專利名稱：一種具有高效降解吡啶能力的廣州蒼白桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌領(lǐng)域，具體地說，涉及一種具有高效降解吡啶能力的廣州蒼白桿菌新菌種。
技術(shù)背景作為一種典型的難降解有機(jī)污染物，雜環(huán)芳烴化合物造成的環(huán)境問題已經(jīng)引起人們越來越多的重視。 因其大多具有"三致作用"，危害著人類健康和生態(tài)平衡，目前雜環(huán)芳烴化合物在環(huán)境中的擴(kuò)散己經(jīng)造成 了土壤、地下水等的嚴(yán)重污染。生物修復(fù)時(shí)解決此類問題的有效方法，利用從環(huán)境中篩選的降解微生物能 夠有效去除污泥等環(huán)境中雜環(huán)和苯環(huán)類等污染物質(zhì)。吡啶作為最基本和典型的雜環(huán)芳烴物質(zhì)而成為研究的焦點(diǎn)，特別是集中在純菌株對吡啶的生物降解特性。蒼白桿菌屬是由Holmes等在1988年建立的新屬。細(xì)胞染色為革蘭氏陰性。專性好氧，最適生長溫度 是20-30°C,接觸酶、氧化酶陽性。不水解明膠。能利用各種氨基酸、有機(jī)酸和碳水化合物為碳源。但至 今尚未發(fā)現(xiàn)蒼白桿菌屬中有降解吡啶的菌株。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種具有高效降解吡啶能力的廣州蒼白桿菌新菌種。本發(fā)明通過對廣州某油漬氣廠的污泥進(jìn)行分離、純化，得到蒼白桿菌屬的一個(gè)新種，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā) 現(xiàn)該菌種具有高效降解吡啶的能力，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明所提出的新菌種命名為廣州蒼白桿菌(ft^ote"r 卵a(bǔ)/^力oi/e/we) P2 。本發(fā)明的廣州蒼白桿菌((9c力rotec^raz ^/a;^z力cwe"se) P2己于2007年12月5日保存在中國典型 培養(yǎng)物保藏中心(地址中國武漢市武漢大學(xué))，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC M 207191。本發(fā)明的廣州蒼白桿菌P2從廣州油漬氣廠的污泥進(jìn)行分離、純化而得。其分離純化方法如下首先把污泥打散，取lg污泥放在以吡啶(lg/L)為唯一的液體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基里培養(yǎng)(KH2P04 2.93 g , K2HP04 5.87 g ， MgS04 0. 3 g , FeS04 0,01 g , NaCl 2 g , (NH4 ) 2 S04 5 g ,微量鹽溶液2 mU 。 固體培養(yǎng)基中加入16 g瓊脂。微量鹽溶液(mg/L) : Mo03 4 mg ， ZnS04 5H20 28 mg ， CuS04 5H20 2 mg , H3B03 4 mg , MnS04 5H204 mg , CoCl2 6H20 4 mg).培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)接到濃度分別為2g/L， 3g/L， 4g/L， 5g/L進(jìn)行馴化.從5g/L的培養(yǎng)基里取lral到以吡啶為唯一碳源的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單 菌落在以吡啶為唯一碳源的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上劃線純化，直到平板上為單一的純菌落即為純菌。本發(fā)明的廣州蒼白桿菌P2具有如下的形態(tài)和生理生化特性菌體的形態(tài)特性a. 采用常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，廣州蒼白桿菌P2的細(xì)胞為革蘭氏陰性，桿 狀，大小為，菌體0.4 0.8x1.6 2.2 um，周身鞭毛。b. 菌落的形態(tài)特性在LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)為圓形，無色，透明，菌落直徑為1-2ram。主要的生理生化特性
嚴(yán)格好氧生長，氧化酶和接觸酶都為陽性。不能水解明膠。 上述結(jié)果表明本發(fā)明廣州蒼白桿菌P2與蒼白桿菌屬的生理生化特性很相似。 本發(fā)明廣州蒼白桿菌P2分子分類地位
采用DNA小量提取方法提取細(xì)菌總DNA。采用16S rRNA通用引物27F和1522r擴(kuò)增其16S rRNA基因； 將PCR產(chǎn)物直接測序，將獲得的16S rRNA基因序列輸入GenBank，通過Blastn程序?qū)?shù)據(jù)庫中的所有序 列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明廣州蒼白桿菌P2的16SrRNA基因序列與蒼白桿菌屬的已有模式菌株具 有較高的相似性，其中與ft a卯a(chǎn)-ozy幼e DSM 174711的序列相似性為97. 4%。同一菌種的16S rRNA基因 序列的同源性應(yīng)大于97. 7%。
綜合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列結(jié)果，本發(fā)明廣州蒼白桿菌P2應(yīng)歸屬蒼白桿菌屬，且 為該屬的一個(gè)新種，命名為廣州蒼白桿菌(6b^otec&咖^/朋p力owe/2se) P2 。其判斷參考如下文獻(xiàn) Holmes, B，et al . International Journal of Systematic Bacteriology 1988 38, 406-416; Yanez M A, et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 2002， 53: 875-883. Statomi M, et al. International Journal of Systematic Bacteriology, 2003, 53: 491-499.
將本發(fā)明的廣州蒼白桿菌P2放在雜環(huán)化合物吡啶濃度為800mg/L， lg/L, 2g/L， 3g/L， 4g/L， 5g/L 的液體培養(yǎng)基里以170 r/min培養(yǎng)3天后利用分光光度計(jì)計(jì)算其吡啶降解率。經(jīng)測定，其吡啶降解率分別 是90.91%, 92.25% ， 95.71%， 97.14%, 98.06%, 98,67%。
本發(fā)明為污泥中雜環(huán)化合物吡啶的處理提供了一種低成本、高效率不發(fā)生二次污染的吡啶降解菌。該 菌對污泥中吡啶的降解率可高達(dá)5g/L.大大節(jié)約了成本，提高了常規(guī)處理方法的效率，加快生態(tài)修復(fù)進(jìn)程。


圖1為廣州蒼白桿菌(Oc力rote"n/yz/ ^;朋5^owe/we) P2 CCTCC M 207191的8900倍左右的電子顯 微鏡圖片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
在100ml去離子水中添加Na2HP04. 7H20 1. 28 g， (肌)2S04 0. 1 g， FeS04 0. 01 g ， NaCl 0. 2 g， K2HP04 0.6g，吡啶0.08 g， 121° C條件下滅菌20 min作為培養(yǎng)液并分裝到20 ml試管中，每管5 ml。 從保存的廣州蒼白桿菌(ft;/^otecm/ffl gw朋5^oue/7se) P2 CCTCC M 207191斜面菌種接種至LB液體培養(yǎng) 基中，于30 ° C， 180 r/min條件下?lián)u床活化菌體，使菌數(shù)達(dá)到108數(shù)量級，以100 w 1活化菌液接種到 培養(yǎng)液中，放在30 ° C， 180 r/min搖床培養(yǎng)，到3 d取2 ml培養(yǎng)液于5000 r/min離心3 min，去菌體， 采用DU 640紫外分光光度(BECKMAN)在256 nm處測定培養(yǎng)液中吡啶的吸光值。計(jì)算吡啶的降解率。3d 后廣州蒼白桿菌P2對吡啶的降解率達(dá)到90. 91%。
實(shí)施例2:在100 ml去離子水中添力口 Na2HP04. 7H20 1. 28 g， (NH4) 2S04 0. 1 g， FeS04 0. 01 g ， NaCl 0. 2 g， K2HP04 0.6 g，吡啶O. 1 g, 121° C條件下滅菌20 min作為培養(yǎng)液并分裝到20 ml試管中，每管5 ml。 從保存的廣州蒼白桿菌(ft^^acti"咖卯a(chǎn)^z力oue/we) P2 CCTCC M 207191斜面菌種接種至LB液體培養(yǎng) 基中，于30。C, 180 r/min條件下?lián)u床活化菌體，使菌數(shù)達(dá)到108數(shù)量級，以100 lU活化菌液接種到培 養(yǎng)液中，放在30° C， 180 r/min搖床培養(yǎng)，到3 d取2 ml培養(yǎng)液于5000 r/min離心3 min，去菌體，采 用DU 640紫外分光光度計(jì)(BECKMAN)在256 nm處測定培養(yǎng)液中吡啶的吸光值。計(jì)算吡啶的降解率。3 d 后廣州蒼白桿菌P2對吡啶的降解率達(dá)到92. 25%。
實(shí)施例3:
在100ml去離子水中添加Na2HP04. 7H20 1. 28g， (NH4) 2S04 0. lg， FeS04 0. 01 g ， NaCl 0. 2 g, HP040.6g，吡啶0.2g， 121° C條件下滅菌20min作為培養(yǎng)液并分裝到20ml試管中，每管5ml。從保存 的廣州蒼白桿菌(6b^ofec^raz gu朋^力加e73se) P2 CCTCC M 207191斜面菌種接種至LB液體培養(yǎng)基中， 于30° C， 180 r/rain條件下?lián)u床活化菌體，使菌數(shù)達(dá)到108數(shù)量級，以100 u 1活化菌液接種到培養(yǎng)液中， 放在30。C， 180 r/min搖床培養(yǎng)，到3 d取2 ml培養(yǎng)液于5000 r/min離心3 min，去菌體，采用DU 640 紫外分光光度計(jì)(BECKMAN)在256 nm處測定培養(yǎng)液中吡啶的吸光值。計(jì)算吡啶的降解率。3 d后廣州蒼 白桿菌P2對吡唆的降解率達(dá)到95.71%。
實(shí)施例4:
在100 ml去離子水中添加Na2HP04. 7H20 1.28 g, (NH4) 2S04 0.1 g， FeS04 0. 01 g , NaCl 0.2 g, K2 HP04 0.6 g，吡啶0.3 g， 121° C條件下滅菌20 min作為培養(yǎng)液并分裝到20 ml試管中，每管5 ml。從 保存的廣州蒼白桿菌(Oc力rote"r咖^y朋^力o〃e"se) P2 CCTCC M 207191斜面菌種接種至LB液體培養(yǎng)基 中，于30。C， 180r/min條件下?lián)u床活化菌體，使菌數(shù)達(dá)到108數(shù)量級，以100 u 1活化菌液接種到培養(yǎng) 液中，放在30 ° C， 180 r/min搖床培養(yǎng)，到3 d取2 ml培養(yǎng)液于5000 r/min離心3 min，去菌體，采 用DU 640紫外分光光度計(jì)(BECKMAN)在256 nm處測定培養(yǎng)液中吡啶的吸光值。計(jì)算吡啶的降解率。3d 后廣州蒼白桿菌P2對吡啶的降解率達(dá)到97. 14%。
實(shí)施例5:
在100ml去離子水中添加Na2HP04. 7H20 1. 28 g， (亂)2S04 0. 1 g， FeS04 0. 01 g , NaCl 0. 2 g, K2HP04 0.6 g，吡啶0.3 g， 121° C條件下滅菌20 min作為培養(yǎng)液并分裝到20 ml試管中，每管5 ml。從保存 的廣州蒼白桿菌(OcArotec^r咖^/a77gzA0"e/2se) P2 CCTCC M 207191斜面菌種接種至LB液體培養(yǎng)基中， 于30° C， 180 r/min條件下?lián)u床活化菌體，使菌數(shù)達(dá)到108數(shù)量級，以100 u 1活化菌液接種到培養(yǎng)液中， 放在30° C， 180 r/min搖床培養(yǎng)，到3 d取2 ml培養(yǎng)液于5000 r/min離心3 min，去菌體，采用DU 640 紫外分光光度計(jì)(BECKMAN)在256 nm處測定培養(yǎng)液中吡啶的吸光值。計(jì)算吡啶的降解率。3 d后廣州蒼 白桿菌P2對吡啶的降解率達(dá)到98.06%。
實(shí)施例6:在100ml去離子水中添加Na2HP04. 7H20 1.28 g， (NH4) 2S04 0.1 g， FeS04 0. 01 g , NaCl 0.2 g, K2HP04 0.6 g，吡啶0.4g， 121° C條件下滅菌20min作為培養(yǎng)液并分裝到20ml試管中，每管5ml。從保 存的廣州蒼白桿菌(汰，力ro6a"7Y/歷^/a/^z力ow朋se) P2 CCTCCM 207191斜面菌種接種至LB液體培養(yǎng)基中， 于30° C, 180 r/min條件下?lián)u床活化菌體，使菌數(shù)達(dá)到108數(shù)量級，以100 w 1活化菌液接種到培養(yǎng)液中， 放在30° C， 180 r/min搖床培養(yǎng)，到3 d取2 ml培養(yǎng)液于5000 r/min離心3 min，去菌體，采用DU 640 紫外分光光度計(jì)(BECKMAN)在256 ran處測定培養(yǎng)液中吡啶的吸光值。計(jì)算吡啶的降解率。3d后廣州蒼 白桿菌P2對吡啶的降解率達(dá)到98.67%。
權(quán)利要求
1.一種具有高效降解吡啶能力的廣州蒼白桿菌(Ochrobactrum guangzhouense)CCTCC M 207191，從油漬氣廠的污泥進(jìn)行分離、純化而獲得，為蒼白桿菌屬的一個(gè)新種，該菌種的形態(tài)和生理生化特性如下菌體的形態(tài)特性a.采用常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，其細(xì)胞為革蘭氏陰性，桿狀，大小為，菌體0.4～0.8×1.6～2.2μm，周身鞭毛；b.菌落的形態(tài)特性在LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)為圓形，無色，透明，菌落直徑為1-2mm；主要的生理生化特性嚴(yán)格好氧生長，氧化酶和接觸酶都為陽性，不能水解明膠。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有高效降解吡啶能力的廣州蒼白桿菌，該菌種從油漬氣廠的污泥進(jìn)行分離、純化而獲得，為蒼白桿菌屬的一個(gè)新種，命名為廣州蒼白桿菌(Ochrobactrum guangzhouense)P₂，保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 207191。該菌種具有較高降解吡啶的能力，能夠?qū)ξ勰嘀械倪拎みM(jìn)行有效的降解，降低了污泥處理的成本。
文檔編號C02F101/38GK101294140SQ20071003287
公開日2008年10月29日 申請日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者孫國萍, 張國霞, 曾國驅(qū), 許玫英 申請人:廣東省微生物研究所