專(zhuān)利名稱(chēng)：蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及細(xì)菌及其應(yīng)用，具體是指蛭弧菌在消除 淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，特別適用于消除淡水產(chǎn)品食用或加 工前、運(yùn)輸過(guò)程及其養(yǎng)殖水體中攜帶的致病菌。
背景技術(shù)：
蛭弧菌(Bc/e//oWftr/o>)是由Stolp和Petzhold從菜豆葉燒病假單胞菌 ATCC11355中分離發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)以攻擊和裂解其它細(xì)菌來(lái)完成自身生長(zhǎng)和繁 殖的寄生菌。蛭弧菌具有類(lèi)似噬菌體的功能，對(duì)能導(dǎo).致漁業(yè)養(yǎng)殖病害和人類(lèi) 食物中毒的致病菌具有良好的裂解清除效果，但對(duì)動(dòng)植物無(wú)毒副作用。嗜水氣單胞菌Me廠omonas / ycf廠op/7/7a)、惡臭假單胞菌(Pse油A7 onas pWcte)、遲緩愛(ài)德華菌(aywarcte/e//a farcfa)及大腸桿菌(Esc勿e〃'c/ /a co//) 都是可引起人類(lèi)食物中毒的致病菌，淡水產(chǎn)品是其食源性感染最為重要的傳 播媒介。淡水產(chǎn)品所攜帶的致病菌，除了引發(fā)人類(lèi)食物中毒外，也可引發(fā)淡 水產(chǎn)品本身在養(yǎng)殖期間的病害。為了控制淡水魚(yú)蝦貝蟹細(xì)菌性病害，養(yǎng)殖廠 家不得不使用抗生素，如此又導(dǎo)致漁藥的殘留。藥物的殘留超標(biāo)，給我國(guó)淡 水產(chǎn)品的出口帶來(lái)了極大的壓力。對(duì)于淡水產(chǎn)品中致病菌的清除，目前仍多采用物理或化學(xué)藥物的方法， 但物理或化學(xué)藥物的方法均有其明顯的弊端。各種抗生素的濫用，導(dǎo)致了致 病菌對(duì)抗生素的抗性。開(kāi)發(fā)研制新型抗生素不但費(fèi)用高昂且研制周期長(zhǎng)。物 理的方法則只能應(yīng)用到"從源頭到餐桌"的某一環(huán)節(jié)，而非全過(guò)程。然而， 蛭弧菌作為一類(lèi)具有裂解致病菌的特殊細(xì)菌，不僅可應(yīng)用到淡水產(chǎn)品生產(chǎn)的 全過(guò)程，而且也不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)抗性，也無(wú)噬菌體宿主過(guò)于專(zhuān)一的缺點(diǎn)， 因此蛭弧菌作為一類(lèi)致病菌的生物消除劑具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)。如能在淡水產(chǎn)品在養(yǎng)殖期間、運(yùn)輸過(guò)程或食用、加工前，先進(jìn)行致病菌 的生物消除工作，則一方面可以減少或消除食物中毒的機(jī)率，減少或消除藥 物殘留的可能，提高產(chǎn)品質(zhì)量安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健康，另一方面也可 為^^水產(chǎn)品的加工提供優(yōu)質(zhì)原材料和加工上的便利，為出口創(chuàng)匯提供強(qiáng)有力的保障。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端，通過(guò)研發(fā)找出適用于消除淡水 產(chǎn)品致病菌的蛭弧菌，提供一種蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病 菌的應(yīng)用，特別適用于消除淡水產(chǎn)品食用或加工前、運(yùn)輸過(guò)程及其養(yǎng)殖水體 中攜帶的致病菌。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，應(yīng)用方法包括以 下具體步驟及其條件步驟一蛭弧菌的分離純化對(duì)采集的淡水或底泥進(jìn)行預(yù)處理，接種增殖蛭弧菌的嗜水氣單胞菌，倒 雙層平板，在含宿主菌的雙層平板上出現(xiàn)噬菌斑，挑取不斷擴(kuò)大的單斑，再 按微生物學(xué)方法液體增殖培養(yǎng)、雙層平板檢驗(yàn)，再次挑取不斷擴(kuò)大的單斑， 并重復(fù)若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑為 一株蛭弧菌純菌株，按同一時(shí)間內(nèi)單斑大小計(jì)，可分離出若干株蛭弧菌純菌 株；所述蛭弧菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為BDF01 CCTCC M 208008、 BDF02 CCTCC M 208009、 BDF03 CCTCC M 208010;步驟二蛭弧菌濃縮液的制備將若干株蛭弧菌分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別制成濃度為10" 1013pfu/ml的蛭弧菌濃縮液，待用；步驟三蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品攜帶的致病菌中的應(yīng)用 在污染了致病菌的淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中、食用前、加工或運(yùn)輸過(guò)程中加入步驟二制備的蛭弧菌濃縮液，使蛭弧菌的濃度至少達(dá)到103pfu/ml。所述蛭弧菌包括蛭弧菌游泳體和蛭弧菌蛭質(zhì)體。所述應(yīng)用方法采用2株或2株以上的蛭弧菌混合使用，效果更佳。所述應(yīng)用方法特別適用于消除食用或加工前淡水產(chǎn)品攜帶的致病菌，應(yīng)用時(shí)蛭弧菌游泳體最佳濃度范圍為105 1013pfu/ml 。所述應(yīng)用方法還適用于消除淡水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的致病菌，應(yīng)用時(shí)蛭弧 菌游泳體最佳濃度范圍為104 1012pfu/ml。所述應(yīng)用方法還適用于消除淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中的致病菌，應(yīng)用時(shí)蛭弧菌游泳體最佳濃度范圍則為103 107pfu/ml。本發(fā)明蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品在食用前、運(yùn)輸過(guò)程中及其養(yǎng)殖水體致病 菌的應(yīng)用效果如下1、 在淡水產(chǎn)品食用或加工前采用本法消除淡水產(chǎn)品中致病菌效果顯著 如圖1所示，以羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹為例，嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌清除率均可達(dá)99%以上。2、 采用本發(fā)明消除淡水產(chǎn)品中的致病菌安全性好 蛭弧菌消除淡水產(chǎn)品中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的方法是生物的方法，蛭弧菌具有可侵染、裂解宿主細(xì)菌的特性， 使之適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中致病菌的生物凈化因子，且其在 裂解完宿主細(xì)菌后，會(huì)因饑餓而自動(dòng)消亡，因此對(duì)人和動(dòng)物無(wú)毒副作用。不 僅可提高消費(fèi)者生食淡水產(chǎn)品的安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健康，也為淡水產(chǎn) 品的綠色加工生產(chǎn)提供保障。3、 將本發(fā)明應(yīng)用于淡水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中，方便、安全且效果好 淡水產(chǎn)品在運(yùn)輸過(guò)程中采用蛭弧菌來(lái)消除致病菌可防止水質(zhì)惡化、提高淡水產(chǎn)品存活率，同時(shí)避免使用抗生素以及孔雀石綠類(lèi)的禁藥。4、 本發(fā)明適合推廣應(yīng)用于淡水產(chǎn)品的養(yǎng)殖過(guò)程在養(yǎng)殖期間即進(jìn)行致病菌的消除工作，特別有利于減少或消除化學(xué)藥物 如抗生素的使用和殘留，確保淡水產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，以羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、 河蟹養(yǎng)殖為例，蛭弧菌游泳體對(duì)淡水魚(yú)蝦貝蟹養(yǎng)殖水體中致病菌的消除試驗(yàn) 的效果如圖3所示，養(yǎng)殖水體中致病菌的數(shù)量，可控制在4cfu/ml的水平。5、 本發(fā)明為消除淡水產(chǎn)品所攜帶的食源性致病菌提供一種新的方法并可 適用于淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖到食用前的全過(guò)程中，有效地減少或消除化學(xué)藥物如抗 生素的殘留，確保淡水產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)，從根本上避免淡水產(chǎn)品食物中毒事件的 發(fā)生，為出口創(chuàng)匯提供強(qiáng)有力的保障。6、 蛭弧菌蛭質(zhì)體也可用于消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中所攜帶的致病菌 雖然蛭弧菌蛭質(zhì)體消除致病菌的效果不如蛭弧菌游泳體，但同樣也可用于消 除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中所攜帶的致病菌。


圖1為羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹食用前施用三株蛭弧菌游泳體清除致病菌時(shí)的致病菌濃度對(duì)數(shù)值-時(shí)間圖；圖2為羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹運(yùn)輸過(guò)程中施用三株蛭弧菌游泳 體清除致病菌時(shí)的致病菌濃度對(duì)數(shù)值-時(shí)間圖；圖3為羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹養(yǎng)殖水體中施用三株蛭弧菌游泳 體清除致病菌時(shí)的致病菌濃度對(duì)數(shù)值-時(shí)間圖；圖4為羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹食用前分別施用三株蛭弧菌，兩 株蛭弧菌， 一株蛭弧菌清除致病菌時(shí)的致病菌濃度對(duì)數(shù)值-時(shí)間圖；圖5為羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹食用前施用三株蛭弧菌蛭質(zhì)體及 三株蛭弧菌游泳體清除致病菌時(shí)的致病菌濃度對(duì)數(shù)值-時(shí)間圖；具體實(shí)施方式
實(shí)施例1任意混合的三株蛭弧菌在消除食用羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹中致 病菌的應(yīng)用應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件 步驟一蛭弧菌的分離純化(1) 蛭弧菌噬菌斑觀察與鑒別 對(duì)采集的淡水或底泥進(jìn)行預(yù)處理，接種嗜水氣單胞菌，增殖蛭弧菌，倒雙層平板，在含宿主菌的雙層平板上出現(xiàn)噬菌斑，挑取不斷擴(kuò)大的單斑，再 按微生物學(xué)方法液體增殖培養(yǎng)、雙層平板檢驗(yàn)，再次挑取不斷擴(kuò)大的單斑， 并重復(fù)多次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑為止， 即為蛭弧菌純菌株。(2) 嗜水氣單胞菌的增殖與濃縮 當(dāng)平板中出現(xiàn)蛭弧菌透明的噬菌斑時(shí)，則增殖嗜水氣單胞菌，離心制備濃縮液。(3) 蛭弧菌噬菌單斑的挑選與增殖對(duì)于確定為由蛭弧菌產(chǎn)生的噬菌單斑，挑出后放入適量的稀釋營(yíng)養(yǎng)肉湯(DNB)液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入(2)的嗜水氣單胞菌濃縮液，恒溫?fù)u床 250rpm、 28X:培養(yǎng)24h。(4) 雙層平板檢驗(yàn)蛭弧菌增殖后，5000rpm、 4"C離心20min除去嗜水氣單胞菌菌體，上 清液經(jīng)16000rpm、 4"C離心20min得到蛭弧菌菌體沉淀，DNB液體培養(yǎng)基 重新懸浮沉淀物，將此懸浮液經(jīng)1.2um微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液稀釋成 10—1pfu/ml、 10-3pfu/ml、 10—5pfu/ml、 1CT7pfu/ml、 10—9pfu/ml、 1CT"pfu/ml六個(gè)稀釋倍數(shù)。從原液及各個(gè)稀釋度的稀釋液中各取0.1ml，分別與0.3ml嗜 水氣單胞菌濃縮液混合均勻，再與5CTC含有0.6%瓊脂的DNB上層培養(yǎng)基混 合均勻，傾注于DNB下層平板中并鋪平，得雙層平板，于恒溫培養(yǎng)箱28"C培養(yǎng)。(5)蛭弧菌的純化出現(xiàn)噬菌斑的平板使用(3) 、 (4)的方法，再次挑取不斷擴(kuò)大的單一 噬菌斑、液體增殖培養(yǎng)、雙層平板檢驗(yàn)，并重復(fù)多次，單噬菌斑傳代至形成 形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑為止，可認(rèn)為蛭弧菌已經(jīng)純化，即為蛭 弧菌純菌株。共分離出三株蛭弧菌，其菌株號(hào)分別為BDF01、 BDF02、 BDF03 (所述蛭弧菌于2008年1月13日在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)分別為CCTCC NO: M 208008、CCTCC NO: M 208009、 CCTCC NO: M 208010，分類(lèi)命名分別為蛭弧菌BDF01 ， Bdellovibrio sp.BDF01和蛭弧菌BDF02， Bdellovibrio sp.BDF02以及蛭弧 菌BDF03， Bdellovibrio sp.BDF03);步驟二蛭弧菌游泳體濃縮液的制備步驟一得到的菌株號(hào)分別為BDF01、 BDF02、 BDF03的蛭弧菌，與嗜 水氣單胞菌濃縮液混合后加入到含有DNB培養(yǎng)基的三角錐瓶中，恒溫?fù)u床 250rpm、 28。C培養(yǎng)24h。培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)6000rpm、 4"C離心20min，取上清液， 再16000rpm、 4。C條件下離心20min，棄上清液，加入適量DNB液體培養(yǎng) 基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，制成濃度為10" 1013pfu/ml的蛭弧菌游泳體混 合濃縮液。步驟三蛭弧菌對(duì)食用或加工前羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹中嗜水 氣單胞菌、惡臭假單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的消除實(shí)驗(yàn)(1)嗜水氣單胞菌、惡臭假單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的制備 用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，160rpm 28t培養(yǎng)12-16h分別增殖嗜水氣 單胞菌、惡臭假單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌。培養(yǎng)液經(jīng)5000rpm、 4°C 離心20min，棄上清液，沉淀菌體用無(wú)菌蒸餾水重新懸浮，分別調(diào)整各自濃 度為109cfu/ml。(2)蛭弧菌對(duì)嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌 的消除試驗(yàn)試驗(yàn)容器為25L的水族箱，分為試驗(yàn)和對(duì)照兩大系列。試驗(yàn)用水為濾膜 過(guò)濾的養(yǎng)殖淡水，每個(gè)水族箱注入16L過(guò)濾水。試驗(yàn)所用羅非魚(yú)約重140 190g，羅氏沼蝦體長(zhǎng)約為8 10cm,河蜆平均體長(zhǎng)為40mm，河蟹規(guī)格為 30 40g。每個(gè)水族箱放羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆以及河蟹各10只。在實(shí)驗(yàn) 前經(jīng)二氯異腈尿酸鈉消毒，水溫為26'C。實(shí)驗(yàn)期間用水連續(xù)充氣。3個(gè)水族 箱作為對(duì)照系列，僅加四種致病菌，不加蛭弧菌。試驗(yàn)系列中，3個(gè)水族箱 為一組，共五組，分別加入一定量的蛭弧菌游泳體濃縮液，使蛭弧菌終濃度 分別達(dá)到105pfu/ml、 107pfu/ml、 109pfu/ml、 10"pfu/ml和1013pfu/ml。試驗(yàn)時(shí)，在相應(yīng)的水族箱中加入上述步驟三(1)制備好的嗜水氣單胞菌， 惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌，使其終濃度分別達(dá)到1x103crfu/ml， 然后將羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹放入其中，再在試驗(yàn)系列水族箱中加 入不同量的蛭弧菌游泳體濃縮液，使它們達(dá)到上述終濃度。嗜水氣單胞菌的 檢測(cè)采用Rimler-shotts (R—S培養(yǎng)基)選擇性培養(yǎng)基，惡臭假單胞菌的檢 測(cè)采用NMS (—種無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基)選擇性培養(yǎng)基，遲緩愛(ài)德華菌的檢測(cè)采用 HE選擇性瓊脂培養(yǎng)基，大腸桿菌的檢測(cè)采用TBX (—種顯色培養(yǎng)基)選擇 性瓊脂培養(yǎng)基。菌株號(hào)分別為BDF01、 BDF02、 BDF03的三株蛭弧菌混合，對(duì)食用水 產(chǎn)品(羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹)中四種致病菌的消除試驗(yàn)的效果如 圖1所示。圖1中， 一令一為嗜水氣單胞菌濃度對(duì)數(shù)值變化曲線， 一疆一為 惡臭假單胞菌濃度對(duì)數(shù)值變化曲線，一 A-為遲緩愛(ài)德華菌濃度對(duì)數(shù)值變化曲 線，一*一為大腸桿菌濃度對(duì)數(shù)值變化曲線。以上均為試驗(yàn)系列中最低蛭弧菌 游泳體終濃度組(105pfu/ml)中致病菌的濃度對(duì)數(shù)值變化曲線，由于其它高 濃度蛭弧菌組的消除效果更好，故不再在圖中表示。所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行 樣(即三個(gè)水族箱)的平均值。從圖1中可知，添加蛭弧菌游泳體后，致病菌濃度即開(kāi)始下降，到第4h， 僅余下1 2cfu/ml。比較四種致病菌的初始濃度與終濃度，可知三株蛭弧菌 對(duì)嗜水氣單胞菌、惡臭假單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的消除率分別為 99.21%、 99.49%、 99.75%、 99.87%。實(shí)施例2任意三株蛭弧菌游泳體混合液在消除羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹運(yùn) 輸過(guò)程中嗜水氣單胞菌、惡臭假單胞菌、遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的應(yīng)用應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一、二及步驟三(1)均同實(shí)施例1步驟三(2)蛭弧菌游泳體對(duì)羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹運(yùn)輸過(guò)程中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的消除試驗(yàn) 試驗(yàn)容器、試驗(yàn)用水和試驗(yàn)所用羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹規(guī)格均同實(shí)施例1。每個(gè)水族箱內(nèi)放4只完好的網(wǎng)格，在每一個(gè)網(wǎng)格中分別放入羅 非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹，封好網(wǎng)格蓋子后立即把它平放到水族箱中， 排出箱內(nèi)多余用水，使其水位剛好蓋過(guò)網(wǎng)格。在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)二氯異腈尿酸鈉消 毒，水溫為26T:。實(shí)驗(yàn)期間用水連續(xù)充氣。3個(gè)水族箱作為對(duì)照系列，僅加 四種致病菌。試驗(yàn)系列中，3個(gè)水族箱為一組，共五組，分別加入一定量的 蛭弧菌游泳體濃縮液，使蛭弧菌終濃度分別達(dá)到104pfu/ml、 106pfu/ml、 108pfu/ml、 10"pfu/ml和1012pfu/ml。試驗(yàn)時(shí)，在相應(yīng)的水族箱中加入上述步驟三(1)制備好的嗜水氣單胞菌， 惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌，并使其終濃度分別達(dá)到 1xl03cfu/ml。四種致病菌的濃度檢測(cè)均同實(shí)施例1。任意三株蛭弧菌游泳體混合對(duì)羅非魚(yú)、羅氏沼好、河蜆及河蟹運(yùn)輸過(guò)程 中四種致病菌的消除試驗(yàn)的效果如圖2所示。圖2中濃度對(duì)數(shù)值變化曲線所 用符號(hào)均同圖1。以上均為試驗(yàn)系列中最低蛭弧菌游泳體終濃度組 (104pfu/ml)中致病菌的濃度對(duì)數(shù)值變化曲線。從圖2中可知，添加蛭弧菌游泳體后，致病菌濃度即開(kāi)始下降。比較四 種致病菌的初始濃度與終濃度，可知應(yīng)用三株蛭弧菌游泳體清除淡水產(chǎn)品運(yùn) 輸過(guò)程中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的消除率 分別達(dá)到99.05%、 99.37%、 99.68%、 99.84%。實(shí)施例3任意混合三株蛭弧菌游泳體在羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹養(yǎng)殖過(guò)程 中消除嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的應(yīng)用 應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一、二及步驟三(1)均同實(shí)施例1步驟三(2)蛭弧菌游泳體在羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹中養(yǎng)殖過(guò)程 中的應(yīng)用試驗(yàn)前，臨時(shí)建造12個(gè)養(yǎng)殖水池(0.5mx0.5mx0.5m= 125L)。將養(yǎng)殖水池分為試驗(yàn)和對(duì)照兩大系列。試驗(yàn)用水為不過(guò)濾的養(yǎng)殖淡水， 每個(gè)水池注入100L。試驗(yàn)所用羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹規(guī)格均同實(shí)施 例1。每個(gè)水池放羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹各20只。在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)二氯 異腈尿酸鈉消毒，試驗(yàn)期間水溫為26'C,每日早晚各投餌一次。3個(gè)水池為 對(duì)照系列，僅加此四種致病菌。試驗(yàn)系列中，3個(gè)水池為一組，加入一定量 的蛭弧菌游泳體濃縮液，使其達(dá)到一個(gè)預(yù)定的蛭弧菌終濃度。如此共有3個(gè) 不同梯度的蛭弧菌游泳體終濃度，艮P: 103pfu/ml、 10Spfu/ml和107pfu/ml。試驗(yàn)時(shí)，在相應(yīng)的水池中加入加入上述步驟三(1)制備好的嗜水氣單胞 菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌，并使其濃度分別達(dá)到 1x103cfu/ml，然后將羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹放入其中，再在試驗(yàn)系 列水池中加入不同量的蛭弧菌游泳體濃縮液，使它們達(dá)到不同的終濃度。三 株蛭弧菌游泳體對(duì)養(yǎng)殖水體中四種致病菌的消除試驗(yàn)的效果如圖3所示。圖 3中濃度對(duì)數(shù)值變化曲線所用符號(hào)均同圖1。以上均為試驗(yàn)系列中最低蛭弧菌 游泳體終濃度組(103pfu/ml)。從圖3中可知，比較的四株致病菌的初始濃度與終濃度，可知三株蛭弧 菌游泳體對(duì)養(yǎng)殖水體中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸 桿菌的消除率分別為99.21%、 99.50%、 99.68%、 99.80%。實(shí)施例4為比較單株、多株蛭弧菌應(yīng)用效果，分別施用任意混合的三株蛭弧菌和 兩株蛭弧菌、 一株蛭弧菌游泳體在消除食用羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹 中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌的應(yīng)用應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一、二及步驟三(1)均同實(shí)施例1步驟三(2)分別施用三株蛭弧菌、兩株蛭弧菌、 一株蛭弧菌游泳體對(duì)食 用羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài) 德華菌及大腸桿菌的消除試驗(yàn)試驗(yàn)容器、試驗(yàn)用水和試驗(yàn)所用羅非魚(yú)、羅氏沼4下、河蜆、河蟹規(guī)格均 同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)期間用水連續(xù)充氣。3個(gè)水族箱作為對(duì)照系列，僅加四種致 病菌。試驗(yàn)系列中，3個(gè)水族箱為一組，分別加入三株蛭弧菌(BDF01 、BDF02、 BDF03)的游泳體混合濃縮液，兩株蛭弧菌的游泳體混合濃縮液， 一株蛭弧 菌游泳體濃縮液，使其達(dá)到預(yù)定的終濃度1x105pfu/ml。試驗(yàn)時(shí)，在相應(yīng)的水族箱中加入上述步驟三(1)制備好的嗜水氣單胞菌， 惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌，使其終濃度分別達(dá)到1x103cfu/ml, 然后將羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹放入其中，再在試驗(yàn)系列水族箱中分 別加入以上三種蛭弧菌游泳體濃縮液。施用三株蛭弧菌、兩株蛭弧菌、 一株蛭弧菌游泳體對(duì)食用羅非魚(yú)、羅氏 沼蝦、河蜆及河蟹中四種致病菌的消除試驗(yàn)的效果如圖4所示。圖4中，_ 令一為施用一株蛭弧菌游泳體時(shí)四種致病菌的總濃度對(duì)數(shù)值變化曲線， 一國(guó) 一為施用兩株蛭弧菌游泳體時(shí)四種致病菌的總濃度對(duì)數(shù)值變化曲線，_▲— 為施用三株蛭弧菌游泳體時(shí)四種致病菌的總濃度對(duì)數(shù)值變化曲線。所有數(shù)據(jù) 均為三個(gè)平行樣(水族箱)的平均值。如圖4所示結(jié)果表明，添加蛭弧菌后，三個(gè)試驗(yàn)組中四種致病菌濃度即 下降。比較試驗(yàn)系列中施用三株蛭弧菌、兩株蛭弧菌、 一株蛭弧菌消除四種 致病菌的濃度對(duì)數(shù)值變化曲線，可知三株蛭弧菌游泳體混用效果最好，而兩 株蛭弧菌游泳體混用效果也優(yōu)于單用一株蛭弧菌游泳體?；煊弥溉我馊牝?弧菌、兩株蛭弧菌混合。實(shí)施例5任意混合三株蛭弧菌游泳體及三株蛭弧菌蛭質(zhì)體在消除食用羅非魚(yú)、羅 氏沼蝦、河蜆及河蟹中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸 桿菌的應(yīng)用應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一、二均同實(shí)施例1。步驟三(1)蛭弧菌游泳體混合濃縮液的制備同實(shí)施例1。蛭弧菌蛭質(zhì)體混合濃縮液的制備如下從雙層平板上挑取單斑蛭弧菌，與嗜水氣單胞菌濃縮液混合后加入到含有DNB培養(yǎng)基的三角錐瓶中，恒溫?fù)u床250rpm、 28。C培養(yǎng)24h。培養(yǎng)物經(jīng) 過(guò)6000rpm、4。C離心20min，取上清液，再16000rpm、4。C條件下離心20min，棄上清液，加入適量DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，再加入嗜水氣 單胞菌濃縮液混合搖瓶30min，即為蛭弧菌蛭質(zhì)體。將蛭弧菌制成濃度為 1011 1013pfu/ml的蛭弧菌蛭質(zhì)體濃縮液。步驟三(2)任意三株蛭弧菌游泳體及任意三株蛭弧菌蛭質(zhì)體對(duì)食用羅非 魚(yú)、羅氏沼蟲(chóng)下、河蜆及河蟹中嗜水氣單胞菌，惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌 及大腸桿菌的消除試驗(yàn)試驗(yàn)容器、試驗(yàn)用水和試驗(yàn)所用羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆、河蟹規(guī)格均 同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)期間用水連續(xù)充氣。3個(gè)水族箱作為對(duì)照系列，僅加四種致 病菌。試驗(yàn)系列中，3個(gè)水族箱為一組，分別在相應(yīng)的水族箱中加入三株蛭 弧菌游泳體的混合濃縮液、三株蛭弧菌蛭質(zhì)體的混合濃縮液，使其達(dá)到預(yù)定 的蛭弧菌終濃度1x105pfu/ml試驗(yàn)時(shí)，在相應(yīng)的水族箱中加入上述步驟3(1)制備好的嗜水氣單胞菌， 惡臭假單胞菌，遲緩愛(ài)德華菌及大腸桿菌，使其終濃度分別達(dá)到1x103cfu/ml， 然后將羅非魚(yú)、羅氏沼蝦、河蜆及河蟹放入其中，再在試驗(yàn)系列水族箱中加 入不同量的蛭弧菌濃縮液，使它們達(dá)到不同的蛭弧菌終濃度。四種致病菌的 濃度檢測(cè)均同實(shí)施例1。三株蛭弧菌游泳體及其蛭質(zhì)體對(duì)食用羅非魚(yú)、羅氏沼蟲(chóng)下、河蜆及河蟹中 四種致病菌的消除試驗(yàn)的效果如圖5所示。圖5中一令一為施用三株蛭弧菌 蛭質(zhì)體時(shí)四種致病菌的總濃度對(duì)數(shù)值變化曲線，一A-為施用三株蛭弧菌游泳 體時(shí)四種致病菌的總濃度對(duì)數(shù)值變化曲線。所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)平行樣(水族 箱)的平均值。圖5所示結(jié)果表明，開(kāi)始添加蛭弧菌后，由于蛭質(zhì)體濃縮液中帶有其培 養(yǎng)過(guò)程中的宿主菌嗜水氣單胞菌，因此蛭質(zhì)體試驗(yàn)組四種致病菌的初始濃度 對(duì)數(shù)值稍高于游泳體試驗(yàn)組。比較試驗(yàn)系列中蛭弧菌游泳體試驗(yàn)組和蛭弧菌 蛭質(zhì)體試驗(yàn)組中四株致病菌的濃度對(duì)數(shù)值曲線，可知蛭弧菌游泳體對(duì)四種致 病菌的清除效果要優(yōu)于蛭弧菌蛭質(zhì)體。
權(quán)利要求
1、蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用方法包括以下具體步驟及其條件步驟一蛭弧菌的分離純化對(duì)采集的淡水或底泥進(jìn)行預(yù)處理，接種增殖蛭弧菌的嗜水氣單胞菌，倒雙層平板，在含宿主菌的雙層平板上出現(xiàn)噬菌斑，挑取不斷擴(kuò)大的單斑，再按微生物學(xué)方法液體增殖培養(yǎng)、雙層平板檢驗(yàn)，再次挑取不斷擴(kuò)大的單斑，并重復(fù)若干次，至單噬菌斑傳代形成形狀、大小、透明度均一致的噬菌斑為一株蛭弧菌純菌株，按同一時(shí)間內(nèi)單斑大小計(jì)，可分離出若干株蛭弧菌純菌株；所述蛭弧菌保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為BDF01 CCTCCM 208008、BDF02CCTCC M 208009、BDF03CCTCC M 208010；步驟二蛭弧菌濃縮液的制備將若干株蛭弧菌分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分別制成濃度為1011～1013pfu/ml的蛭弧菌濃縮液，待用；步驟三蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品攜帶的致病菌中的應(yīng)用在污染了致病菌的淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中、食用前、加工前或運(yùn)輸過(guò)程中加入步驟二制備的蛭弧菌濃縮液，使蛭弧菌的濃度至少達(dá)到103pfu/ml。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病 菌的應(yīng)用，其特征在于所述蛭弧菌包括蛭弧菌游泳體和蛭弧菌蛭質(zhì)體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法采用2株或2株以上的蛭弧菌混合使用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法適用于消除食用或加工前淡水產(chǎn)品攜帶的致病菌，應(yīng)用時(shí)蛭弧菌游泳體濃度范圍為105 1013pfu/ml。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法適用于消除淡水產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中的致病菌，應(yīng)用時(shí)蛭弧菌游泳體濃度范圍為104 1012pfu/ml。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法適用于消除淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中的致病菌，應(yīng)用時(shí)蛭弧菌游泳體濃度范圍則為103 107pfu/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蛭弧菌在消除淡水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖水體中致病菌的應(yīng)用，特別適用于消除淡水產(chǎn)品食用或加工前、運(yùn)輸過(guò)程及其養(yǎng)殖水體中攜帶的致病菌。在污染了致病菌的淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖水體中、食用前、加工前或運(yùn)輸過(guò)程中加入蛭弧菌濃縮液，使其濃度至少達(dá)到10³pfu/ml。淡水產(chǎn)品食用或加工前、運(yùn)輸過(guò)程中或養(yǎng)殖水體中應(yīng)用本法時(shí)，蛭弧菌游泳體濃度范圍分別為10⁵～10¹³pfu/ml；10⁴～10¹²pfu/ml；10³～10⁷pfu/ml。致病菌清除率均在99％以上。本發(fā)明適合應(yīng)用于淡水產(chǎn)品養(yǎng)殖到食用前的全過(guò)程。不僅可提高消費(fèi)者生食淡水產(chǎn)品的安全系數(shù)，保護(hù)消費(fèi)者的健康，也為淡水產(chǎn)品的綠色加工生產(chǎn)提供保障。
文檔編號(hào)C02F3/34GK101275119SQ20081000911
公開(kāi)日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2008年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者娟 李, 蔡俊鵬 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)