專利名稱：利用泡囊假單胞菌促進(jìn)植物修復(fù)土壤鎳污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)促進(jìn)植物修復(fù)土壤鎳污染的方法。
背景技術(shù)：
上壤重金屬污染來源面廣、形式多種多樣。如工業(yè)生產(chǎn)過程中排放的廢水、廢氣和廢渣，也有農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大量施用的化肥、農(nóng)藥和除草劑等。當(dāng)土壤接納這些污染物質(zhì)的量超過自身的凈化能力時(shí)，則導(dǎo)致土壤污染。據(jù)資料，全球每年釋放到環(huán)境中的有毒重金屬高達(dá)數(shù)百萬噸，其中鎳為38.1萬噸。至1998年我國(guó)農(nóng)田受重金屬污染的面積達(dá)到2000萬公頃，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境安全和人類健康造成了不可忽視的影響。
當(dāng)前，可供治理土壤重金屬污染的方法主要有理化修復(fù)法和生物修復(fù)法。
理化修復(fù)法有客土(換土)法、沉淀法、淋洗法、電化法、磁化法。這些物理或化學(xué)方法各有其優(yōu)點(diǎn)，但一般都存在花費(fèi)高、工程量較大、易造成二次污染等問題。
以植物修復(fù)技術(shù)為核心的生態(tài)恢復(fù)技術(shù)是以植物耐受和富集某種或某些有機(jī)或無機(jī)污染物為基礎(chǔ)，利用植物與微生物的共生體系，清除環(huán)境中污染物的一種環(huán)境污染治理技術(shù)。植物修復(fù)技術(shù)是通過植物的吸收、揮發(fā)、根濾、穩(wěn)定等作用，凈化和固定環(huán)境中的污染物，達(dá)到凈化環(huán)境的目的。植物修復(fù)是一種新興的重金屬污染原位綠色修復(fù)技術(shù)，作為其核心技術(shù)之一的植物提取技術(shù)，已發(fā)展成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用熱點(diǎn)，并引起政府、學(xué)術(shù)界和企業(yè)界的高度重視。
利用超積累植物進(jìn)行重金屬污染土壤的治理工作雖然取得了一些成功的案例，但由于這種植物是在長(zhǎng)期受重金屬脅迫的土壤條件、氣候條件下產(chǎn)生的突變體，絕大多數(shù)生長(zhǎng)慢、生物量小，這在一定程度上限制了土壤凈化的效率。這些因素使得超積累植物要大規(guī)模商業(yè)化利用還有一定的差距。由于國(guó)內(nèi)對(duì)這一技術(shù)的研究起步較晚，在種質(zhì)資源、修復(fù)技術(shù)的研究、開發(fā)和應(yīng)用等方面，都亟需提高。
已知的鎳超積累植物有300多種，主要集中在北美洲、大洋洲和歐洲等國(guó)家。庭薺屬的Alyssumcorsicum和Alyssum murale已在土壤商業(yè)修復(fù)中使用[Li YM，et al.PLANT AND SOIL.2003，249(1)107-115]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)促進(jìn)植物修復(fù)土壤鎳污染的方法。
本發(fā)明通過將泡囊假單胞菌接種到修復(fù)土壤的植物的根部，建立根際細(xì)菌與植物的共生關(guān)系，利用泡囊假單胞菌具有分泌鐵載體和降低植物體內(nèi)乙烯水平以及能利用1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸作為唯一氮源的特點(diǎn)，在不影響植物地上部分的重金屬鎳含量前提下，提高植物生長(zhǎng)速度和增大植物生物量，進(jìn)而提高了植物對(duì)重金屬鎳的富集效果。土壤經(jīng)過這一菌株處理后，該細(xì)菌可以在鎳污染土壤中定殖，可持續(xù)促進(jìn)植物對(duì)重金屬鎳的富集，直到土壤中的鎳含量達(dá)環(huán)境安全標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明方法的具體步驟包括(1)將泡囊假單胞菌菌種進(jìn)行擴(kuò)種培養(yǎng)，制成菌液，菌液濃度為OD600≥0.8(通常為OD600＝0.8～1.5)；(2)控制土壤pH值于5.5～7之間；(3)以鎳超積累植物作為土壤修復(fù)植物；按以下方法之一用菌液處理(a).采用種子直接播種時(shí)，種子表面經(jīng)70％乙醇消毒1～3min，1％次氯酸鈉浸泡10～15min，用無菌水將種子沖洗干凈，再經(jīng)菌液浸泡1～1.5h，然后播種(最好采用穴播，覆蓋一薄層土)；(b).采用幼苗移栽種植時(shí)，先將菌液直接施用到土壤穴中，用菌液量為10mL～20mL/穴，再將幼苗根部蘸上菌液后植入施用過菌液的土壤穴中；(c).按(a)方法處理種子并播種，長(zhǎng)至幼苗時(shí)按(b)方法處理并移栽幼苗；(4)按常規(guī)管理，定期收割植物地上部，一年兩次，直到土壤鎳達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn)。
收割的植物地上部分可進(jìn)行統(tǒng)一處理，如在垃圾填埋區(qū)安全填埋或焚燒。
本發(fā)明方法所用的泡囊假單胞菌優(yōu)選為泡囊假單胞菌GIM 1.0006(購(gòu)自廣東省菌種保藏選育實(shí)驗(yàn)室)，該菌種由廣東省菌種保藏選育實(shí)驗(yàn)室保藏并對(duì)公眾公開發(fā)放，保藏編號(hào)為GIM 1.0006。
上述本發(fā)明的方法所用的鎳超積累植物優(yōu)選為庭薺屬Alyssum corsicum或庭薺屬Alyssum murale。
按照上述本發(fā)明的方法，其中用菌液浸泡種子時(shí)，種子與菌液的用量比例通常為種子∶菌液＝1∶(2～3)體積比。
本發(fā)明的方法所用的泡囊假單胞菌還可以通過如下方法得到采用植物根際土壤制備土壤懸液，土壤懸液接種到PAF培養(yǎng)基(蛋白胨10g、酪氨酸10g、MgSO41.5g、H2PO41.5g、甘油10mL，H2O 1000mL，pH7.0)后，在100r/min 25℃培養(yǎng)5d后，將0.5mL菌液涂布于固體平面培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)，待平面培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落后，將菌落分別接種到新的PAF固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次的分離后，得到純化的泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)菌株，再轉(zhuǎn)移到PAF固體斜面培養(yǎng)基上保存。
本發(fā)明所用的泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)菌株的分類學(xué)特征如下(1)為革蘭氏陰性好氧桿菌，分類上屬于假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomanas)泡囊假單胞菌。
(2)桿菌，0.5×1.0～4.0微米，鞭毛單極生，菌落的色素為黃色，氧化酶反應(yīng)為弱陽性。
(3)能分泌鐵載體，銨鹽能作為主要氮源，而硝酸鹽不能成為主要氮源。
(4)專性好氧，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，能在37℃生長(zhǎng)，41℃不生長(zhǎng)，4℃也不能生長(zhǎng)。
本發(fā)明方法具有以下突出效果1.本發(fā)明所選用的泡囊假單胞菌，通過根際細(xì)菌與植物的共生關(guān)系，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物生物量，從而提高植物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)效果，潛在經(jīng)濟(jì)效益可觀。
2.本發(fā)明所選用的泡囊假單胞菌，為本土的微生物菌種資源，容易在土壤中繁殖和定居，對(duì)植物修復(fù)有持續(xù)的促進(jìn)作用，也可提高植物抗病蟲害的能力。
3.本發(fā)明所用菌種提高了目前綠色原位修復(fù)效果，所收獲的植物地上部分進(jìn)行集中安全填埋或焚燒，不會(huì)造成二次污染，同時(shí)修復(fù)進(jìn)程不會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，并對(duì)土壤因重金屬污染而引起的土壤退化和生產(chǎn)力下降有改善作用。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例土壤修復(fù)(1)種苗準(zhǔn)備供試植物為鎳超積累植物——庭薺屬Alyssum corsicum，分菌液處理和對(duì)照2組。種子用70％乙醇消毒1min，1％次氯酸鈉浸泡10min，后用無菌水沖洗干凈(一般沖洗3次)；再用5mL菌液(OD6000.8～1.5)浸泡1h。對(duì)照用種子直接用去離子水浸泡。隨后轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)土中發(fā)芽和育苗，等幼苗長(zhǎng)到4-5片葉后移栽。
(2)試驗(yàn)土壤潴育型水稻土、云南元江土和云南墨江土；土壤重金屬鎳含量水稻土＞400mg/kg，云南元江土＞3500mg/kg，云南墨江土＞5400mg/kg。
(3)移栽和管理植物移栽前，每穴施菌液(OD6000.8～1.5)20mL；移苗時(shí)，將植株根系蘸上菌液后才植入施用過菌液的土壤穴中。對(duì)照土壤中不施菌液，植株直接移植到土壤中。植株移栽后的生長(zhǎng)期為70d，按常規(guī)管理。
(4)收獲后測(cè)定，水稻土中加菌處理后植株地上部分生物量為558mg株-1，較對(duì)照高29％；云南元江土中，地上部分的生物量較對(duì)照高309％；云南墨江土中，地上部分的生物量較對(duì)照高43％。
(5)收獲后測(cè)定，加菌液處理后，地上部分鎳含量分別為水稻土＞14000mg/kg，云南元江土＞1400mg/kg，云南墨江土＞1800mg/kg。
(6)修復(fù)效果比較水稻土加菌處理后地上部富集鎳為7.831mg株-1，較對(duì)照5.092mg株-1增加了54％；元江土加菌處理后為0.065mg株-1，較對(duì)照0.016mg株-1增加了306％，墨江土加菌處理后為0.037mg株-1，較對(duì)照0.028mg株-1增加了32％。
持續(xù)收割植物地上部，土壤中的鎳含量不斷減少，直到污染土壤鎳含量減少到正常土壤水平，土壤鎳污染消除。
權(quán)利要求
1.一種利用泡囊假單胞菌促進(jìn)植物修復(fù)土壤鎳污染的方法，具體步驟包括(1)將泡囊假單胞菌菌種進(jìn)行擴(kuò)種培養(yǎng)，制成菌液，菌液濃度為OD600≥0.8；(2)控制土壤pH值于5.5～7之間；(3)以鎳超積累植物作為土壤修復(fù)植物；按以下方法之一用菌液處理(a).采用種子直接播種時(shí)，種子表面經(jīng)70％乙醇消毒1～3min，1％次氯酸鈉浸泡10～15min，用無菌水將種子沖洗干凈，再經(jīng)菌液浸泡1～1.5h，然后播種；(b).采用幼苗移栽種植時(shí)，先將菌液直接施用到土壤穴中，用菌液量為10mL～20mL/穴，再將幼苗根部蘸上菌液后植入施用過菌液的土壤穴中；(c).按(a)方法處理種子并播種，長(zhǎng)至幼苗時(shí)按(b)方法處理并移栽幼苗；(4)按常規(guī)管理，定期收割植物地上部，一年兩次，直到土壤鎳達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(1)所用的泡囊假單胞菌為泡囊假單胞菌GIM 1.0006菌株。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟(3)所用的鎳超積累植物為庭薺屬Alyssum corsicum或庭薺屬Alyssum murale。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是步驟(3)方法(a)中用菌液浸泡種子時(shí)，種子∶菌液＝1∶(2～3)體積比。
5.按照權(quán)利要求1，2或3所述的方法，其特征是步驟(1)中的菌液濃度為OD600＝0.8～1.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用泡囊假單胞菌(Pseudomanasvesicularis)促進(jìn)植物修復(fù)土壤鎳污染的方法。本方法通過將泡囊假單胞菌接種到修復(fù)土壤的植物的根部，建立根際細(xì)菌與植物的共生關(guān)系，利用泡囊假單胞菌具有分泌鐵載體和降低植物體內(nèi)乙烯水平以及能利用1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸作為唯一氮源的特點(diǎn)，在不影響植物地上部分的重金屬鎳含量前提下，提高植物生長(zhǎng)速度和增大植物生物量，進(jìn)而提高了植物對(duì)重金屬鎳的富集效果。土壤經(jīng)過這一菌株處理后，該細(xì)菌可以在鎳污染土壤中定殖，可持續(xù)促進(jìn)植物對(duì)重金屬鎳的富集，直到土壤中的鎳含量達(dá)環(huán)境安全標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)B09C1/10GK1695836SQ200510034858
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日
發(fā)明者仇榮亮, 蔡信德 申請(qǐng)人:中山大學(xué)