專利名稱：具有好氧反硝化性能的戴爾福特菌及其處理廢水的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用戴爾福特(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797菌株在好氧條件下進行生物脫氮處理廢水的方法。該菌株對溶解氧的耐受程度強，在10～98％飽和溶解氧條件下，能利用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體。污水中的硝酸鹽和亞硝酸鹽可以在好氧環(huán)境下被還原為氣體產(chǎn)物而使廢水脫氮。
背景技術(shù)：
在目前已應(yīng)用的多種脫氮方法中，生物脫氮仍然是廢水脫氮處理中的主要手段。傳統(tǒng)的廢水生物脫氮處理工藝是污水中的有機氮化合物在生化過程中首先轉(zhuǎn)化為氨氮，氨氮在硝化過程中由自養(yǎng)硝化菌將其轉(zhuǎn)化為硝酸鹽和亞硝酸鹽；在反硝化過程中再由異養(yǎng)反硝化菌將硝酸鹽和亞硝酸鹽還原轉(zhuǎn)化為氣體產(chǎn)物而使廢水脫氮。硝化是反硝化過程的前提，但反硝化過程真正達到廢水中的含氮化合物脫除的目的。由于硝化菌有強烈的好氧性，硝化過程必須是好氧的；而傳統(tǒng)反硝化菌在有氧條件下即以氧作為電子受體，進行有氧呼吸，只有無氧狀態(tài)時才以硝酸鹽或亞硝酸鹽作為電子受體，獲取合成細胞體的能量，因此傳統(tǒng)反硝化菌僅能在缺氧環(huán)境下才能進行反硝化。根據(jù)傳統(tǒng)生物脫氮理論而發(fā)展起來的生物脫氮工藝通常將硝化和反硝化分別在好氧區(qū)與缺氧或無氧區(qū)進行，形成分級硝化反硝化工藝，因而必須分別建造硝化池和反硝池，這樣就使得分級式硝化反硝化工藝存在很多不足之處，諸如由于分別建造硝化池和反硝化池，使得建造工藝流程較長、基建投資高，需要向反硝化池補充碳源等。
發(fā)明專利“一種好氧生物脫氮方法”，ZL 2003 1 0121374 0，該專利是一種涉及對污水中的含氮化合物通過活性污泥中的微生物在同一反應(yīng)器內(nèi)同時進行好氧硝化反硝化的脫氮處理的發(fā)明專利，但該專利未涉及活性污泥中微生物的種類；目前國內(nèi)外的許多研究報道都已證實，好氧反硝化作用是常規(guī)存在的而不是偶然的。事實上，從運河、池塘、土壤和活性污泥中分離出好氧反硝化菌是很有可能的。這些分離出來的菌種屬于Proteobacteria門α，β，γ綱的不同的菌屬(如Paracoccus，Thiobacillus，Enterobacter，Comamonas，Sphingomonas等)。此外，Lukow從垃圾滲濾液的硝化工段中分離出一株菌TL1，該菌可以同時利用降解氧和硝酸鹽，經(jīng)鑒定該菌屬于Zoogloea。Naokia篩得兩株反硝化菌，分別為Pseudomonas stutzeri TR2和Pseudomonas sp.K50。H.K.Huang從硝化反硝化污泥中分離出好氧反硝化菌Citrobacterdiversus。國內(nèi)張光亞從土壤中分離出一株好氧反硝化菌HN，經(jīng)鑒定為Rhodococcus sp.，于愛茸從池塘中分離出一株耐氧反硝化，經(jīng)鑒定屬于Bacillus。目前國內(nèi)外文獻中有關(guān)戴爾福特菌(Delftia)的報道很少。比較著名的是北京科技大學(xué)閆海博士從云南滇池底泥中篩選了1株能夠降解微囊藻毒素(Microcystins，MCs)的微生物純菌種，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為Delftia acidovorans USTB04，但并未發(fā)現(xiàn)有反硝化作用。

發(fā)明內(nèi)容
本專利涉及的戴爾福特(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797菌株能在僅以硝酸鹽為氮源和能源的條件下生長。該菌株對溶解氧的耐受程度強，在10～98％飽和溶解氧條件下，均能以顯著的速度還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，使反硝化能在好氧條件下進行，是一株新發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化菌。該菌株在有氧條件下進行反硝化作用的特性，可以將其接種于常規(guī)好氧硝化污泥中，即可實現(xiàn)含氮廢水的同步硝化反硝化作用，可以解決傳統(tǒng)廢水處理中生物脫氮需要采取缺氧反硝化、好氧硝化分段處理的問題。前面已經(jīng)介紹廢水中氨氮經(jīng)硝化過程均轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}或亞硝酸鹽，因此本發(fā)明適用于各種含氮廢水的脫氮處理。
本發(fā)明的目的在于篩選具有天然生長優(yōu)勢的高效好氧反硝化菌株，并進行菌株測序鑒別比對。將篩選得到的菌株，接種于含不同濃度硝酸鹽的廢水中，并通過不同反應(yīng)條件試驗(溶解氧，碳氮比，pH值等)，證實菌株有較廣泛的適應(yīng)性。菌株的脫氮能力受碳氮比的影響最大，且碳氮比越高，菌株的脫氮能力越強，因而雖然本發(fā)明在碳氮比2～10條件下進行實驗，在碳氮比為2～30時，菌株仍然有較強的脫氮能力。對溶解氧的耐受程度強，在10～98％飽和溶解氧條件下，在硝基氮濃度25～250mg/L，碳氮比為2～30，pH5.0～8.0的條件下均能進行有效的好氧脫氮作用。具體地講，本發(fā)明涉及一株戴爾福特(Delftiatsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797，該菌株的生長細胞、細胞懸浮液菌能以硝酸鹽為唯一氮源和能源生長，可在好氧條件下還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，并能夠繼續(xù)在好氧條件下還原亞硝酸鹽為氣體產(chǎn)物，使廢水中氮化合物降低，達到脫氮的目的。
本發(fā)明提供的戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797，于2006年9月7日，在北京保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC No.1797。
該菌株具有以下特征(1)菌落特征在BTB平板上培養(yǎng)2～3天后，菌落大小為1～2mm，菌落成圓形，光澤度很好，藍色，中心有白色突起。(2)細胞形態(tài)特征適宜于pH中性左右，常溫下培養(yǎng)，細胞為桿狀，革蘭氏染色陰性。(3)戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797的16SrRNA基因序列特征其16SrRNA具有序列表所示的核苷酸序列，序列長度為1406bp，在Genbank中的登錄號為DQ356901。
參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)的內(nèi)容，根據(jù)其形態(tài)特征和生理生化特征，以及根據(jù)其16SrRNA基因序列在Genbank中的檢索結(jié)果，鑒定該菌株(CGMCC No.1797)為戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)。
該菌株接種于含不同濃度硝酸鹽的廢水中，選擇不同條件如溶解氧，碳氮比，pH值等在不同實驗范圍內(nèi)下進行實驗，并測定其最大反硝化能力。實驗結(jié)果表明，該菌株在碳氮比＝2～10，以氮元素含量表示的硝酸鹽廢水濃度在50～200mg/L，反應(yīng)轉(zhuǎn)速60～160rpm，相當(dāng)于溶解氧濃度1.8～7.2mg/L(24～95％飽和溶解氧)，pH＝6.5～7.5的實驗范圍內(nèi)，其硝基氮最大去除速率可達到159.0mg NO3--N/L·d，最大4天硝基氮還原率達到100％，最大4天總氮去除率達到76.3％。
本發(fā)明提供的戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797菌株能在硝酸鹽廢水中生長，在好氧條件下降解利用硝酸鹽，并進行反硝化脫氮作用；也可以在如牛肉蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂等以營養(yǎng)培養(yǎng)基為碳源、氮源中生長。


附圖1戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCC No.1797所選四個因素各個水平-硝基氮去除率附圖2戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCC No.1797在最優(yōu)條件下硝酸鹽的降解曲線具體實施實例為了更好地理解本發(fā)明，通過以下實施實例予以進一步說明，但并非對本發(fā)明的限定。
實施例1戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCC No.1797菌株好氧反硝化性能的測定方法為了防止模擬廢水中帶入雜菌，硝酸鹽模擬廢水I和硝酸鹽模擬廢水II均在高溫滅菌鍋0.1MPa中滅活20min。取5ml滅菌后的硝酸鹽模擬廢水I裝入試管中，接入以液體石蠟封保存的純戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCC No.1797菌株樣品。將試管置于氣浴恒溫搖床，恒溫保持30℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min進行菌株活化?；罨?2小時后，以10％的接種量接種到裝有200ml硝酸鹽模擬廢水II的250ml錐形瓶中進行反硝化、脫氮性能測定。為保證錐形瓶中空氣與外界氣體的交換，以封口膜封口，同樣地在30℃、氣浴恒溫搖床上以160r/min進行搖瓶培養(yǎng)。對于250ml錐形瓶中加入廢水200ml的160r/min轉(zhuǎn)速試驗，實測反應(yīng)液溶解氧能夠保持在6.0～7.2mg/L，相當(dāng)于79～95％的飽和溶解氧。同樣條件下，空白廢水樣品(未接菌株的硝酸鹽模擬廢水II)作為對比基準試驗。
除了初始狀態(tài)之外，每隔24h用裝有0.2μm混合纖維膜的針式過濾器過濾抽取錐形瓶中廢水樣品5ml，采用離子色譜法測定錐形瓶中廢水的硝基氮和亞硝基氮濃度。通過計算硝酸鹽去除率和總氮(廢水中硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度之和)的去除率分析菌株的反硝化性能和脫氮性能。
硝酸鹽模擬廢水I(/L)KNO31g；KH2PO41g；FeCl2·6H2O 0.5g；CaCl2·7H2O 0.2g；MgSO4·7H2O 1g；琥珀酸鈉8.5g.
硝酸鹽模擬廢水II(/L)KNO30.6g；KH2PO41g；MgSO4·7H2O 1g；琥珀酸鈉2.4g.
實施例2-10不同實驗條件、范圍確定戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCCNo.1797菌株的最佳反硝化條件本發(fā)明共進行9次廢水處理試驗，優(yōu)選戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9CGMCC No.1797菌株的好氧反硝化反應(yīng)條件。
廢水好氧反硝化四個反應(yīng)因素分別為溶解氧濃度，通過控制不同轉(zhuǎn)速rpm來實現(xiàn)，轉(zhuǎn)速的三個水平分別為60、100和160rpm，對應(yīng)溶解氧濃度分別為1.8～3.5mg/L(24～46％飽和溶解氧)、4.2～5.6mg/L(55～74％飽和溶解氧)及6～7.2mg/L(79～95％飽和溶解氧)；硝基氮濃度的三個水平分別為50、100和200mg/L左右；碳氮比的三個水平分別為2、6和10；pH的三個水平分別為6.5、7.0和7.5。
按照實施例1方法進行反硝化性能測定，9次試驗結(jié)果見表1，并作附圖1。由附圖1可見，戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797對硝酸鹽的去除能力受碳氮比的影響最大，當(dāng)碳氮比為2左右時，硝酸鹽去除率只有為35.6％，而當(dāng)碳氮比增大到10左右時，硝酸鹽去除率增加到86.2％；溶解氧對戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797去除硝酸鹽能力的影響也較大，當(dāng)溶解氧1.8～3.5mg/L(24～46％飽和溶解氧)時，硝酸鹽去除率為84.4％，當(dāng)溶解氧6～7.2mg/L(79～95％飽和溶解氧)時，硝酸鹽去除率降為43.6％；廢水中的硝酸鹽濃度對戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9CGMCC No.1797去除硝酸鹽的能力影響略小于溶解氧的影響，當(dāng)廢水中硝酸鹽濃度200mg/L左右時，戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797對硝酸鹽的去除率達到57.9％；pH中性范圍左右對戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCCNo.1797去除硝酸鹽的能力影響相對最小。
在實驗范圍內(nèi)，實施例8 C/N＝10，NO3--N＝230.5mg/L，60r/min，pH＝7.0，該條件下戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCC No.1797一天可將硝酸鹽濃度從230.5mg/L降解到71.4mg/L，最大四天平均硝基氮去除速率可達到150.9mg NO3--N/L·d(見附圖2)，最大4天硝基氮去除率達到100％，最大4天總氮去除率達到76.3％。
表1實施例2-10的廢水好氧脫氮試驗條件及脫氮效率

實施例11戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCC No.1797的16SrRNA基因的PCR擴增和序列測定將戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)CGMCC No.1797接種到100μL雙蒸水中，沸水浴煮5min，進行菌落PCR擴增。用于16SrRNAPCR反應(yīng)的引物為一對通用引物，即正向引物為f27(5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物為r1492(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。引物由北京華大中生科技發(fā)展有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50μL)10×Buffer 5μL，dNTPs 4μL，引物f27和r1492各1μL，雙重蒸餾水39μL，離心混勻后加入DNA模板0.5μL，Taq酶0.5μL。PCR反應(yīng)程序包括(1)94℃預(yù)變性5min；(2)94℃變性1min；(3)50℃退火1min；(4)72℃延伸2min，進行25個循環(huán)；最后再次72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE電泳緩沖液，1％凝膠)分析PCR結(jié)果，交由北京華大中生科技發(fā)展有限公司進行16SrRNA測序。16SrRNA基因序列長度為1406bp，在Genbank中的登錄號為DQ356901，其16SrRNA的核苷酸序列如序列表所示。
<110>北京工商大學(xué)<120>具有好氧反硝化性能的戴爾福特菌及其處理廢水的方法<140>2006101408723<141>2006-10-13<160>1<210>1<211>1406<212>DNA<213>戴爾福特菌(Delftia tsuruhatensis)<400>1catgcagtcg aacggtaaca ggtcttcgga cgctgacgag tggcgaacgg gtgagtaata60catcggaacg tgcccagtcg tgggggataa ctactcgaaa gagtagctaa taccgcatac 120gatctgagga tgaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgcg attggagcgg ccgatggcag 180attaggtagt tggtgggata aaagcttacc aagccgacga tctgtagctg gtctgagagg 240acgaccagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300aattttggac aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg cgtgcaggat gaaggccttc 360gggttgtaaa ctgcttttgt acggaacgaa aaagctcctt ctaatacagg gggcccatga 420cggtaccgta agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg 480tgcgagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgtgcgc aggcggttat gtaagacaga 540tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcatttgtga ctgcatggct agagtacggt 600agagggggat ggaattccgc gtgtagcagt gaaatgcgta gatatgcgga ggaacaccga 660tggcgaaggc aatcccctgg acctgtactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa 720caggattaga taccctggta gtccacgccc taaacgatgt caactggttg ttgggaatta 780gttttctcag taacgaagct aacgcgtgaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840ttgaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gtttaattcg 900atgcaacgcg aaaaacctta cccacctttg acatggcagg aagtttccag agatggattc 960gtgctcgaaa gagaacctgc acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcat tagttgctac attcagttga 1080gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagt cctc 1140atggccctta taggtggggc tacacacgtc atacaatggc tggtacagag ggttgccaac 1200ccgcgagggg gagctaatcc cataaaacca gtcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg 1260actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc 1320cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagcggg tctcgccaga agtaggtagc 1380ctaaccgcaa ggagggcgct accacg 140權(quán)利要求
1.具有好氧反硝化性能的戴爾福特菌及其處理廢水的方法，其特征是選用戴爾福特(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797菌株進行各種含氮廢水的好氧反硝化脫氮廢水處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戴爾福特WXZ-9 CGMCC No.1797，其特征是16SrRNA具有如序列表所示的核苷酸序列，序列長度為1406bp，在Genbank中的登錄號為DQ356901。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戴爾福特WXZ-9 CGMCC No.1797菌株，其特征是(1)菌落特征在BTB平板上培養(yǎng)2～3天后，菌落大小為1～2mm，菌落成圓形，光澤度很好，藍色，中心有白色突起。(2)細胞形態(tài)特征適宜于pH中性，常溫下培養(yǎng)，細胞為桿狀，革蘭氏染色陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戴爾福特WXZ-9 CGMCC No.1797，其特征是該菌株的生長細胞、細胞懸浮液能以硝酸鹽為唯一氮源和能源生長，可在好氧條件下還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，并能夠繼續(xù)在好氧條件下還原亞硝酸鹽為氣體產(chǎn)物，使廢水中含氮化合物降低，達到脫氮的目的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生長條件，其特征包括在硝酸鹽廢水中生長，在好氧條件下利用硝酸鹽作為電子受體進行反硝化脫氮作用；也可以在如牛肉蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂等以營養(yǎng)培養(yǎng)基為碳源、氮源中生長。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的戴爾福特WXZ-9 CGMCC No.1797，其特征是該菌株有較廣泛的適應(yīng)性，對溶解氧的耐受程度強，在10～98％飽和溶解氧條件下，在硝基氮濃度25～250mg/L，碳氮比為2～30，pH5.0～8.0的條件下均能進行有效的好氧脫氮作用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1，5，6所述的戴爾福特WXZ-9 CGMCC No.1797，其特征是在有氧條件下具有廣泛適應(yīng)的反硝化作用特性，可以將其接種于常規(guī)好氧硝化污泥中，即可實現(xiàn)含氮廢水的同步硝化反硝化作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具有好氧反硝化性能的戴爾福特(Delftia tsuruhatensis)WXZ－9CGMCC No.1797菌株及其應(yīng)用于廢水脫氮處理的方法。該菌株對溶解氧的耐受程度強，在10～98％飽和溶解氧條件下，均能以顯著的速度還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，將其接種于活性污泥中富集培養(yǎng)后，可實現(xiàn)好氧反硝化作用。
文檔編號C02F3/02GK101016525SQ20061014087
公開日2007年8月15日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者汪蘋, 項慕飛, 翟茜, 龍雯, 劉俊女, 楊志 申請人:北京工商大學(xué)