xué)出版社，1985，土壤微生物研究法等書(shū)中所述的條件，或接照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例實(shí)施例1.培養(yǎng)基和試劑的配制1.1PM液體培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)配制稱3克牛肉浸膏，5克蛋白胨，溶解于1000毫升蒸餾水中形成PM液體培養(yǎng)基，在上述未滅菌的液體PM培養(yǎng)基中加入20克瓊脂，形成PM固體培養(yǎng)基。
用1N氫氧化鈉調(diào)培養(yǎng)基pH至7.1。分裝在三角瓶中，滅菌，培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí)倒平板。PM液體培養(yǎng)基經(jīng)高壓液相色譜分析，結(jié)果是亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量為0.18mg N L-1。
1.2格利斯試劑的配制1.2.1對(duì)氨基苯磺酸試劑(A液)0.5克對(duì)氨基苯磺酸(Sulfanilic acid)溶于150毫升20％的稀醋酸溶液中，貯于棕色瓶，冷藏備用。
1.2.2α-萘胺試劑(B液)0.5克α-萘胺(α-naphthylamine)加到20毫升蒸餾水和150毫升20％的稀醋酸溶液中，貯于棕色瓶，冷藏備用。
1.2.3格利斯試劑的使用液取等比例的A液與B液混合即可使用。
1.3 NB液體培養(yǎng)基的配制1.3.1無(wú)機(jī)鹽溶液的配制稱取(NH4)2SO42.1克，NaH2PO40.25克，K2HPO40.75克，MgSO4·7H2O 0.03克，MnSO4·H2O 0.01克，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01克，溶解于1000毫升蒸餾水中，用1M NaOH調(diào)培養(yǎng)基的pH值為7.0，分裝在三角瓶中，滅菌。
1.3.2有機(jī)碳溶液的配制
1.3.2.1乙酸鈉溶液的配制稱取27.2克三水乙酸鈉溶解于1000毫升蒸餾水中形成0.20M的乙酸鈉溶液，滅菌。
1.3.2.2甲酸鈉溶液的配制稱取20.8克二水甲酸鈉溶解于1000毫升蒸餾水中形成0.20M的甲酸鈉溶液，滅菌。
1.3.2.3丙酮酸溶液的配制吸取14.0毫升丙酮酸溶解于1000毫升蒸餾水中形成0.20M的丙酮酸溶液，滅菌。
使用時(shí)取無(wú)機(jī)鹽溶液90份(體積比)與有機(jī)碳溶液10份混合，形成NB培養(yǎng)基。
1.4硝酸細(xì)菌培養(yǎng)基的配制稱取NaNO21.0克，MgSO4·7H2O 0.03克，K2HPO40.75克，NaH2PO40.25克，MnSO4·H2O 0.01克，NaCO31.0克，溶解于1000毫升蒸餾水中，用1M NaOH調(diào)培養(yǎng)基的pH值為7.2，分裝在三角瓶中，滅菌。
1.5二苯胺試劑的配制二苯胺0.5克，濃硫酸 100毫升，蒸餾水 20毫升；先將二苯胺0.5克溶于蒸餾水20毫升中，再徐徐加入濃硫酸100毫升，保存于棕色瓶中備用1.6反硝化培養(yǎng)基的配制1.6.1無(wú)機(jī)鹽溶液的配制稱取KNO32.0克，KH2PO41.0克，K2HPO41.0克，MgSO4·7H2O 0.2克，溶解于1000毫升蒸餾水，用1M NaOH調(diào)培養(yǎng)基的pH值為7.2，分裝在三角瓶中，滅菌。
1.6.2有機(jī)碳溶液的配制碳源為檸檬酸鈉、乙酸鈉或葡萄糖1.6.2.1葡萄糖溶液的配制稱取20克葡萄糖溶解于1000毫升蒸餾水中形成2％的葡萄糖溶液，滅菌。
1.6.2.2乙酸鈉溶液的配制稱取20克三水乙酸鈉溶解于1000毫升蒸餾水中形成2％的乙酸鈉溶液，滅菌。
使用時(shí)按體積比取無(wú)機(jī)鹽溶液90份與有機(jī)碳溶液10份混合，形成反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基。
實(shí)施例2、分離鑒定具有硝化活性的異養(yǎng)細(xì)菌菌株2.1土壤樣品采樣地點(diǎn)河南省封丘縣趙崗鄉(xiāng)；分類名稱中壤質(zhì)黃潮土；來(lái)源耕層土壤，淤土；土樣處理風(fēng)干、研磨過(guò)20目篩；2.2稱取1.0克風(fēng)干土于含有50毫升無(wú)菌蒸餾水的250毫升三角瓶中，90r/min搖床振蕩4小時(shí)。
2.3土懸液按10倍法稀釋后涂布于PM平板，每個(gè)稀釋度三個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)7天后，挑取單菌落到PM平板，劃線純化。鏡檢，證明純度。
2.4初篩(活性菌的鑒別)將獲得的經(jīng)分離純化后的異養(yǎng)菌株接種于PM平板，28℃培養(yǎng)10天，格利斯試劑直接點(diǎn)滴到平板，進(jìn)行硝化活性確認(rèn)，并以不接菌的平板作空白對(duì)照。1分鐘內(nèi)，格利斯試劑顯色呈紅色，表明有亞硝酸鹽生成。重復(fù)驗(yàn)證，顯色反應(yīng)仍呈陽(yáng)性，初步確認(rèn)為硝化活性菌。(見(jiàn)表3)。PM培養(yǎng)基經(jīng)高壓液相色譜分析，表明其中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量均為跡量其中亞硝酸鹽未檢出，硝酸鹽含量低于0.2mg N L-1，不會(huì)對(duì)結(jié)果構(gòu)成正干擾。
2.5復(fù)篩選取初篩時(shí)活性較強(qiáng)的代表性菌株進(jìn)行。刮取生長(zhǎng)于PM平板的純菌菌苔入30毫升無(wú)菌水，使其充分分散均勻制成菌懸液。分別接種1毫升菌懸液入含不同有機(jī)物為碳源的50毫升NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，每組三個(gè)重復(fù)。并以不接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照。28℃靜止培養(yǎng)42天后，培養(yǎng)液4℃下5000g離心15min，格利斯試劑法比色測(cè)定上清液中的亞硝酸鹽濃度。菌種樣品培養(yǎng)上清比色值減空白對(duì)照上清比色值的差值大于0.3mg N L-1時(shí)判為異養(yǎng)硝化活性菌(表4)。WR-2菌株硝化活性最高，確立為模式株。
2.6活性菌株的生理學(xué)鑒定參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版。細(xì)菌的形態(tài)和生理特征見(jiàn)表5，表6。
2.7球形節(jié)桿菌WR-2菌株具有以下特征2.7.1菌落形態(tài)特征在營(yíng)養(yǎng)瓊脂PM平板上恒溫28℃好氣培養(yǎng)7天后形成很小的菌落，圓形，扁平，全緣；表面不光滑有皺紋、菌苔表面呈土黃色，基質(zhì)未見(jiàn)明顯的可溶性色素產(chǎn)生，見(jiàn)圖1。
2.7.2菌體形態(tài)特征革蘭氏陽(yáng)性；培養(yǎng)早期，細(xì)胞呈不規(guī)則的桿狀，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間則出現(xiàn)球形，老化的細(xì)胞幾乎全為球狀；多以鏈狀形式排列；不運(yùn)動(dòng)，不形成內(nèi)生孢子。
表3部分活性菌株的分類種(屬)名 代表菌株節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)WY-1，WR-2球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis) WR-2歐文氏菌屬(Erwinia) WT-1，XY-3棒狀桿菌屬(Corynebacterium) WY-19小單孢菌屬(Micromonospora)WH-1芽孢桿菌屬(Bacillus)短小芽孢桿菌(Bacillus brevis) WY-2，WY-21地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) WX-2環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) WR-8堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillus firmus) WR-9表4各菌株的比色值(以亞硝酸鹽表示，NO2--N mg L-1)菌株號(hào) 碳源檸檬酸鈉 乙酸鈉XY-3 0.4 1.0WY-2 0.0 1.7WY-19 0.7 0.3WY-20 0.0 0.4WY-21 0.7 0.8WR-2 0.6 8.2WT-1 0.3 1.9WH-1 0.0 0.4CK0.0 0.1表5 節(jié)桿菌屬細(xì)菌的生理生化特性菌株號(hào) 厭氧生長(zhǎng) 接觸酶 淀粉水解 葡萄糖發(fā)酵 分解纖維素 吲哚實(shí)驗(yàn) 硝酸鹽還原B173 + + - +- - +B256 + + + +- - +B459 - + + +- - +B464 - + + +- - +B602 - + + +- - +B605 - + + +- - +WY-1 - + + +- - +WR-2 - + + +- - +注表中+表示結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)，-表示表示結(jié)果呈陰性反應(yīng)。
表6 節(jié)桿菌屬細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)特征菌株號(hào)B173 PM平板上菌落圓形，淺黃色，微凸起；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)內(nèi)生芽孢，12小時(shí)為長(zhǎng)短不一的桿菌，7天時(shí)為球狀細(xì)胞，有特定排列B256 PM平板上菌落圓形，黃色，微凸起；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)內(nèi)生芽孢，12小時(shí)為直或彎曲的小桿菌，有的有分支，7天時(shí)為球桿狀細(xì)胞B459 PM平板上菌落圓形，淺黃色，微凸起；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)內(nèi)生芽孢，12小時(shí)為桿菌，有二分支，形狀不規(guī)則，7天時(shí)為球菌、球桿菌B464 PM平板上菌落圓形，淺黃色，微凸起；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)內(nèi)生芽孢，12小時(shí)為桿菌，有分支，7天時(shí)為球菌、球桿菌B602 PM平板上菌落圓形，蛋黃色，不透明，凸起，光滑；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)內(nèi)生芽孢，12小時(shí)為桿菌，7天時(shí)為球菌，球形或橢球形B605 PM平板上菌落圓形，蛋黃色，凸起，光滑；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)內(nèi)生芽孢，12小時(shí)為桿菌，細(xì)長(zhǎng)彎曲，7天時(shí)為球菌、球桿菌WY-1 PM平板上菌落圓形，黃色，凸起，光滑；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)內(nèi)生芽孢，12小時(shí)為桿菌，有的有分支，7天時(shí)為球菌、球桿菌WR-2 可以在PM平板上形成很小的菌落，圓形，扁平，全緣；表面不光滑有皺紋、菌苔表面呈土黃色；革蘭氏陽(yáng)性；培養(yǎng)早期，細(xì)胞呈不規(guī)則的桿狀，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間則出現(xiàn)球形，老化的細(xì)胞幾乎全為球狀；多以鏈狀形式排列；不運(yùn)動(dòng)，不形成內(nèi)生孢子2.7.3主要生理生化特性見(jiàn)表1最適培養(yǎng)溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
2.7.4氨氧化活性在90-100r/min搖床培養(yǎng)14天積累的亞硝酸鹽濃度均高于60.0mg NO2-N L-1，個(gè)別單株可高達(dá)95mg NO2-N L-1以上。
2.7.5脫氮活性以乙酸鈉為碳源時(shí)，濃度為0.075mol L-1時(shí)，C/N為5∶1，培養(yǎng)28天，氨氮脫除率為65％，全氮去除率為62％；丙酮酸為碳源時(shí)，濃度為0.050mol L-1時(shí)，C/N為5∶1，培養(yǎng)28天，氨氮脫除率為90％，全氮去除率為68％。所殘余的全氮幾乎為菌體細(xì)胞。
參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版的分類鑒定，該菌株為球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)。因此將其命名為球形節(jié)桿菌WR-2。球形節(jié)桿菌WR-2已于2002年11月5日在中國(guó)專利局指定的保藏單位——中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC M202043。
實(shí)施例3 WO-8的分離與鑒定3.1稱取1.0克風(fēng)干土于50毫升已滅菌的，含有硝酸細(xì)菌加富培養(yǎng)基的250毫升三角瓶中，28℃，靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后每隔三天取樣，格利斯試劑點(diǎn)滴確定亞硝酸鹽的消失，等顯色反應(yīng)呈粉紅色或無(wú)紅色，顯陰性或弱陽(yáng)性后，以二苯胺試劑點(diǎn)滴確認(rèn)硝酸鹽的生成，若顯色反應(yīng)呈深藍(lán)或藍(lán)黑色；等顯色反應(yīng)呈淺藍(lán)色或無(wú)色，顯陰性或弱陽(yáng)性后即取2毫升培養(yǎng)液接種到新鮮培養(yǎng)基中。等格利斯試劑點(diǎn)滴顯色反應(yīng)、二苯胺試劑顯色反應(yīng)都再次呈陰性后，取樣進(jìn)行菌株分離。3.2加富培養(yǎng)液按10倍法稀釋后涂布于PM平板，每個(gè)稀釋度三個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)7天后，挑取單菌落到PM平板，劃線純化。鏡檢，證明純度。
3.3反硝化活性菌的篩選確認(rèn)刮取生長(zhǎng)于PM斜面的純菌菌苔入9毫升無(wú)菌水，使其充分分散均勻制成菌懸液。分別接種1毫升菌懸液入含50毫升以葡萄糖為碳源硝酸細(xì)菌培養(yǎng)基的250毫升三角燒瓶和含50毫升反硝化培養(yǎng)基的250毫升三角燒瓶。并以不接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照。28℃靜止培養(yǎng)，隔3天取樣，格利斯試劑點(diǎn)滴確認(rèn)亞硝酸鹽的存在和消失，通過(guò)硝酸鹽還原和亞硝酸鹽氧化，證明其反硝化活性，結(jié)果見(jiàn)表7。
通過(guò)對(duì)各活性菌株進(jìn)一步的比較，發(fā)現(xiàn)WO-8菌株可在7天內(nèi)將200mg NL-1NO2-脫除99％；10天內(nèi)將280mg N L-1NO3-脫除97％。確認(rèn)WO-8菌株亞硝酸鹽還原能力和硝酸鹽還原能力最強(qiáng)。
3.4 WO-8菌株經(jīng)鑒定為植物短小桿菌WO-8，(Curtoacterium plantarum WO-8)。該菌株具有以下特征3.4.1菌落形態(tài)特征在PM營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上恒溫28℃好氣培養(yǎng)2天后，形成的菌落為圓形、扁平、全緣，表面光滑；菌苔表面呈桔黃色，基質(zhì)未見(jiàn)明顯的可溶性色素產(chǎn)生。
3.4.2菌體形態(tài)特征革蘭氏染色為陽(yáng)性反應(yīng)；短桿狀、粗狀、菌體兩端鈍圓，多以單個(gè)排列形式出現(xiàn)；未見(jiàn)內(nèi)生孢子形成；運(yùn)動(dòng)，見(jiàn)圖2。
3.4.3主要生理生化特性見(jiàn)表2最適培養(yǎng)溫度為28-32℃，pH7.0-7.2，好氧。
3.4.4菌株的反硝化活性 具有強(qiáng)反硝化活性，具有硝酸鹽、亞硝酸鹽還原能力，實(shí)驗(yàn)測(cè)得可在7天內(nèi)將200mg N L-1NO2-脫除99％；10天內(nèi)將280mg NL-1NO3-脫除97％，并以氣態(tài)氮的形式逸失。以銨鹽為氮源時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有亞硝酸鹽的生成，無(wú)異養(yǎng)硝化活性。
表7 各菌株的反硝化活性表現(xiàn)(28℃，靜止培養(yǎng))亞硝酸鹽還原 硝酸鹽還原菌株號(hào)葡萄糖 檸檬酸鈉葡萄糖 檸檬酸鈉WO-1++ ++WO-2-- --WO-3-- --WO-4-- --WO-5-- ++WO-4-- --WO-7-- ++WO-8++ ++WO-9++ ++WO-10 ++ --WO-11 -- ++WO-12 -- ++WO-12 -- ++注-表示陰性，+表示陽(yáng)性參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)第九版的分類鑒定，該菌株為植物短小桿菌(Curtobacterium plantarum)。因此將其命名為植物短小桿菌WO-8。植物短小桿菌WO-8已于2002年11月5日在中國(guó)專利局指定的保藏單位-中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏登記號(hào)CCTCC M202044。
實(shí)施例4球形節(jié)桿菌WR-2的脫氮效果4.1培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基。以乙酸鈉為碳源，濃度分別為0.015mol L-1、0.0225mol L-1、0.030mol L-1、0.045mol L-1、0.075mol L-1、0.15mol L-1。
4.2預(yù)培養(yǎng)從PM斜面接-環(huán)菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在29±1℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
4.3按2％接種量，將預(yù)培養(yǎng)之菌液1毫升接至裝有50毫升NB培養(yǎng)基(不同濃度乙酸鈉為碳源)的250毫升錐形瓶中。設(shè)不接種對(duì)照，3次重復(fù)。30℃，靜止培養(yǎng)。
4.4結(jié)果見(jiàn)表8。
表8 不同濃度乙酸鈉為碳源時(shí)的培養(yǎng)狀況(30℃，靜止培養(yǎng))乙酸鈉濃度 0.015mol L-10.045mol L-10.075mol L-128天 42天 28天 48天 28天 38天NO2-1.19±0.29 4.15±1.33 0.074±0.021 0.41±0.190.094±0.010 0.090±0.016NH4+％ -42.08±6.16％ 37.4±1.90％ - 34.5±1.84％ 9.38±0.78％TN％ 70.9±1.24％ 54.7±3.03％ 45.0±2.97％ 23.6±1.85％ 37.7±1.20％ 22.3±1.82％注NO2-以毫克N L-1表示。
銨態(tài)氮?dú)埩舭俜直?NH4+％)＝接菌培養(yǎng)物的銨態(tài)氮濃度/不接菌對(duì)照的銨態(tài)氮濃度全氮?dú)埩舭俜直?TN％)＝接菌培養(yǎng)物的全氮/不接菌對(duì)照的全氮數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤n＝3。
表明WR-2培養(yǎng)物具有單株脫氮能力，能夠脫除體系中的銨氮和全氮，但脫氮產(chǎn)物主要為雙氮?dú)怏w(85％)，含少量氮氧化物(15％)，存在二次污染的可能性，且時(shí)間較長(zhǎng)。
實(shí)施例5 WR-2與WO-8的聯(lián)合脫氮效果5.1-般組合條件下，WR-2與WO-8的聯(lián)合脫氮效果5.1.1培養(yǎng)基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基，配方同1.3。
5.1.2培養(yǎng)5.1.2.1從PM斜面接-環(huán)植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值調(diào)至OD600＝0.45。
5.1.2.2從PM斜面接-環(huán)球形節(jié)桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值調(diào)至OD600＝0.45。
5.1.2.3 WO-8(5.1.2.1之培養(yǎng)物)和WR-2菌(5.1.2.2之培養(yǎng)物)分別以以①1∶99(體積比)，②7∶3(體積比)，③6∶4(體積比)的比例混合，再取混合菌液以2％的量接種，即取混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)在28±1℃，靜止培養(yǎng)21天。同時(shí)以單接WR-2菌(5.1.2.2之培養(yǎng)物)的培養(yǎng)作為對(duì)照。以靛酚藍(lán)比色法測(cè)氨態(tài)氮，格利斯試劑比色法測(cè)定亞硝態(tài)氮，開(kāi)氏法測(cè)定總氮。
5.1.3結(jié)果如表9.1，9.2所示表9.1不同混合比例下混合菌群的脫氮效果(靜止培養(yǎng)21天)WO-8WR-2 1∶997∶36∶4銨氮脫除率 70.8％ 82.7％ 90.1％全氮去除率 64.3％ 68.2％ 74.2％亞硝酸鹽濃度0.36 0.320.24注表中亞硝酸鹽濃度以mg N L-1表示表9.2 WR-2菌株的脫氮效果(靜止培養(yǎng))培養(yǎng)天數(shù) 21天 28天銨氮脫除率 47.8％66.3％全氮去除率 43.3％62.8％亞硝酸鹽濃度 0.66 0.74注表中亞硝酸鹽濃度以mg N L-1表示結(jié)果表明WO-8菌株和WR-2菌株以不同比例混合的混合培養(yǎng)物中，以WO-8菌株和WR-2菌株以6∶4比例混合的混合培養(yǎng)物脫氮效果最佳。且相同條件下不同比例的混合菌群氨氮和全氮的脫除效果都優(yōu)于WR-2菌株的單株脫氮效果，至少可以提前7天獲得相近的脫氮效果。
5.2最優(yōu)化條件下混合菌群的脫氮5.2.1從PM斜面接-環(huán)植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升的以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值調(diào)至OD600＝0.45。5.2.2從PM斜面接-環(huán)球形節(jié)桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值調(diào)至OD600＝0.45。5.2.3 WO-8(5.2.1之培養(yǎng)物)和WR-2菌(5.2.2之培養(yǎng)物)以6∶4(體積比)的比例混合，將混合菌液1毫升接至裝有50毫升新鮮NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，作脫氮?jiǎng)恿W(xué)曲線。設(shè)不接種對(duì)照，3次重復(fù)。同時(shí)以單接WR-2菌(5.2.2之培養(yǎng)物)的培養(yǎng)作為對(duì)照。28±1℃，靜止培養(yǎng)。
5.2.2結(jié)果如圖3所示。
在WR-2菌和WO-8菌聯(lián)合脫氮的條件下，混合菌群在21天內(nèi)，可脫去體系全氮的81％，銨氮去除率為98％，培養(yǎng)過(guò)程中亞硝酸鹽最高濃度僅為0.29毫克N L-1，幾乎無(wú)亞硝酸鹽的積累。證明混合菌群具有很好的全氮和銨氮去除能力。WR-2菌單株脫氮38天時(shí)可脫去體系全氮的78％，銨氮去除率為90％，細(xì)菌組合物較WR-2菌單株脫氮效率提高45％，得到相近的脫氮效果時(shí)間縮短了17天。
5.3分批補(bǔ)料時(shí)混合菌群的脫氮效果5.3.1 WR-2菌和WO-8菌以等體積比接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)。每天取樣分析銨氮。
5.3.2等銨氮濃度降低到＜10mg N L-1時(shí)，加入新鮮的NB培養(yǎng)基至銨氮濃度為440mg N L-1。
5.3.3等銨氮濃度再次降低到＜10mg N L-1時(shí)，重復(fù)4.3.2的操作。
5.3.4結(jié)果見(jiàn)表10。
表10 分批補(bǔ)料時(shí)混合菌群的脫氮效果第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 第六次 第七次培養(yǎng)天數(shù)17 14 10 8 7 5 5銨氮濃度9.5 9.2 8.1 9.7 7.6 5.8 8.3注培養(yǎng)天數(shù)以銨氮濃度降低到＜10mg N L-1的培養(yǎng)天數(shù)計(jì)算5.4固定化混合菌群的脫氮5.4.1混合菌群的固定化膜的制備5.4.1.1混合菌群濃縮菌體的制備5.4.1.1.1從PM斜面接一環(huán)植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將菌液調(diào)OD值調(diào)至OD600＝0.50。
5.4.1.1.2從PM斜面接一環(huán)球形節(jié)桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，將菌液調(diào)OD值調(diào)至OD600＝0.50。
5.4.1.1.3 WO-8(5.4.1.1.1之培養(yǎng)物)和WR-2菌(5.4.1.1.2之培養(yǎng)物)以64(體積比)的比例混合，將混合菌液在5000r/min，4℃下離心15分鐘，用生理鹽水洗滌離心兩次。
5.4.1.2混合菌群的固定將步驟5.4.1.1.3制得的濃縮菌體(相當(dāng)于混合菌液300毫升)加入到50毫升20％聚乙烯醇和1.0mol L-1的CaCl2的混合溶液中，以原始混合菌液計(jì)，聚乙烯醇濃度為2.5％(體積比)。攪勻后平鋪于有機(jī)玻璃板上，置于冰箱中，-20℃冷凍過(guò)夜，再在室溫下解凍。重復(fù)冷凍解凍3-4次，有蒸餾水充分洗滌表明，即得平板狀固定化細(xì)胞膜。
5.4.1.3固定化膜反應(yīng)器及脫氮實(shí)驗(yàn)將所得的固定化細(xì)胞膜用法蘭固定并組裝成生物脫氮反應(yīng)器。反應(yīng)器盛液量為1800毫升的以0.015mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3，其中銨態(tài)氮濃度減為120mg N L-1)，膜的有效面積為100cm2。置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行活化，待細(xì)胞活性穩(wěn)定后，進(jìn)行脫氮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，控制溶解氧濃度為5-8mg L-1。每隔一定時(shí)間取少量樣品分析其中的銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度。結(jié)果在培養(yǎng)108小時(shí)后，銨氮去除率為95.2％，亞硝酸鹽濃度僅為0.26mgN L-1，脫氮速率為0.19g·m-2·h-1。較傳統(tǒng)的自養(yǎng)硝化-厭氧反硝化細(xì)菌在同樣采用固定化膜技術(shù)(脫氮速率0.146-0.16g·m-2·h-1)(曹國(guó)民等，環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21(2)189-193)，脫氮速率提高19-30％。
實(shí)施例6 WR-2和WO-8的混合菌群加硝化菌短小芽孢桿菌NBB-112(CGMCC No.0561)的混合培養(yǎng)6.1培養(yǎng)基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基，配制方法同1.3。
6.2預(yù)培養(yǎng)6.2.1從PM斜面接一環(huán)短小芽孢桿菌NBB-112的菌苔入裝有以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的50毫升NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
6.2.2從PM斜面接一環(huán)植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
6.2.3從PM斜面接一環(huán)球形節(jié)桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
6.3培養(yǎng)WO-8(6.2.2之培養(yǎng)物)和WR-2菌(6.2.3之培養(yǎng)物)和NBB-112(6.2.1之培養(yǎng)物)以體積比10∶10∶1混合，再以2％量的接種混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養(yǎng)21天。以靛酚藍(lán)比色法測(cè)氨態(tài)氮，格利斯試劑比色法測(cè)定亞硝態(tài)氮，開(kāi)氏法測(cè)定總氮。
6.4結(jié)果混合培養(yǎng)物在培養(yǎng)21天后，脫除了體系全氮的64.5％，銨氮去除率為82.7％，亞硝酸鹽濃度僅為0.45mg N L-1。
實(shí)施例7 WR-2和WO-8的混合菌群加硝化菌蠟狀芽孢桿菌NBB-135(CGMCC No.0560)的混合培養(yǎng)7.1培養(yǎng)基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基，配制方法同1.3。
7.2預(yù)培養(yǎng)7.2.1從PM斜面接一環(huán)蠟狀芽孢桿菌NBB-135的菌苔入裝有以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的50毫升NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
7.2.2從PM斜面接一環(huán)植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
7.2.3從PM斜面接一環(huán)球形節(jié)桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
7.3培養(yǎng)WO-8(7.2.2之培養(yǎng)物)和WR-2菌(7.2.3之培養(yǎng)物)和NBB-135(7.2.1之培養(yǎng)物)按3∶7∶0.5(體積比)混合，再以2％量的接種混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養(yǎng)21天。以靛酚藍(lán)比色法測(cè)氨態(tài)氮，格利斯試劑比色法測(cè)定亞硝態(tài)氮，開(kāi)氏法測(cè)定總氮。
7.4結(jié)果混合培養(yǎng)物在培養(yǎng)21天后，脫除了體系全氮的62.3％，銨氮去除率為78.1％，亞硝酸鹽濃度僅為0.52mg N L-1。
實(shí)施例8 WR-2和WO-8的混合菌群加反硝化菌，熒光假單胞菌(CGMCCNo1.1802)的混合培養(yǎng)8.1培養(yǎng)基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基，配制方法同1.3。
8.1.1熒光假單胞菌(CGMCC No1.1802)從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心索取。
8.2預(yù)培養(yǎng)8.2.1從PM斜面接-環(huán)熒光假單胞菌的菌苔入裝有PM液體培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為菌體OD600＝0.45。
8.2.2從PM斜面接一環(huán)植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
8.2.3從PM斜面接一環(huán)球形節(jié)桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
8.3培養(yǎng)WO-8(8.2.2之培養(yǎng)物)和WR-2菌(8.2.3之培養(yǎng)物)和熒光假單胞菌(8.2.1之培養(yǎng)物)按70∶30∶8(體積比)混合，再以2％量的接種混合菌液1毫升接入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養(yǎng)21天。以靛酚藍(lán)比色法測(cè)氨態(tài)氮，格利斯試劑比色法測(cè)定亞硝態(tài)氮，開(kāi)氏法測(cè)定總氮。
8.4結(jié)果混合培養(yǎng)物在培養(yǎng)21天后，脫除了體系全氮的71.6％，銨氮去除率為84.2％，亞硝酸鹽濃度僅為0.13mg N L-1。
實(shí)施例9細(xì)菌組合物與普通硝化與反硝化聯(lián)合脫氮效果WR-2和WO-8的混合菌群加蠟狀芽孢桿菌NBB-135(CGMCC No.0560)、短小芽孢桿菌NBB-112(CGMCC No.0561)、環(huán)狀芽孢桿菌NBB-295(CGMCCNo.0557)、地衣芽孢桿菌NBB-072(CGMCC No.0562)、糞產(chǎn)堿菌(CGMCCNo.1.1799)、熒光假單胞菌(CGMCC No1.1802)的混合培養(yǎng)9.1培養(yǎng)基為以0.015mol L-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基，配制方法同1.3。
9.1.1熒光假單胞菌(CGMCC No1.1802)和糞產(chǎn)堿菌(CGMCC No.1.1799)、從中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心索取。
9.2預(yù)培養(yǎng)9.2.1從PM斜面各接一環(huán)蠟狀芽孢桿菌NBB-135(CGMCC No.0560)、短小芽孢桿菌NBB-112(CGMCC No.0561)、環(huán)狀芽孢桿菌NBB-295(CGMCC No.0557)、地衣芽孢桿菌NBB-072(CGMCC No.0562)、糞產(chǎn)堿菌(CGMCC No.1.1799)、熒光假單胞菌(CGMCC No1.1802)的菌苔入裝有70毫升PM液體培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)28小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為菌體OD600＝0.45。
9.2.2從PM斜面接一環(huán)植物短小桿菌WO-8的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
9.2.3從PM斜面接一環(huán)球形節(jié)桿菌WR-2的菌苔入裝有50毫升以0.015molL-1乙酸鈉為碳源的NB培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，在30℃，120-130r/min搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，將菌液調(diào)OD值為OD600＝0.45。
9.3培養(yǎng)WO-8(9.2.2之培養(yǎng)物)和WR-2菌(9.2.3之培養(yǎng)物)和熒光假單胞菌等混合培養(yǎng)(8.2.1之培養(yǎng)物)按10∶10∶1(體積比)混合，接1毫升混合菌液入以0.075mol L-1乙酸鹽為碳源的NB培養(yǎng)基(配方同1.3)。在30℃，靜止培養(yǎng)21天。以靛酚藍(lán)比色法測(cè)氨態(tài)氮，格利斯試劑比色法測(cè)定亞硝態(tài)氮，開(kāi)氏法測(cè)定總氮。
9.4結(jié)果混合培養(yǎng)物在培養(yǎng)21天后，脫除了體系全氮的76.3％，銨氮去除率為87.9％，亞硝酸鹽濃度僅為0.10mg N L-1。
權(quán)利要求
1.一種具有脫氮生物學(xué)活性的細(xì)菌組合物，其特征在于它含有(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌，(B)異養(yǎng)好氧反硝化細(xì)菌，其中組份(A)與組份(B)可按任意比例混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌組合物，其特征在于組份(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌是球形節(jié)桿菌WR-2，(Arthrobacter globiformis WR-2)，其保藏登記號(hào)為CCTCC M202043。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的細(xì)菌組合物，其特征在于組份(B)異養(yǎng)反硝化細(xì)菌是植物短小桿菌WO-8，(Curtoacterium plantarum WO-8)，其保藏登記號(hào)為CCTCC M202044。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中所述的任何一種細(xì)菌組合物，其特征在于它含有下列組份(體積比)(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌 1-99％，(B)異養(yǎng)好氧反硝化細(xì)菌 99-1％，其中異養(yǎng)硝化細(xì)菌是球形節(jié)桿菌WR-2(Arthrobacter globiformis WR-2)，其保藏登記號(hào)為CCTCC M202043，異養(yǎng)反硝化細(xì)菌是植物短小桿菌WO-8(Curtoacterium plantarum WO-8)，其保藏登記號(hào)為CCTCC M202044。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的細(xì)菌組合物，其特征在于該細(xì)菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌 30-70％，(B)異養(yǎng)好氧反硝化細(xì)菌 70-30％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的細(xì)菌組合物，其特征該細(xì)菌組合物含有下列組份(體積比)(A)異養(yǎng)硝化細(xì)菌 40％，(B)異養(yǎng)好氧反硝化細(xì)菌 60％。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中所述的任何一種細(xì)菌組合物，其特征該細(xì)菌組合物還含有(體積比)(C)水體脫氮工藝中可接收的載體 0-10％，其中水體脫氮工藝中可接收的載體是指聚乙烯醇，硝化和反硝化細(xì)菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的細(xì)菌組合物，其特征是聚乙烯醇為重量百分比為20％的聚乙烯醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的細(xì)菌組合物，其特征是硝化和反硝化細(xì)菌是指蠟狀芽孢桿菌NBB-135，(CGMCC No.0560)；短小芽孢桿菌NBB-112，(CGMCC No.0561)；環(huán)狀芽孢桿菌NBB-295，(CGMCC No.0557)；地衣芽孢桿菌NBB-072，(CGMCC No.0562)；糞產(chǎn)堿菌，(CGMCCNo.1.1799)；熒光假單胞菌，(CGMCC No1.1802)。
10.權(quán)利要求1至9中所述的任何一種細(xì)菌組合物在水體脫氮中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有脫氮生物學(xué)活性的，能將水體中的氮素轉(zhuǎn)化成無(wú)污染氮?dú)獾募?xì)菌組合物。該組合物含有異養(yǎng)硝化細(xì)菌和異養(yǎng)好氧反硝化細(xì)菌。該類細(xì)菌組合物能有效脫除氨態(tài)氮，保護(hù)環(huán)境。
文檔編號(hào)C02F3/34GK1590532SQ03118599
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者王一明, 彭光浩 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所