專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種生物除鐵除錳功能菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種微生物。技術(shù)背景水體中鐵的去除工藝較為成熟，單純具有除鐵功能的工程菌也比較多，但鐵和錳是地殼中含量豐富的金屬元素，僅將鐵去除遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足現(xiàn)有的水處理標(biāo)準(zhǔn)。普通水體中錳離子的濃度為0.1lmg/L，而厭氧地下水中溶解性的錳離子濃度可高達(dá)7-9mg/L。可溶性錳經(jīng)充氧曝氣能夠生成不溶性沉淀物(如Mn02或MnOOH)。Mn02是高度不可溶物質(zhì)(5—Mn02的溶解度kso僅為1(T56)，呈深黑色，可導(dǎo)致供飲用的地下水出現(xiàn)明顯的色度；因此飲用水中的錳必須去除。我國(guó)規(guī)定飲用水中錳離子的最高濃度為0.1mg/L，而歐盟已將飲用水中錳離子的最高濃度確定為0.05mg/L。地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴隨著錳離子的氧化、沉淀以及不溶性氧化產(chǎn)物的過(guò)濾分離。錳離子發(fā)生的非生物氧化反應(yīng)如下—4她(n)]=^她01)]+fc[她(ii)][她cv]表明Mn(II)的氧化伴隨著MnOx的自催化反應(yīng)，這種自催化作用在飲用水錳處理工藝中較為重要。Mn(II)非生物氧化由氧作電子供體，通常在pH值大于9的條件下完成，低于9的pH條件下氧化反應(yīng)速度極慢。絕大多數(shù)的飲用水pH在6~8之間，這種pH條件下Mn(II)不會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)；因此飲用水中的錳不能通過(guò)簡(jiǎn)單的曝氣和沉淀法去除。若加入化學(xué)藥劑(如KMn04和C102)雖然除錳效果較為理想，但增加了工藝運(yùn)行費(fèi)用、反應(yīng)殘留物和生成的副產(chǎn)物，引起二次污染。生物氧化除錳具有良好的應(yīng)用前景，但是目前生物氧化除錳主要利用自然選擇建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除錳效果差，而且水處理過(guò)濾速度慢、不能超過(guò)10m/h?，F(xiàn)有水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化和啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)；一旦工程菌群遭到破壞(中毒等原因?qū)е鹿こ叹劳?其恢復(fù)周期長(zhǎng)，在此期間出水中錳含量劇增、出水質(zhì)量難以保證，致使該水處理設(shè)施不能正常運(yùn)轉(zhuǎn)，嚴(yán)重的將威脅人民群眾的正常生活和生態(tài)環(huán)境。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化、啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)和工程菌群遭到破壞后恢復(fù)周期長(zhǎng)的問(wèn)題，而提供的一種生物除鐵除錳功能菌。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^eoto"m'wwsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2239;生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z^^oZ)""en'wmsp.)為好氧菌，長(zhǎng)為1.52pm，寬為0.8~l.l|am，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓，多個(gè)細(xì)菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團(tuán)，有共同的莢膜；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C77o^o6。"m'Mmsp.)具有能量貯存顆粒，無(wú)芽胞，N，N，N，，N，-四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)染色為陽(yáng)性。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C770^o^"m'wmsp.)能在pH值為7~10的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2，eok^en'謂sp.)有脂質(zhì)顆粒聚(3-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質(zhì)顆粒PHB和異染顆粒Pdy-P都屬于能量貯存顆粒，因此生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C720^o^"m'簡(jiǎn)sp.)可以適應(yīng)低溫、貧營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)環(huán)境，具有惡劣環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4通過(guò)16SrDNA基因序列比對(duì)分析與其最相近的種屬是金黃桿菌屬的C770^eok"eWMwsp.TM3-8，同源性為99%,因此被命名為C7zo^eo6acfen'wwsp.。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(0，eo^cm'謂sp.)不但能去除水中的Mr^+，還能去除水中的Fe2、Mi^+去除率高于94.44%，F(xiàn)e2+去除率高于90.13%。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/o^o^cten'謂sp.)的生化能力強(qiáng)、除錳效果好，可以直接投入使用，不僅縮短了水處理除錳生物濾池的建立時(shí)間，也可加快過(guò)濾速度，并且縮短了工程菌群遭到破壞后的恢復(fù)周期，可以在短暫的34小時(shí)內(nèi)恢復(fù)水處理設(shè)施正常運(yùn)行，保證了出水的質(zhì)量。C7zo^eo6(3cfen.w附sp.屬于金黃桿菌屬(G/w3^e06a"en.wm)i呆藏于中SH斂生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2239。圖1是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C720^o&c欣/蘭sp.)的原子力顯微鏡圖片；圖2是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C770^o6fl"en'調(diào)sp.)的原子力顯微鏡圖片；圖3是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/z，eo^cfen'謂sp.)中脂質(zhì)顆粒染色后觀察圖；圖4是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C72，eo^"m',sp.)中異染顆粒染色后觀察圖；圖5是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z，eo^"en'訓(xùn)sp.)去除水中Mn2+的時(shí)間曲線圖；圖6是生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^06a"eWw/wsp.)去除水中Fe"的時(shí)間曲線圖。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^oZ^"m'wwsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2239;生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^oto"m'畫(huà)sp.)為好氧菌，長(zhǎng)為1.52pm，寬為0.81.1pm，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓(如圖1和圖2所示)，多個(gè)細(xì)菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團(tuán)，有共同的莢膜；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^o&"m'"wsp.)具有能量貯存顆粒，無(wú)芽胞，N,N,N，，N，—四甲基對(duì)苯二胺(TMPD)染色為陽(yáng)性。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/7o^eokc^7'Mwsp.)能在pH值為7~10的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zo^o^cten'wmsp.)趨向于形成35個(gè)或更多的細(xì)胞組成的鏈。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C72o^ok^m'騰sp.)是從遼寧省沈陽(yáng)市張士生物除錳水廠的生物除錳濾池曝氣池壁取泥中篩選得到的。篩選用1L培養(yǎng)基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，0.1gMnSO4.H2O，0,lgK2HPO4，0.2gMgS04'7H20，0.2gNaNO3，0.1gCaCl2，0.1g(NH4)2CO3，O.OlgFeS04'7H20和余量的蒸餾水制成；然后滅菌。本實(shí)施方式采用平板劃線與平板涂布法相結(jié)合進(jìn)行分菌，采用TMPD法(VandenabeeleJ，DdeBeeretal.Manganeseoxidationbymicrobialconsortiafromsandfilters.Microb.Ecol.1992,24:91-108.)對(duì)分離所得菌種進(jìn)行初篩。本實(shí)施方式采用TMPD法的原理是N，N,N',N'-四甲基對(duì)苯二胺(N，N，N',N'-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可與四價(jià)錳反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)WursterBlue,利用分光光度法通過(guò)測(cè)WursterBlue在420nm處的OD值可推知菌落具有,2+氧化能力的強(qiáng)弱(菌落無(wú)顏色變化的為陰性、無(wú)生物除錳功能)。本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(CV^eoZ)""m'"wsp.)16SrDNA測(cè)序工作由生物工程公司完成；其中PCR擴(kuò)增正向引物BSF8/20:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，。本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^^^a"en'wmsp.)16SrDNA序列如SEQIDNO.l所示。本實(shí)施方式生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^oZ)a"en'Mmsp.)生理生化分析結(jié)果如表l所示。表1生物除鐵除錳功能菌MSB-4生理生化分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>酸。硝酸鹽還原試驗(yàn)+具有硝酸還原鹽能力氧化酶試驗(yàn)+可以和細(xì)胞色素a、b、c構(gòu)成氧化酶系的氧化酶產(chǎn)n引哚試驗(yàn)一不具有能分解色氨酸使之形成吲哚的色氨酸酶明膠液化試驗(yàn)—沒(méi)有分解蛋白質(zhì)的能力產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)—不能分解含硫有機(jī)物產(chǎn)生硫化氫PH值試驗(yàn)pH7~10(pH8~9時(shí)生長(zhǎng)最好)適于在堿性環(huán)境中生長(zhǎng)生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)2037°C一般溫度下都可以正常生長(zhǎng)需氧性的測(cè)定上部生長(zhǎng)屬于好氧型的細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7o^ok^m'訓(xùn)sp.)是好氧菌，適于在偏堿性水環(huán)境生長(zhǎng)；具淀粉酶和氧化酶；不具有脂肪酶、色氨酸酶、脫氨酶；沒(méi)有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酰四基甲醇的能力；不能在糖代謝過(guò)程中分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^eo^c&n'wmsp.)有脂質(zhì)顆粒聚P-羥基丁酸(PHB)和異染顆粒聚合磷酸鹽(Poly-P)，脂質(zhì)顆粒PHB和異染顆粒Poly-P都屬于貯存顆粒。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2，eoZ^ten'謂sp.)中脂質(zhì)顆粒染色后觀察圖如圖3所示，生物除鐵除錳功能菌MSB-4(02o^ok"m'iw7sp.)中異染顆粒染色后觀察圖如圖4所示。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^o6acten'wmsp.)的發(fā)酵上清液具有較高的除錳活性，試驗(yàn)表明生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7zrj^M""m'謂sp.)能夠分泌大量的除錳胞外蛋白酶。接菌培養(yǎng)生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7w7"o6""en'wwsp.)，液體培養(yǎng)液pH值為7.5，在12'C的條件下培養(yǎng)48h，然后向培養(yǎng)液中加入Mr+溶液使培養(yǎng)液中Mi^+的濃度為5.6mg/L，液體培養(yǎng)液中Mi產(chǎn)的濃度隨時(shí)間的變化曲線如圖5所示；在1224h期間，Mr產(chǎn)去除率迅速升高，達(dá)80%。，直到48h后趨于穩(wěn)定，Mn"去除率達(dá)到94.44%。接菌培養(yǎng)生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/zo^o^"m'訓(xùn)sp.)，液體培養(yǎng)液pH值為7.5，在12'C的條件下培養(yǎng)48h，然后向培養(yǎng)液中加入F^+溶液使培養(yǎng)液中Ff的濃度為，14mg/L，液體培養(yǎng)液中F^+的濃度隨時(shí)間的變化曲線如圖6所示；在12h內(nèi)，F(xiàn)e"去除率迅速增高，去除率高達(dá)81%，F(xiàn)e"濃度由14mg/L降至2.66mg/L。24h后，去除率趨于穩(wěn)定，F(xiàn)e"去除率達(dá)到90.13%。實(shí)驗(yàn)證明，生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C7z，eoZ^"m'謂sp.)屬具除鐵除錳功能的好氧菌種，具異染顆粒、類(lèi)脂粒，易形成菌膠團(tuán)，對(duì)外界不良環(huán)境具有較強(qiáng)抗性。MSB-4具有較高的鐵錳去除率，對(duì)F^+去除率高達(dá)90.13%，Mn2+去除率高達(dá)94.44%。<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>—種生物除鐵除錳功能菌<160>3<210>1<211>1515<212>DNA<213>生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/20^o6a"en'ww平)<220><223>生物除鐵除錳功能菌MSB-416SrDNA基因序列<400>1tgatccagccgcaccttccggtacggctaccttgttacgscttagcccta60gttacttgttttaccctaggcagctcctgttacggtcaccgacttcaggtaccccaasct120tccatggcttgacgggcggtgtgtaca鄉(xiāng)cccggg犯cgtattcaccgcatcatggctg180atatgcgattactagcgattccagcttcat卿gtcgagttgcagactccaatccgaact240g卿ccggctttcgagattcgcatcctatcgctaggt已gctgccctctgtaccggccatt300gt3ttacgtgtgtggccc犯ggcgt已鄉(xiāng)gccgtgatgatttgacgtcatccccaccttc360CtCtCtELCttgcgtaggcagtctcactagagtccccaeictgaatgatggcaactagtgac420郷ggttgcgctcgttgcaggsctt幼cct幼C3CCtCgLCggcacgsgctgscgac^cc480atgcagcacctccga^gaaaagtctatttctaaaxxtgtc540taagccttggtaaggttcctcgcgtatcatcgaatta犯ccacataatccaccgcttgtg600cgggcccccgtcaattcctttgagtttcattcttgcg犯cgtactccccaggtggct犯c660ttatcactttcgcttagtctctg犯tccga￡Lg￡LCCC￡Laa3acgagttagcatcgtttacg720gcgtgg已ctacc已gggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgtccatcagcgtca780agtgacctgccttcgcaattggtgttctaagtaatatctatgcatttcac840cgctacactaCtt已ttCC3gccacttctactttactca^gacctgcagtatc犯tggcag900tttcatagtta已gctatg3gatttcaccactgacttacagatccgcctacgg3CCCttt3960atccggat犯cgcttgcaccctccgtattaccgcggctgctggcacggag1020ttagccggtgcttattcgtatagtaccttcagctttccacacgtgga犯ggtttatccct1080agtttacaacccatagggccgtcgtccttxacgcgg抓ggctgg已tc觀1140gctctcacccattgtccaatattcctxactgctgcctcccgtaggagtctggtccgtgtc1200tcagtaccagtgtgggggatcaccctctcaggccccctaaagatcactgacttggtaggc1260cgttaccctaccaactatctaatcttgcgcgtgcccatctctatccaccggagttttC331320ta犯已a(bǔ)acgatgccgtttcttatattatggggtattaatcttcctttcgaaaggctatcc1380CCCtg3t犯3ggc鄉(xiāng)ttgcacacgtgttccgcacccgtacgccgctctctctattccga1440agaataaataccgctcggcttgcatgtgttaggcctcccgctagcgttcatcctgagcca1500ggatcaaactctaat1515<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)E.coli16SrRNA基因8~20bp設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增正向引物BSF8/20序列<400>2agagtttgatcctggctcag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)E.coli16SrRNA基因1520~1541bp設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增正向引物BSR1541/20序列。<400>3aaggaggtgatccagccgca20權(quán)利要求1、一種生物除鐵除錳功能菌，其特征在于生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2239；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)為好氧菌，長(zhǎng)為1.5～2μm，寬為0.8～1.1μm，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓，多個(gè)細(xì)菌聚集或呈鏈狀排列，形成菌膠團(tuán)，有共同的莢膜；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形，二分裂生殖；生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)具有能量貯存顆粒，無(wú)芽胞，N，N，N’，N’-四甲基對(duì)苯二胺染色為陽(yáng)性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物除鐵除錳功能菌，其特征在于生物除鐵除錳功能菌MSB-4(C/2o^ok/"m'wwsp.)能在pH值為710的環(huán)境中生長(zhǎng)，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸鹽還原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脫氨酶。全文摘要一種生物除鐵除錳功能菌，它涉及一種微生物。它解決了目前生物氧化除錳工程菌群靠自然選擇建立，生化能力弱、除錳效果差；水處理除錳生物濾池的建立所需培養(yǎng)、馴化、啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)和工程菌群遭到破壞后恢復(fù)周期長(zhǎng)的問(wèn)題。生物除鐵除錳功能菌MSB-4(Chryseobacteriumsp.)屬于金黃桿菌屬，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2007年10月30日，保藏號(hào)為CGMCCNo.2239；菌株MSB-4為好氧菌，長(zhǎng)為1.5～2μm，寬為0.8～1.1μm，短桿狀細(xì)胞，兩端鈍圓；在培養(yǎng)基上形成棕黃色菌落，不透明，菌落為圓形；菌株MSB-4具異染顆粒和類(lèi)脂粒，無(wú)芽胞，N，N，N’，N’-四甲基對(duì)苯二胺染色為陽(yáng)性。本發(fā)明生物除鐵除錳功能菌MSB-4具有去除水中Mn²⁺、Fe²⁺的能力，Mn²⁺去除率高達(dá)94.44％，F(xiàn)e²⁺去除率高達(dá)90.13％。文檔編號(hào)C02F1/62GK101230326SQ20081006381公開(kāi)日2008年7月30日申請(qǐng)日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日發(fā)明者杰張,冬李,焱趙申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)