專利名稱：凝結(jié)芽孢桿菌菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌菌株(Bacillus coagulans)及其用途。
背景技術(shù)：
改革開放以來，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖品種日益增多，產(chǎn)量也迅速增加，我國(guó)已經(jīng)成為世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)。目前開發(fā)利用的水產(chǎn)養(yǎng)殖面積近700萬hm2，2003年全國(guó)實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量3029萬噸，占水產(chǎn)品總量的64％，是世界上惟一養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國(guó)家，2004年淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量和海水養(yǎng)殖產(chǎn)量又分別比2003年增長(zhǎng)了4.8％和3.7％。但是隨著高密度人工養(yǎng)殖快速發(fā)展，帶來了排泄物以及殘存餌料在水體中過度沉積，造成水體自身污染，水質(zhì)不斷惡化，直接或間接導(dǎo)致了水體的富營(yíng)養(yǎng)化、水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的頻繁發(fā)生以及水產(chǎn)品失去固有的鮮味等，這給全國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。與此同時(shí)，未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水的任意排放，不僅使天然水域受到污染，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境進(jìn)一步惡化，而且還威脅到人類自身的生存。
作為水生動(dòng)物賴以生存的基本環(huán)境條件，水體水質(zhì)的好壞直接影響到它們的生長(zhǎng)狀況和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益?！梆B(yǎng)魚就是養(yǎng)水”，要實(shí)施水生動(dòng)物的綠色高效和可持續(xù)養(yǎng)殖，其不可缺少的條件是具有有益于它們健康生長(zhǎng)的水體。眾多學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到水生動(dòng)物疾病的暴發(fā)也同養(yǎng)殖水體環(huán)境密切相關(guān)，如不改善水質(zhì)，水生動(dòng)物健康就得不到保證，水體生態(tài)就會(huì)被破壞，病害會(huì)越來越多，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。如在蝦類養(yǎng)殖業(yè)中，由于水體污染惡化而直接或間接引起的疾病已成為限制水產(chǎn)產(chǎn)量的主要因素。1993年，我國(guó)半密集型對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量大幅度滑坡(從1992年的22萬噸下降到1993年的5萬噸，降低約70％)，其原因就主要是水質(zhì)惡化。同時(shí)，人類的健康也會(huì)因食用不安全的水產(chǎn)品而受到威脅。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的凈化已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展之關(guān)鍵，如何解決這一難題成為關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的大事。
目前，國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化的方法一般采用物理法、化學(xué)法或者生物法。物理法主要采用吸附、沉淀、過濾等形式，利用物理作用來分離水中的懸浮物或采取物理手段來改善水中溶解氧或殺滅致病微生物。但物理處理存在凈化不徹底、重復(fù)利用率差、投入成本大等缺點(diǎn)。化學(xué)法多采用藥物如抗生素、高錳酸鉀、重金屬類等進(jìn)行消毒的形式?；瘜W(xué)法雖然可以在短時(shí)間內(nèi)起到較為明顯的效果，但是也存在凈化不徹底的問題，并且在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也存在著抗生素過量使用問題。國(guó)內(nèi)外研究均表明，長(zhǎng)期使用抗生素和其它化學(xué)藥物會(huì)導(dǎo)致藥物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)富聚。如2001年11月，香港從大陸進(jìn)口的大閘蟹被檢查含有氯霉素、土霉素等抗生素，從而引起人們對(duì)水產(chǎn)品食用安全性的極大關(guān)注。
近年來，國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)普遍采用生物法來凈化養(yǎng)殖水質(zhì)，其中以利用有益菌制備的微生態(tài)制劑來處理水體為主，取得了顯著的成績(jī)。在歐美、日本以及印度尼西亞、泰國(guó)等國(guó)家的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，微生態(tài)制劑得到較為廣泛的應(yīng)用。但是，目前所用微生態(tài)制劑存在有益菌株種類偏少，特別是能夠產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株種類偏少、有效活菌數(shù)目低、不耐高溫、耐鹽范圍較窄等缺陷，不能完全滿足生產(chǎn)實(shí)踐中的需要，制約了微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)凈化上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、具有凈化水質(zhì)作用的凝結(jié)芽孢桿菌菌株。
本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的提供一種凝結(jié)芽孢桿菌菌株，該菌株的保藏名稱為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)HN-0301，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號(hào)CCTCC M206012。
本發(fā)明的凝結(jié)芽孢桿菌菌株HN-0301，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落直徑為2.0～2.5mm，平臺(tái)狀，邊緣整齊，不透明，有光澤，無色素，質(zhì)地較軟；顯微鏡下該菌株細(xì)胞呈直桿狀，細(xì)胞大小在0.5×1.0μm～1.5×4.0μm，具有圓端，芽孢橢圓端生；在液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁并伴有微量沉淀，輕輕搖動(dòng)沉淀即散開。該菌株適宜的生長(zhǎng)溫度為30℃～45℃，最適初始pH值為6.0～7.0。
本發(fā)明還提供了上述凝結(jié)芽孢桿菌菌株HN-0301的用途用于凈化水質(zhì)。具體為將該菌株制備成微生態(tài)制劑后用于凈化水質(zhì)。
本發(fā)明的凝結(jié)芽孢桿菌菌株HN-0301，代謝可產(chǎn)生有機(jī)酸，其中主要為乳酸和醋酸以及少量的丁二酸和丙酸，乳酸產(chǎn)量達(dá)到7.65±0.14g/L。
該菌株可以在以麩皮為主要原料的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，發(fā)酵后菌株數(shù)量可高達(dá)1×1011cfu/g以上。將本發(fā)明的凝結(jié)芽孢桿菌菌株HN-0301，制成微生態(tài)制劑的方法如下1、液體發(fā)酵方法為碳源為麩皮，氮源為蛋白胨和酵母膏；發(fā)酵20～28hr，菌種量達(dá)到1×1010cfu/ml以上。
2、固體發(fā)酵方法為依次進(jìn)行以下步驟a)一級(jí)種子將原始菌種接種至試管營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，30～35℃過夜培養(yǎng)20～28hr；b)二級(jí)種子將一級(jí)種子接種至試管營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，30～35℃過夜培養(yǎng)20～28hr；c)三級(jí)種子將二級(jí)種子接種至50～150ml三角瓶含5～20％麩皮浸出液培養(yǎng)基，30～35℃過夜培養(yǎng)20～28hr；d)培養(yǎng)基配制麩皮和大豆粉混合原料經(jīng)粉碎后加入等比例水，0.11Mpa滅菌30～50min，冷卻；e)發(fā)酵培養(yǎng)基按1～10％的重量比接入三級(jí)種子，培養(yǎng)基含水量控制在50～55％，發(fā)酵室內(nèi)相對(duì)濕度保持在85％以上，pH范圍為6.0～7.0，溫度維持在30～35℃，通風(fēng)發(fā)酵24～48hr，菌種量達(dá)到1×1011cfu/g以上；將上述培養(yǎng)物在40～45℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包裝即成固態(tài)的微生態(tài)制劑。
本發(fā)明凝結(jié)芽孢桿菌菌株，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)速度快，能在廉價(jià)的原料上生長(zhǎng)；2)能產(chǎn)生以乳酸為主的有機(jī)酸，降低消化道pH值，使腸內(nèi)處于酸性環(huán)境，抑制病原菌；3)培養(yǎng)發(fā)酵后的活菌菌株數(shù)目高；4)該菌不產(chǎn)生有害物質(zhì)，以它制備的微生態(tài)制劑是綠色的水產(chǎn)養(yǎng)殖用水質(zhì)凈化劑，可以有效改善養(yǎng)殖水質(zhì)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、菌種篩選和分離在海寧某高產(chǎn)南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei；Boone，1931)池塘采樣。將樣品制成懸浮液，經(jīng)富集培養(yǎng)24小時(shí)后(30℃)，置于80℃水浴鍋中加熱10～20分鐘，殺死不形成芽孢的菌體。取出靜置10分鐘，劃線法進(jìn)行分離純化，利用芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基，根據(jù)菌落大小選取生長(zhǎng)良好的菌落反復(fù)接種篩選，直至得到均勻的單個(gè)菌落，命名為HN-0301，然后在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行純培養(yǎng)。
實(shí)施例2、菌種鑒定(1)形態(tài)特征在營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁并伴有微量沉淀，輕輕搖動(dòng)沉淀即散開。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落HN-0301直徑為2.0～2.5mm，平臺(tái)狀，邊緣整齊，不透明，有光澤，無色素，質(zhì)地較軟。顯微鏡下菌株細(xì)胞呈直桿狀，細(xì)胞大小在0.5～1.0μm×1.5～4.0μm，具有圓端，芽孢橢圓端生。
(2)生化特性菌株HN-0301革蘭氏染色陽性，接觸酶試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)陽性，明膠液化、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陰性。能夠分解淀粉、蔗糖、阿拉伯糖、木糖以及乳糖、麥芽糖等多種糖類，分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。反硝化試驗(yàn)為陽性，這說明該菌株可以降解池塘中的含氮化合物。
(3)16S rRNA序列分析對(duì)分離篩選到的菌株HN-0301進(jìn)行進(jìn)一步的16S rRNA序列分析與比對(duì)。細(xì)菌鑒定通用正向引物P1和通用反向引物P6分別相應(yīng)于E.coli的16S rRNA的8～17nt和1479～1506nt。引物序列如下上游引物(P1)5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′和下游引物(P6)5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′，引物由上海生工合成。以篩選得到的菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。目的片斷按照常規(guī)方法(Sambrook，et al.，2001)進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與GenBank中所登錄的16S rRNA序列(登錄號(hào)AB116143，AB116136，AB116142，AF466695等)進(jìn)行比對(duì)分析，基因同源性達(dá)到99％以上。根據(jù)《Bergey′sMannual of Determinative Bacteriology》(Holt，J.G.，Gibbons，N.E.，1994)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠和蔡妙英等，2001)，通過性態(tài)特征、生化特性和16S rRNA序列分析，確定菌株HN-0301為凝結(jié)芽孢桿菌。將該菌株進(jìn)行保藏，保藏名稱為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)HN-0301，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號(hào)CCTCCM206012。
(4)培養(yǎng)特征菌株HN-0301適宜的生長(zhǎng)溫度為30℃～45℃，最適初始pH值為6.0～7.0。此外，HN-0301對(duì)鹽的濃度同樣具有廣泛的適應(yīng)性，鹽度在0.0～3.5％的范圍內(nèi)均可以較好地生長(zhǎng)，滿足了淡水和海水養(yǎng)殖的需要。該菌株可以在以麩皮為主要原料的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，發(fā)酵后菌株數(shù)量可高達(dá)1×1011cfu/g以上。
實(shí)施例3、代謝產(chǎn)物分析菌株HN-0301發(fā)酵液代謝產(chǎn)物有機(jī)酸組分分析參照沈萍等(2004)，菌株在30℃、250rpm條件下，培養(yǎng)24h后，進(jìn)行樣品制備。批處理萃取樣品有機(jī)酸后加入一定量0.1mol/LNaOH從乙醚萃取液中萃取分離有機(jī)酸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醚，調(diào)節(jié)pH值6.5，用氣相色譜測(cè)定(HP6890GC，USA)。代謝產(chǎn)物有機(jī)酸主要為乳酸和醋酸以及少量的丁二酸和丙酸，其中HN-0301乳酸產(chǎn)量達(dá)到7.65±0.14g/L，沒有檢測(cè)出丁酸和蘋果酸，具體含量詳見下表1。
表1 菌株HN-0301發(fā)酵液代謝產(chǎn)物有機(jī)酸組分分析

注括號(hào)中的數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)差(n＝3)實(shí)施例4、制作微生態(tài)制劑(本實(shí)施例中所有的“％”均為重量比。)方法1、液體發(fā)酵法斜面培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和10％麩皮浸出液，2％瓊脂，自然pH，121℃高壓滅菌30min。
營(yíng)養(yǎng)鹽溶液組成(％)KH2PO4，0.05；MgSO4.7H2O，0.05；NaCl，0.10，其余為水。
培養(yǎng)基在營(yíng)養(yǎng)鹽溶液中加入5％麩皮浸出液、0.5％酵母膏，調(diào)pH7.0。
培養(yǎng)條件250ml三角瓶裝入培養(yǎng)基100ml，用菌株HN-0301的孢子懸液接種1.0ml，在30℃下，250rpm振蕩培養(yǎng)24h，使菌種數(shù)量達(dá)到1×1010cfu/ml以上。
方法2、固體發(fā)酵法a)一級(jí)種子(試管斜面種子)將原菌種接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24hr；b)二級(jí)種子(試管液體種子)將一級(jí)種子接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24hr；c)三級(jí)種子(三角瓶液體種子)將二級(jí)種子接種至5％麩皮浸出液培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24hr；d)培養(yǎng)基配制原料(麩皮∶大豆粉＝4∶1)經(jīng)粉碎后加入等重量比例水，0.11Mpa滅菌50min，冷卻至30℃；e)發(fā)酵在培養(yǎng)基中按5％的比例接入三級(jí)種子，30℃通風(fēng)發(fā)酵36hr，使菌種數(shù)量達(dá)到1×1011cfu/g以上。
實(shí)施例5、應(yīng)用在12個(gè)1m×0.8m×0.6m的玻璃水族箱中分別放入從同一精養(yǎng)蝦塘取的水，其中氨氮含量為1.25mg/L，亞硝酸鹽氮含量為0.64mg/L，硫化氫含量為5.83μg/L，化學(xué)需氧量COD為14.26，可溶性總磷含量為2.05mg/L。玻璃水族箱分為對(duì)照組和試驗(yàn)組2組，每組6個(gè)。按終濃度為105cfu/ml的量將凝結(jié)芽孢桿菌HN-0301加入試驗(yàn)組的每一個(gè)水族箱，3天后分別檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組的水質(zhì)指標(biāo)變化。水質(zhì)各指標(biāo)變化平均值如下試驗(yàn)組，氨氮含量為0.42mg/L，亞硝酸鹽氮含量為0.11mg/L，硫化氫含量為1.58μg/L，化學(xué)需氧量COD為6.17，可溶性總磷含量為0.98mg/L；對(duì)照組，氨氮含量為1.32mg/L，亞硝酸鹽氮含量為0.59mg/L，硫化氫含量為5.75μg/L，化學(xué)需氧量COD為15.03，可溶性總磷含量為1.97mg/L。因此凝結(jié)芽孢桿菌HN-0301有明顯降低水中污染物質(zhì)含量的效果，改善了養(yǎng)殖水質(zhì)，適合于作為水質(zhì)凈化劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上應(yīng)用。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種凝結(jié)芽孢桿菌菌株，其特征在于，該菌株的保藏名稱為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)HN-0301，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號(hào)CCTCC M206012。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌菌株，其特征在于該菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上菌落直徑為2.0～2.5mm，平臺(tái)狀，邊緣整齊，不透明，有光澤，無色素，質(zhì)地較軟；顯微鏡下該菌株細(xì)胞呈直桿狀，細(xì)胞大小在0.5×1.0μm～1.5×4.0μm，具有圓端，芽孢橢圓端生；在液體培養(yǎng)基中呈均勻混濁并伴有微量沉淀，輕輕搖動(dòng)沉淀即散開。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌菌株，其特征在于該菌株適宜的生長(zhǎng)溫度為30℃～45℃，最適初始pH值為6.0～7.0。
4.如權(quán)利要求1～3所述的凝結(jié)芽孢桿菌菌株的用途用于凈化水質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的凝結(jié)芽孢桿菌菌株的用途將該菌株制備成微生態(tài)制劑后用于凈化水質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凝結(jié)芽孢桿菌菌株，該菌株的保藏名稱為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)HN－0301，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年1月16日，保藏號(hào)CCTCC M206012。該菌株能用于凈化水質(zhì)。
文檔編號(hào)C02F3/34GK1831113SQ20061004982
公開日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2006年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月14日
發(fā)明者李衛(wèi)芬, 王彥波, 周緒霞, 姚江濤 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)