專利名稱：高堿性紡織工業(yè)廢水的生物中和的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌(Kurthia sp..)(MTCC 5181)，保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。更具體地，本發(fā)明涉及制備細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)的方法，所述菌株用于中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH-12.00-11.5)，并且保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可得國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的細(xì)菌分離株中和高堿性紡織工業(yè)廢水的方法。
背景和現(xiàn)有技術(shù)嚴(yán)格的法律和權(quán)威機(jī)構(gòu)頻繁的檢查反映了目前社會(huì)對(duì)環(huán)境的日益關(guān)注。因此，例如，當(dāng)排除到接收水道或污水系統(tǒng)中時(shí)，最低限度僅允許工業(yè)如紡織工業(yè)廢水的pH偏離中性點(diǎn)。
取決于應(yīng)用，可獲得各種化學(xué)品來中和高堿性的紡織工業(yè)廢水。在多數(shù)情形中，使用硫酸(H2SO4)。終端使用者必須考慮使用的濃度，必須仔細(xì)分析涉及的所有化學(xué)反應(yīng)，必須閱讀制造商的警示和說明，并且必須考慮關(guān)于危險(xiǎn)液體的公共安全措施。
用化學(xué)品處理廢水的方法包括使用酸或堿，或加入廢水中時(shí)能夠形成酸或堿的物質(zhì)。取決于應(yīng)用，可獲得各種化學(xué)品用于工業(yè)中和，不論是中和酸性溶液或堿性溶液。
用于酸性或堿性中和的最常使用的中和化學(xué)品是98％硫酸和50％氫氧化鈉。在很多情形中，它們是非常好的選擇，然而，在選擇化學(xué)品時(shí)需要進(jìn)行許多考慮，并且它們可能并非常常是最佳選擇。選擇用于中和酸或堿的化學(xué)品常常與設(shè)計(jì)中和體系一樣重要。下面列出了一些選擇化學(xué)品考慮的重點(diǎn)·健康和安全性。
·成本和便利性。
·中和化學(xué)品的物理性能。
·存儲(chǔ)環(huán)境。
化學(xué)品選擇標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)說明如下健康和安全性混合化學(xué)品可導(dǎo)致極度的危險(xiǎn)/有害反應(yīng)。例如，向具有氰化物的溶液中添加酸導(dǎo)致釋放致死的HCN氣體。
成本和便利性大多數(shù)應(yīng)用中酸和堿發(fā)揮作用。例如，硫酸(H2SO4)是低成本的，并且比硝酸更有效。在評(píng)估成本時(shí)濃度也是一個(gè)重要的考慮因素。例如，可以接近0％-98％的濃度范圍來購(gòu)買H2SO4。濃度越高，通常花費(fèi)越小。
物理性能必須仔細(xì)考慮所選擇試劑的物理性能。例如，50％氫氧化鈉(NaOH)在低于60的溫度下開始結(jié)冰。將濃度降低至25％完全消除了這一顧慮。例如，鹽酸(HCl)嚴(yán)重除氣(out gasses)。該氣體非常具有腐蝕性，并且侵蝕所有金屬物品。因此，如果使用HCl，必須是適當(dāng)通風(fēng)，或在氣體可容易消散的室外使用。
存儲(chǔ)環(huán)境關(guān)注存儲(chǔ)問題如罐的類型和可利用的次級(jí)污染，操作者對(duì)處理危險(xiǎn)化學(xué)品的熟練度，再填滿存儲(chǔ)容器或從大容積罐中轉(zhuǎn)移程序的危險(xiǎn)性。
最常使用的中和化學(xué)品如下·酸硫酸，鹽酸，硝酸，磷酸和在水中形成碳酸的二氧化碳。
·堿氫氧化鈉(苛性鈉)，氫氧化鈣，碳酸鈣(石灰或石灰石)，氫氧化銨。
用酸中和世界上最廣泛使用和生產(chǎn)的化學(xué)品是硫酸?？色@得的濃度范圍是0％-98％，在所有和普遍用于中和反應(yīng)的酸中，硫酸是最經(jīng)濟(jì)的。它比使用HCl或HNO3更容易和更安全，并且除了磷酸以外，它比其它所有酸更有效。硫酸的典型使用濃度范圍是25％-96％。然而，通常推薦使用30％-50％濃度的硫酸。
鹽酸(HCl)，也已知為muriatic acid，是在工業(yè)上第二個(gè)最常使用的酸，硫酸是主要的選擇，原因在于硫酸更有效并且相對(duì)廉價(jià)。在最大可獲得濃度37％時(shí)，HCl的有效性約是硫酸的1/3，因此使得它使用起來相對(duì)更昂貴。取決于溫度和攪拌，10％濃度以上的HCl變?yōu)槁然瘹湔魵?，其與空氣中存在的水蒸汽結(jié)合。由此形成的氣體具有高度的腐蝕性，并且侵蝕所有的金屬物品，包括建筑物結(jié)構(gòu)，噴頭，銅線，不銹鋼等。因此，必須是適當(dāng)通風(fēng)，或在氣體可容易消散的室外使用。
硝酸(HNO3)，盡管是在很多工業(yè)中廣泛使用的化學(xué)品，它仍然不如鹽酸或硫酸普及，原因在于它使用起來比兩者更昂貴。硝酸與空氣中存在的水蒸汽結(jié)合變?yōu)橛泻怏w。該氣體是高度腐蝕性的，并侵蝕所有金屬物品，包括建筑物結(jié)構(gòu)，噴頭，銅線，不銹鋼等。因此，必須是適當(dāng)通風(fēng)，或在氣體可容易消散的室外使用。
磷酸(H3PO4)，非常廣泛用于農(nóng)業(yè)肥料和洗滌產(chǎn)品的生產(chǎn)，它是相對(duì)廉價(jià)的酸。然而，它仍然不能與硫酸和鹽酸充分競(jìng)爭(zhēng)，原因在于它是弱酸，并且在正常濃度時(shí)在水中不能完全解離。這賦于它在使用時(shí)比硫酸或鹽酸更安全，并且它較少變體氣體。它傾向于緩沖中和反應(yīng)，這使得它用于較慢的容易控制的反應(yīng)。由于它的成本(與硫酸相比較)和可用性，磷酸不常用于中和體系中。
二氧化碳(CO2)是在地球大氣中發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)最濃的氣體，CO2本身不是酸。當(dāng)溶解于水中時(shí)，它形成碳酸(H2CO3)；就是這種碳酸在溶液中產(chǎn)生堿的中和。對(duì)于所有的實(shí)際應(yīng)用而言，CO2最吸引人的特征是它不將水的pH降低在7.0以下。另外，CO2不具有腐蝕性；然而，由于它比空氣更重，因此，一種危險(xiǎn)是引起窒息。由于必須將二氧化碳溶解在溶液中使用，因此難于使用該氣體，并且它的應(yīng)用受到限制。這需要使用碳酸化器，或一些方法，以將該氣體溶解在溶液中。還發(fā)生顯著的出氣，這不成問題，除非方法還需要固體沉淀。在灌注水泥的操作中，產(chǎn)生大量的堿性廢水。對(duì)于這類應(yīng)用而言是極好的選擇，原因在于位點(diǎn)是臨時(shí)的，氣體是無危險(xiǎn)的，假設(shè)考慮保留和混和，可以平行(in-line)使用，并且該氣體是自身緩沖的，因此不考慮劑量，它將不會(huì)將pH降低到低于7.5-7.0。
嗜堿菌(alkaliphiles)
取決于生長(zhǎng)條件，特別是營(yíng)養(yǎng)，金屬離子和溫度，對(duì)于生長(zhǎng)而言，幾種微生物顯示出多于一種適宜pH。術(shù)語(yǔ)“嗜堿菌”用于表示在pH超過9的條件下最適生長(zhǎng)或生長(zhǎng)良好的微生物。第一篇涉及嗜堿性微生物的堿性酶的報(bào)道公開于1971年(Horikoshi.K.(1971)Production of alkaline enzymesby alkalophilic microorganisms.Part 1.Akaine protease produced by BacillusNo，221.Agric.Biol.Chem.36，.1407-1414)。在過去的二十年中，我們的研究已經(jīng)集中在嗜堿性微生物的酶學(xué)，生理學(xué)，生態(tài)學(xué)，分類學(xué)，分子生物學(xué)和遺傳學(xué)。這些微生物的工業(yè)應(yīng)用也已經(jīng)被廣泛研究，一些酶如堿性蛋白酶，堿性淀粉酶和堿性纖維素酶已經(jīng)用于工業(yè)規(guī)模(Horikoshi，K.andAkiba，T.(1982)Alkalophilic MicroorganismsA New Microbial World.Springer-Verlag，Heidelberg，Tokyo.，Horikoshi，K.(1991)Microorganisms inAlkaline Environments，Kodansha-VCH，Tokyo，Weinheim，New York，Cambridge，Basel)。
隨后，很多微生物學(xué)家在各種領(lǐng)域發(fā)表了許多關(guān)于嗜堿性微生物的文章。在pH10-13的堿性環(huán)境中，嗜堿菌的細(xì)胞表面可以維持細(xì)胞內(nèi)的pH處于中性。在1995年，通過利用嗜基本二氧化碳C-125突變體開發(fā)了新的宿主載體系統(tǒng)，該突變體對(duì)堿性敏感，并且已經(jīng)研究了負(fù)責(zé)嗜堿性(alkaliphily)的基因(Kudo，T.，Hino，M.，Kitada，M.and Horikoshi，K.(1990)DNA sequences required for the alkalophily of Bacillus sp.strain C-125 arelocated close together on its chromosomal DNA.J.Bacteriol.172，7282-7283.Seto，Y.，Hashimoto，M.，Usami，R.，Hamamoto，T.，Kudo，T.and Horikoshi，K.(1995)Characterization of a mutation responsible for an alkali-sensitivemutant，18224，of alkaliphilic Bacillus sp.Strain C-125.Biosei.Biotechnol.Biochem.59，1364-1366)。
盡管已經(jīng)將嗜堿菌用于許多工業(yè)應(yīng)用，但沒有關(guān)于利用它們來中和紡織工業(yè)廢水的研究報(bào)道。美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?9/160422(1998)公開了在存在糖的條件下利用細(xì)菌混和物的生物中和方法。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度的細(xì)菌分離株庫(kù)特氏菌(MTCC5181)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是分離細(xì)菌-庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度，并且能夠中和紡織工業(yè)的高堿性廢水。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種來自紡織工業(yè)廢水的細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌(MTCC5181)，其保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。該細(xì)菌分離株能夠在2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)將廢水的pH從12.00降低到7.00單位。與通過化學(xué)手段進(jìn)行常規(guī)中和相比，通過該生物技術(shù)方法中和堿性紡織工業(yè)廢水是高度有效和經(jīng)濟(jì)的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)菌分離株能夠在10.00-12.00的pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)菌分離株能夠在短時(shí)間內(nèi)(約2小時(shí))將紡織工業(yè)廢水的pH(12.0-11.5)降低至中性pH(7.5-7.00)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，以1∶5-1∶10的比率，將細(xì)菌沉淀用于將紡織工業(yè)廢水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)菌分離株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)流出物處理工廠管道中在積累的污物，該管道已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間通過堿性廢水。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌是革蘭氏陽(yáng)性的，能動(dòng)的，過氧化氫酶陽(yáng)性的，和能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。本發(fā)明還提供制備用于中和紡織工業(yè)堿性廢水(pH-12.00-11.5)的細(xì)菌庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)的細(xì)菌分離株，其保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度，該方法包括a)通過以1∶1-1∶2的比率，100-120rpm和35-37℃下，將污物提取物加入在基本碳酸鹽培養(yǎng)基中72-96小時(shí)，富集被細(xì)菌污染的污物；b)通過使用所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基，在pH1.5-12.00和35-37℃下培養(yǎng)細(xì)菌8-10小時(shí)；c)在達(dá)到大量生長(zhǎng)(O.D.1.5-2.0)后，通過離心獲自步驟(b)的培養(yǎng)物來分離所述細(xì)菌，以獲得細(xì)菌細(xì)胞的沉淀；d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中；e)通過向廢水中加入從步驟(d)中獲得的細(xì)菌沉淀來中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH12.00-11.5)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被污染的污物獲自位于印度昌迪加爾紡織工業(yè)的流出物處理工廠的管道。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進(jìn)行來自所述位置的污物的富集，所述滅菌瓶中含有100-110ml污物提取物，50μl Candid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過在約4000rpm下離心滅菌的污物混和物約20分鐘來制備污物提取物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過以約1∶3的比率將干燥的污物溶解在蒸餾水中，并在約15psi下高壓滅菌約1小時(shí)來制備滅菌的污物混和物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，基本碳酸鹽培養(yǎng)基包含約1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積比的葡萄糖，細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸鈉。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的混和物用于捕獲所述位置的最大限度的細(xì)菌菌群。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述污物提取物和所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率是1∶1-1∶2。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在確定的條件如培養(yǎng)基，溫度，pH，碳源下來培養(yǎng)分離的細(xì)菌分離株。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于所有的細(xì)菌分離株(總共三株)，檢查它們?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)降低紡織廢水pH的中和能力。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的降低。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，選擇能夠在約2小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)降低堿性紡織廢水pH的細(xì)菌。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基，接著在37℃/120rpm下溫育8小時(shí)的確定的條件下培養(yǎng)選擇的細(xì)菌，用于中和堿性紡織工業(yè)廢水。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在達(dá)到大量(heavy)生長(zhǎng)O.D.(1.5)后，在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長(zhǎng)培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)菌沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過向200ml廢水中加入細(xì)菌沉淀來進(jìn)行高堿性紡織工業(yè)廢水的中和，當(dāng)通過pH計(jì)所檢測(cè)時(shí)，在2-1.5小時(shí)中觀察到將pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)菌庫(kù)特氏菌用作全細(xì)胞。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)，其保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。該細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)能夠中和紡織工業(yè)的高堿性廢水。
該細(xì)菌分離株能夠在pH為10-12.00的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
已經(jīng)觀察到該細(xì)菌分離株還能夠在短的時(shí)間內(nèi)(約2小時(shí))將紡織工業(yè)廢水的pH(12.0-11.5)降低到中性pH(7.5-7.00)。以1∶5-1∶10的比率，將該分離株以細(xì)菌沉淀的形式用于將紡織工業(yè)廢水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。
該細(xì)菌分離株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)的流出物處理工廠管道中積累的污物，該管道已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間通過堿性廢水。該細(xì)菌分離株是革蘭氏陽(yáng)性的，能動(dòng)的，過氧化氫酶陽(yáng)性的，能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。
制備細(xì)菌庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)的細(xì)菌分離株的方法包括以下步驟a)通過以1∶1-1∶2的比率，100-120rpm和35-37℃下，將污物提取物加入在基本碳酸鹽培養(yǎng)基中72-96小時(shí)，富集被細(xì)菌污染的污物；b)通過使用所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基，在pH1.5-12.00和35-37℃下培養(yǎng)細(xì)菌8-10小時(shí)；c)在達(dá)到大量生長(zhǎng)(O.D.1.5-2.0)后，通過離心獲自步驟(b)的培養(yǎng)物來分離所述細(xì)菌，以獲得細(xì)菌細(xì)胞的沉淀；d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中；e)通過向廢水中加入從步驟(d)中獲得的細(xì)菌沉淀來中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH12.00-11.5)。
被污染的污物獲自位于印度昌迪加爾紡織工業(yè)的流出物處理工廠的管道。通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進(jìn)行來自所述位置的污物的富集，所述滅菌瓶中含有100-110ml污物提取物，50μl Candid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
通過在約4000rpm下離心滅菌的污物混和物約20分鐘來制備污物提取物。通過以約1∶3的比率將干燥的污物溶解在蒸餾水中，并在約15psi下高壓滅菌約1小時(shí)來制備滅菌的污物混和物。
基本碳酸鹽培養(yǎng)基包含約1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積比的葡萄糖，細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸鈉。將污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的混和物用于捕獲所述位置的最大限度的細(xì)菌菌群。所述污物提取物和所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率是1∶1-1∶2。
在確定的條件下如培養(yǎng)基，溫度，pH，碳源等來培養(yǎng)分離的細(xì)菌分離株。對(duì)于所有的細(xì)菌分離株(總共三株)，檢查它們?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)降低紡織廢水pH的中和能力。通過pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的降低。基于它在約2小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)降低堿性紡織廢水pH的能力來選擇細(xì)菌。
在利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基，接著在37℃/120rpm下溫育8小時(shí)的確定的條件下培養(yǎng)選擇的細(xì)菌，用于中和堿性紡織工業(yè)廢水。在達(dá)到大量生長(zhǎng)O.D.(1.5)后在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長(zhǎng)培養(yǎng)物。將細(xì)菌沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中。
通過向200ml廢水中加入細(xì)菌沉淀來進(jìn)行高堿性紡織工業(yè)廢水的中和，如通過pH計(jì)所檢測(cè)，在2-1.5小時(shí)中觀察到將pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00。
如果需要，將細(xì)菌庫(kù)特氏菌用作全細(xì)胞。
將本發(fā)明關(guān)注的細(xì)菌菌株保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。
S.No.培養(yǎng)物 MTCC ID No.
1庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)上述細(xì)菌菌株顯示在確定的條件下，在1.5-2小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)能夠中和高堿性紡織工業(yè)廢水的顯著能力。本發(fā)明的細(xì)菌菌株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)流出物處理工廠管道中積累的污物。為了分離潛在的細(xì)菌分離株，100-110ml污物提取物；100-110ml基本碳酸鹽培養(yǎng)基和50μlCandid B(抗真菌)?；咎妓猁}培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨(dú)滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH值為10.5。將富集瓶在35-37℃、100-120rpm下放置約72-96小時(shí)。
為了制備污物提取物，取1kg污物，并在50℃干燥2小時(shí)。將400g干燥的污物溶解在960ml一次蒸餾的水中，并在15lbs下高壓滅菌1小時(shí)。高壓滅菌后，將樣品在5000rpm下離心10分鐘。收集上清液(提取物)，并存儲(chǔ)在無菌瓶中，用于制備富集瓶和進(jìn)一步使用。
將富集的污物樣品系列稀釋在0.85％鹽水中。將10μl來自每個(gè)個(gè)體稀釋物樣品平鋪到瓊脂培養(yǎng)板上，該培養(yǎng)板含有污物提取物和50％基本碳酸鹽培養(yǎng)基。基本碳酸鹽培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨(dú)滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH值為10.5。將如此獲得的平板倒置在37±2℃下溫育24-96小時(shí)。
在克隆形態(tài)學(xué)和顏色的基礎(chǔ)上，選擇總共3株細(xì)菌分離株，以檢測(cè)它們中和堿性廢水的能力。挑取單個(gè)分離的克隆，并在新鮮的平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復(fù)上述步驟，直至獲得純凈的克隆。
為了檢查三株分離細(xì)菌的中和能力，在玻璃瓶的三個(gè)位置取200ml高pH(12.0-11.5)的紡織工業(yè)廢水，獨(dú)自加入每種細(xì)菌生長(zhǎng)物。用pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的降低。
三株細(xì)菌中，發(fā)現(xiàn)僅1株分離株能夠在高pH(12.0-11.5)下生長(zhǎng)，并且在1.5-2小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)降低廢水的pH。將該細(xì)菌鑒定為庫(kù)特氏菌，其主要特征如下細(xì)菌-庫(kù)特氏菌在性質(zhì)上是需氧的，是革蘭氏陽(yáng)性的，在25-42℃溫度范圍內(nèi)顯示最佳生長(zhǎng)，能夠在高pH環(huán)境(pH12.00)中生長(zhǎng)，能夠水解淀粉，是能動(dòng)的，過氧化氫酶陽(yáng)性的合還原硝酸鹽。在中和實(shí)驗(yàn)中，紡織工業(yè)廢水取自地方紡織工業(yè)。將如上述篩選的細(xì)菌庫(kù)特氏菌接種在200-220ml基本碳酸鹽培養(yǎng)基中。在振蕩(100-120rpm)條件下，于35-37℃下溫育培養(yǎng)物8小時(shí)。觀察到大量細(xì)菌生長(zhǎng)(光密度(O.D＝1.5))后，在約1-4℃，5000-7,000rpm下離心培養(yǎng)物。按照沉淀的大小，將培養(yǎng)物沉淀溶解在約20ml磷酸鹽緩沖液中。將該沉淀添加到含有200ml紡織工業(yè)廢水(pH12.0-11.5))的燒瓶中。將該燒瓶放置在振蕩條件下(100-120rpm)。在1.5-2小時(shí)后觀察到pH的降低。在1.5-2小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)，該細(xì)菌庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)已經(jīng)能夠?qū)H從12-11.5降低到7.5-7。通過pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH。
本發(fā)明還提供了一種制備用于中和堿性廢水的細(xì)菌生長(zhǎng)物的方法a)利用污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基富集所述位置的污物，以分離具有中和能力的細(xì)菌；b)利用污物提取物和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的混和物從所述位置捕獲需要的潛在細(xì)菌，所述培養(yǎng)基包含約1％(w/v)葡萄糖，約0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，約0.5％酵母提取物，約0.13％K2HPO4·3H2O，和約0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(約10％)單獨(dú)滅菌，并添加以獲得1％濃度和最初pH值為10.5；c)在如培養(yǎng)基，溫度，pH，碳源等的確定條件下培養(yǎng)分離自具體位置的所述細(xì)菌；d)通過將分離的細(xì)菌分離株接種在200-220ml堿性紡織工業(yè)廢水中來檢查分離的細(xì)菌分離株的中和能力；e)通過pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的降低；f)選擇可以在短時(shí)間內(nèi)中和堿性廢水的細(xì)菌分離株；g)在確定的條件下培養(yǎng)所選擇的細(xì)菌，用于中和堿性紡織工業(yè)廢水。使用基本碳酸鹽培養(yǎng)基來培養(yǎng)培養(yǎng)物。將培養(yǎng)燒瓶在35-37℃、100-120rpm下溫育8小時(shí)，以便獲得大量生長(zhǎng)；h)在達(dá)到大量生長(zhǎng)O.D.(1.5)后，離心得到的培養(yǎng)物；
i)收集細(xì)菌沉淀并溶解在磷酸鹽緩沖液中；j)通過將細(xì)菌沉淀加入到200ml廢水中來中和高堿性紡織工業(yè)廢水。如通過pH計(jì)所檢查，在1.5-2小時(shí)觀察到pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00。
下述實(shí)施例是用于舉例說明，因此不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1在開發(fā)嗜堿性細(xì)菌的努力中，進(jìn)行戰(zhàn)略分離以從位于印度昌迪加爾德紡織工業(yè)流出物處理工廠管道中積累的污物捕獲潛在的細(xì)菌群，該管道已長(zhǎng)時(shí)間通過堿性廢水。從所述管道收集積累的污物以分離細(xì)菌。
為了分離潛在的細(xì)菌分離株，將5g來自所述位置的污物添加到500ml高壓滅菌瓶中，所述高壓滅菌瓶包含100ml污物提取物；100ml基本碳酸鹽培養(yǎng)基和50μl Candid B(抗真菌)?；咎妓猁}培養(yǎng)基包含1％(w/v)葡萄糖，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨(dú)滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH為10.5。將富集瓶在37℃，120rpm下放置96小時(shí)。為了制備污物提取物，取1kg污物，并在50℃干燥2小時(shí)。
將400g干燥的污物溶解在960ml一次蒸餾的水中，并在15lbs下高壓滅菌1小時(shí)。高壓滅菌后，將樣品在5000rpm下離心10分鐘。收集上清液(提取物)，并存儲(chǔ)在無菌瓶中，用于制備富集瓶和進(jìn)一步應(yīng)用。將富集的污物樣品系列稀釋在0.85％鹽水中。100μl來自每個(gè)個(gè)體稀釋物的樣品平鋪到瓊脂培養(yǎng)板上，該培養(yǎng)板含有污物提取物和50％基本碳酸鹽培養(yǎng)基。所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨(dú)滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH為10.5。將如此獲得到平板在37±2℃下倒置溫育24-96小時(shí)。
在菌落形態(tài)學(xué)和顏色的基礎(chǔ)上，選擇總共3株細(xì)菌分離株以檢測(cè)它們中和堿性廢水的能力。挑取單個(gè)分離的克隆，并在新鮮的平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復(fù)上述步驟，直至獲得純凈的克隆。
實(shí)施例2為了開發(fā)中和堿性紡織工業(yè)廢水的潛在細(xì)菌，從已長(zhǎng)時(shí)間通過紡織工業(yè)廢水的管道中分離總共三株細(xì)菌。選擇這些細(xì)菌分離株，以檢查它們中和堿性廢水的能力。挑取單個(gè)分離的克隆并在新鮮的瓊脂平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復(fù)上述步驟直至獲得純凈的克隆。
為了檢查三株分離細(xì)菌的中和能力，在500ml玻璃瓶的三個(gè)位置取200ml高pH(12.00)的紡織工業(yè)廢水，獨(dú)自加入每種細(xì)菌生長(zhǎng)物。用pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的降低(表1)。
表1通過分離的嗜堿性細(xì)菌引起的堿性廢水的pH減少
實(shí)施例3在菌落形態(tài)學(xué)和顏色的基礎(chǔ)上，選擇總共3株細(xì)菌分離株以檢測(cè)它們中和堿性廢水的能力。挑取單個(gè)分離的克隆，并在新鮮的平板上劃線，所述平板含有相同的培養(yǎng)基。重復(fù)上述步驟，直至獲得純凈的克隆。
三株細(xì)菌中，發(fā)現(xiàn)僅1株分離株(分離株2)-庫(kù)特氏菌能夠在高pH(12.00)下生長(zhǎng)，并且在2小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)降低廢水的pH(7.04)。將該細(xì)菌鑒定為庫(kù)特氏菌，其主要特征如下(a)在性質(zhì)上是需氧的(b)革蘭氏陽(yáng)性的(c)在25-42℃顯示適宜生長(zhǎng)
(d)能在高pH(pH12.00)環(huán)境中生(e)能夠水解淀粉(f)是能動(dòng)的(g)是過氧化氫酶陽(yáng)性的(h)還原硝酸鹽實(shí)施例4為了觀察所篩選的細(xì)菌庫(kù)特氏菌在合適培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，將來自庫(kù)特氏菌瓊脂平板的兩個(gè)接種環(huán)在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和基本碳酸鹽培養(yǎng)基的平板上劃線。基本碳酸鹽培養(yǎng)基含有1％(w/v)葡萄糖，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.13％K2HPO4·3H2O，和0.02％MgSO4·7H2O。將碳酸鈉(10％)單獨(dú)滅菌，并添加以獲得1％濃度和培養(yǎng)基的最初pH為10.5。將如此獲得到平板在37±2℃下倒置溫育24-96小時(shí)。
含有2％瓊脂的NB培養(yǎng)基具有約7的最初pH，而BCM培養(yǎng)基具有10.5的最初pH。為了增加培養(yǎng)基的pH，使用Tris-HCL和Na2CO3-NaHCO3緩沖液。
表2顯示庫(kù)特氏菌在NB和BCM培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)
+非常差生長(zhǎng)++較差生長(zhǎng)；+++良好生長(zhǎng)；++++非常良好地生長(zhǎng)。
觀察到高pH的BCM培養(yǎng)基是生長(zhǎng)庫(kù)特氏菌的合適培養(yǎng)基。
實(shí)施例5
還用凍干的庫(kù)特氏菌粉末中和堿性紡織廢水。將40ml培養(yǎng)物(O.D.＝1.5)的細(xì)菌沉淀凍干，并添加到500ml含有200ml堿性紡織廢水的燒瓶中。
將接種的燒瓶在37℃保持2小時(shí)。在2小時(shí)內(nèi)觀察到pH的降低(表3)。
將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一式兩份(組1和組2)表3通過庫(kù)特氏菌的凍干細(xì)菌粉末引起的堿性廢水pH降低
益處1.利用庫(kù)特氏菌中和堿性紡織廢水是經(jīng)濟(jì)和有效的方法。在常規(guī)的酸-中和方法中，利用酸的特性(tone)來進(jìn)行中和，而在所開發(fā)的生物方法中，極大地降低了成分。
2.通過生物手段中和堿性紡織廢水是相當(dāng)安全的方法，原因在于由于強(qiáng)酸對(duì)工人的健康以及工業(yè)方法有危險(xiǎn)作用，導(dǎo)致利用大量的酸中和廢水對(duì)于工業(yè)而言是不安全的。除此之外，利用大量的酸還增加了排出到主要河流中的工業(yè)廢水的體積。
權(quán)利要求
1.細(xì)菌分離株-庫(kù)特氏菌(Kurthia sp.)(MTCC 5181)，其保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度。
2.權(quán)利要求1的分離株，其中所述分離株能夠在pH為10.00-12.00的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
3.權(quán)利要求1的分離株，其中所述細(xì)菌分離株能夠在約2小時(shí)的短時(shí)間內(nèi)將紡織工業(yè)廢水的pH(12.0-11.5)降低至中性pH(7.5-7.00)。
4.權(quán)利要求1的分離株，其中當(dāng)以1∶5-1∶10的比率使用時(shí)，所述細(xì)菌分離株能夠?qū)⒓徔椆I(yè)廢水的高pH(12.0-11.5)中和至中性pH(7.5-7.0)。
5.權(quán)利要求1的分離株，其中所述細(xì)菌分離株分離自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)的流出物處理工廠的已通過堿性廢水的管道中所積累的污物。
6.權(quán)利要求1的分離株，其中所述細(xì)菌分離株庫(kù)特氏菌是革蘭氏陽(yáng)性的，能動(dòng)的，過氧化氫酶陽(yáng)性的，和能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。
7.制備細(xì)菌庫(kù)特氏菌(MTCC 5181)的細(xì)菌分離株的方法，所述分離株用于中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH-12.00-11.5)，并保藏在布達(dá)佩斯條約認(rèn)可的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)IMTECH，39A區(qū)，昌迪加爾，印度，所述方法包括(a)通過將污物提取物加入到基本碳酸鹽培養(yǎng)基富集被細(xì)菌污染的污物；(b)利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌；(c)分離獲自步驟(b)的培養(yǎng)物的細(xì)菌，以獲得細(xì)菌細(xì)胞的沉淀；(d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中。
8.權(quán)利要求7的方法，其中將步驟(a)在100-120rpm和35-37℃范圍的溫度下進(jìn)行72-96小時(shí)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述污物提取物對(duì)基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率是1∶1-1∶2。
10.權(quán)利要求7的方法，其中將細(xì)菌在1.5-12.00的pH，35-37℃的溫度下，在步驟(b)中培養(yǎng)8-10小時(shí)。
11.權(quán)利要求7的方法，其中在通過測(cè)定光密度，直至光密度達(dá)到1.5-2.0的范圍而確定的大量生長(zhǎng)后，通過離心在步驟(c)中分離步驟(b)中獲得的培養(yǎng)物。
12.權(quán)利要求7的方法，其中污染的污物獲自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)流出物處理工廠的管道。
13.權(quán)利要求7的方法，其中通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進(jìn)行污物的富集，所述高壓滅菌瓶中含有100-110ml的污物提取物，50μlCandid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
14.權(quán)利要求7的方法，其中通過在約4000rpm下離心無菌的污物混和物約20分鐘來制備提取物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中通過以約1∶3的比率在蒸餾水中混合干燥的污物，和在約15psi下高壓滅菌該混和物約1小時(shí)來制備無菌污物混和物。
16.權(quán)利要求7的方法，其中所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基含有比率約為1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積的葡萄糖，細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O和碳酸鈉。
17.權(quán)利要求7的方法，其中在培養(yǎng)基、溫度、pH和碳源的確定條件下培養(yǎng)所述分離的細(xì)菌分離株。
18.權(quán)利要求7的方法，其中在達(dá)到通過光密度約為1.5確定的大量生長(zhǎng)后，在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長(zhǎng)的培養(yǎng)物。
19.權(quán)利要求7的方法，其中將細(xì)菌沉淀溶解在pH約為6.8的磷酸鹽緩沖液中。
20.中和紡織工業(yè)堿性廢水的方法，其包括向其中加入細(xì)菌庫(kù)特氏菌細(xì)菌分離株(MTCC 5181)的細(xì)胞沉淀，以將堿性廢水的pH從pH12.00-11.5降低到范圍為7.5-7.00的中性pH。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法包含(a)通過將污物提取物加入到基本碳酸鹽培養(yǎng)基來富集被細(xì)菌污染的污物；(b)利用基本碳酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌；(c)從獲自步驟(b)的培養(yǎng)物中分離細(xì)菌，以獲得細(xì)菌細(xì)胞的沉淀；(d)將獲自步驟(c)的沉淀溶解在磷酸鹽緩沖液中；(e)通過向廢水中加入獲自步驟(d)的細(xì)菌沉淀來中和紡織工業(yè)的堿性廢水(pH-12.00-11.5)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中將步驟(a)在100-120rpm和35-37℃范圍的溫度下進(jìn)行72-96小時(shí)。
23.權(quán)利要求21的方法，其中污物提取物與基本碳酸鹽培養(yǎng)基的比率在1∶1-1∶2的范圍內(nèi)。
24.權(quán)利要求21的方法，其中在1.5-12.00的pH和35-37℃的溫度下，在步驟(b)中培養(yǎng)細(xì)菌8-10小時(shí)。
25.權(quán)利要求21的方法，其中在通過測(cè)量光密度直至光密度達(dá)到1.5-2.0而確定大量生長(zhǎng)后，通過離心在步驟(c)中分離步驟(b)中獲得的培養(yǎng)物。
26.權(quán)利要求21的方法，其中被污染的污物獲自位于印度昌迪加爾的紡織工業(yè)的流出物處理工廠的管道。
27.權(quán)利要求21的方法，其中通過取5-7g高壓滅菌瓶中的新鮮污物進(jìn)行污物的富集，所述高壓滅菌瓶中含有100-110ml的污物提取物，50μlCandid B(抗真菌)和基本碳酸鹽培養(yǎng)基。
28.權(quán)利要求21的方法，其中通過在約4000rpm下離心無菌的污物混和物約20分鐘來制備污物提取物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中通過以約1∶3的比率將干燥的污物溶解在蒸餾水中和將混和物在約15psi下高壓滅菌約1小時(shí)來制備無菌污物混和物。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述基本碳酸鹽培養(yǎng)基包含比率約為1∶.5∶.5∶.13∶.02∶10重量/體積的葡萄糖，細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O和碳酸鈉。
31.權(quán)利要求21的方法，其中在培養(yǎng)基、溫度、pH和碳源的確定條件下培養(yǎng)所述分離的細(xì)菌分離株。
32.權(quán)利要求21的方法，其中在通過約1.5的光密度確定的大量生長(zhǎng)后，在5000-7000rpm，1-4℃下離心生長(zhǎng)培養(yǎng)物。
33.權(quán)利要求21的方法，其中將細(xì)菌沉淀溶解在pH約為6.8的磷酸緩沖液中。
34.權(quán)利要求21的方法，其中在確定的時(shí)間中檢查在步驟(d)的結(jié)尾獲得的所有細(xì)菌分離株降低紡織廢水的pH的中和能力。
35.權(quán)利要求21的方法，其中通過pH計(jì)監(jiān)測(cè)pH的降低。
36.權(quán)利要求21的方法，其中通過利用細(xì)菌培養(yǎng)用碳酸鹽培養(yǎng)基，接著在37℃和120rpm下溫育8小時(shí)，培養(yǎng)所選擇的細(xì)菌。
37.權(quán)利要求21的方法，其中通過將細(xì)菌沉淀加入到200ml廢水中以在2小時(shí)-1.5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)用pH計(jì)測(cè)量將pH從12.0-11.5降低到7.5-7.00來實(shí)現(xiàn)紡織工業(yè)的高堿性廢水的中和。
38.權(quán)利要求21的方法，其中將細(xì)菌庫(kù)特氏菌用作全細(xì)胞。
39.權(quán)利要求21的方法，其中相對(duì)于廢水，以1∶5-1∶10的比率使用細(xì)菌沉淀。
40.權(quán)利要求21的方法，其中所述細(xì)菌分離株庫(kù)特氏菌是革蘭氏陽(yáng)性的，能動(dòng)的，過氧化氫酶陽(yáng)性的，能夠還原硝酸鹽和水解淀粉。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的通過在印度分離的細(xì)菌菌株來中和紡織工業(yè)廢水的方法。該分離的細(xì)菌菌株能夠在2小時(shí)內(nèi)將廢水的pH從12.00降低到7.00單位。與通過化學(xué)手段進(jìn)行的常規(guī)中和相比，通過這種生物技術(shù)方法進(jìn)行的堿性紡織工業(yè)廢水的中和是高度有效和經(jīng)濟(jì)的。這種生物技術(shù)方法在產(chǎn)生堿性廢水的紡織工業(yè)中可發(fā)現(xiàn)廣泛的商業(yè)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C02F103/30GK101090872SQ200480044739
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者麗塔·庫(kù)馬爾, 阿尼爾·庫(kù)馬爾 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)