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      利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素的方法

      文檔序號(hào):4861661閱讀:286來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及的是一種生物化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域的方法,具體的說(shuō),是一種利用 分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素的方法。
      技術(shù)背景四環(huán)素(Tetracycline,簡(jiǎn)稱TC)屬于四環(huán)素類抗生素,是一種廣泛使用 的人畜共用的藥物,常被用于治療和預(yù)防傳染性疾病或作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物 生長(zhǎng)。如果使用不當(dāng)會(huì)造成殘留。對(duì)人,畜,環(huán)境造成損傷或污染。長(zhǎng)期食用四環(huán) 素超標(biāo)的動(dòng)物性食品,對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生直接的毒副作用和引起過(guò)敏反應(yīng)。為了保證 人民的身體健康,世界各國(guó),如歐盟、日本、美國(guó)和我國(guó)農(nóng)業(yè)部,對(duì)四環(huán)素的使用 和殘留都做了嚴(yán)格的規(guī)定并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),其中歐盟對(duì)動(dòng)物性食品及不同組 織中規(guī)定的限量不同,如牛奶中最高不能高于100ppm。同時(shí),由于牛奶、血液、 尿液等生物樣品及被四環(huán)素污染的河水、廢水等環(huán)境樣品中的水含量很高。因此, 開(kāi)發(fā)兼容水環(huán)境且靈敏的檢測(cè)方法,對(duì)分析痕量存在的四環(huán)素十分必要。由于動(dòng) 物性食品和環(huán)境樣品的基質(zhì)復(fù)雜,所以有必要進(jìn)行前處理,從而提高檢測(cè)的靈敏 度。目前通用的前處理方法有液液分配、固相萃取、免疫柱層析技術(shù)等,其中固 相萃取技術(shù)因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單,節(jié)約試劑,可同時(shí)處理多個(gè)樣品而得到廣泛應(yīng)用。但 是由于目前常用的固相萃取填料與目標(biāo)物的吸附作用都是非特異的,固定相的選 擇性低,易受復(fù)雜基質(zhì)的干擾,限制了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展,分子印跡技術(shù)是基于分 子識(shí)別基礎(chǔ)上的一種功能聚合物制備技術(shù),該聚合物合成時(shí)采用目的分子或者類 似物作為模板,合成后將模板洗脫,內(nèi)部保留和目的分子互補(bǔ)的空間結(jié)構(gòu)和基團(tuán), 且具有"記憶"功能,可特異的和模板分子發(fā)生作用,并通過(guò)相應(yīng)的方式洗脫, 從而達(dá)到純化和富集目的分子的作用。由于分子印跡聚合物是采用化學(xué)方法合成 的,具有抵抗酸堿等惡劣環(huán)境的優(yōu)點(diǎn),可重復(fù)使用,所以應(yīng)用越來(lái)越廣泛。不過(guò), 很多用非共價(jià)聚合的方法開(kāi)發(fā)出來(lái)的分子印跡聚合物在水環(huán)境中的兼容性比較
      低。如何在含水豐富的樣品中使用分子印跡聚合物,以便直接凈化提取生物和環(huán) 境樣品中的目標(biāo)分析物,是分子印跡技術(shù)應(yīng)用研究方面的重要課題。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn),R. Suedee等在《Journal of Chromatography B》(2004,811, 191-200)上發(fā)表的文章"Use of molecularly imprinted polymers from a mixture of tetracycline and its degradation products to produce affinity membranes for the removal of tetracycline from water"(將四環(huán) 素及其降解產(chǎn)物印跡的分子印跡聚合物用于制備親和性膜)合成了四環(huán)素分子印跡聚合物并嘗試將其作為親和膜中的識(shí)別材料進(jìn)行了評(píng)價(jià)。這項(xiàng)研究首次證明, 以四環(huán)素類抗生素作為模板分子制備的分子印跡聚合物,可以從水中特異性的分 離吸附相應(yīng)的抗生素。但是該文章的印跡聚合物是在不含水的有機(jī)溶劑中制備 的,并且只是從理論上探索水溶液中的PH值、離子強(qiáng)度等因素對(duì)親和吸附的影 響,并沒(méi)有記載合成的材料應(yīng)用到樣品的前處理方面。Yan HY等在《Talemta》 (2008; 75:227-232.)上發(fā)表的"Water-compatible molecularly imprinted polymers for selective extraction of ciprofloxacin from human urine" 中,于甲醇和水的混合物中制備了能從人的尿液中選擇性提取喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星的分子印跡聚合物。但是該文章介紹的方法依賴于模板抗生素的物理化學(xué) 特性,未見(jiàn)適用于其它抗生素分子印跡聚合物的報(bào)道。在含水樣品中的抗生素檢 測(cè)和處理方面,到目前為止還沒(méi)有報(bào)道涉及金屬離子介導(dǎo)的分子印跡聚合物。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種利用分子印跡聚合物凈 化含水樣品中四環(huán)素的方法,從而彌補(bǔ)在四環(huán)素殘留的檢測(cè)過(guò)程中,現(xiàn)有的技術(shù) 在環(huán)境及生物樣品前處理方面存在的弊端,簡(jiǎn)單、快速、特異、高效的純化和富 集痕量四環(huán)素,提高現(xiàn)有檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的,本發(fā)明首先制備四環(huán)素分子印跡聚合 物,然后將四環(huán)素分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中,得到四環(huán)素分子印跡 聚合物固相萃取小柱,在應(yīng)用四環(huán)素分子印跡固相萃取小柱純化、富集尿液中的 四環(huán)素殘留。本發(fā)明包括如下步驟第一步,制備四環(huán)素分子印跡聚合物①將模板分子四環(huán)素、功能單體甲基丙烯酸(MAA)、介導(dǎo)印跡的金屬離子和 交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),按模板分子金屬離子功能單體交 聯(lián)劑摩爾比=1: 1 5: 2 10: 20,混合溶解到致孔劑中,加入引發(fā)劑偶氮二異 丁氰(AIBN),混合溶解后,體系置于安培瓶中,充入氮?dú)?,然后在氮?dú)鈿夥障?封口, 60 7(TC熱引發(fā)聚合反應(yīng)24 48小時(shí); 所述金屬離子為Mg2+, Fe2+, Cij2+中一種。所述四環(huán)素和致孔劑的用量為當(dāng)模板分子為0. lmmol時(shí),致孔劑的體積為 4 7ml。所述致孔劑為甲醇和水的混合溶液,兩者體積比為9: 1 3。② 將合成的聚合物攪拌分散后,得到粒徑在0.1 1.5um之間的顆粒,除去 微細(xì)的顆粒;最后通過(guò)索氏萃取進(jìn)一步除去模板分子;所述索氏萃取,其條件為萃取劑采用甲醇、醋酸混合液,二者的體積比為 9: 1 8: 2,萃取時(shí)間為24 72小時(shí),萃取分三次完成,每次8小時(shí)以上;最 后用純甲醇萃取1 2次,除去剩余的醋酸。③ 將除去模板分子的聚合物干燥過(guò)夜,獲得四環(huán)素的分子印跡聚合物。所述干燥,其溫度為6(TC。通過(guò)以上步驟,獲得的分子印跡聚合物為直徑在l.Oixm左右的球狀顆粒。 在含水豐富的環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)測(cè)得該聚合物能特異性吸附四環(huán)素,每克聚合物理論 上的最大吸附量為4.1毫克四環(huán)素。并且適合用作固相萃取的填料,與已有的 檢測(cè)方法(如ELISA、 HPLC等)相結(jié)合,能夠處理含水豐富的生物樣品(如尿樣), 并獲得較高的回收率。不但有效地凈化了基質(zhì),而且富集了目標(biāo)分析物,顯著提 高四環(huán)素殘留的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效率。第二步,將四環(huán)素分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中,得到四環(huán)素分子 印跡聚合物固相萃取小柱;所述的填充到固相萃取柱管,是指:用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板,稱量四環(huán)素分子印跡聚合物50mg 150mg,用乙醇勻漿后,填充于商品化的lm1 6 ml聚丙烯固相萃取小柱內(nèi)。所述的填充到固相萃取柱管,在抽真空狀態(tài)下,將勻漿液裝入聚丙烯固相萃 取小柱,填料的頂端和底端分別裝上聚乙烯篩板。所述的篩板,其孔徑為0.5 ym。第三步,先后用乙腈、乙酸、HC1、雙蒸水、FeS04對(duì)四環(huán)素分子印跡聚合物
      固相萃取小柱活化預(yù)處理,加入KH2P04處理后的尿樣,經(jīng)過(guò)淋洗固相萃取柱,即 能洗脫、凈化和收集四環(huán)素。所述的對(duì)四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱活化,是指用5 10ml乙腈、 乙酸、HC1 , 5 10ml雙蒸水,1 2mlFeS04對(duì)固相萃取柱預(yù)處理,其中乙腈、 乙酸、HC1體積比為8:1:1, HC1濃度為1. 0 mol L—、 FeS04濃度為0. 25腿ol L—1 。所述的加入KH2P04處理后的尿樣,是指9ml尿液用約lml的0. 2 mol L—1 KH2P04 處理后,加入其中的l 10ml。所述的淋洗,是指用1 3 ml的體積濃度為80%的甲醇淋洗四環(huán)素分子印跡 聚合物固相萃取小柱。所述的洗脫,是指用2 3ml乙腈、乙酸、HC1的混合液,乙腈、乙酸、HC1 體積比為8:1:1,其中HC1濃度為1. 0 mol L—'。本發(fā)明中,合成的四環(huán)素分子印跡聚合物是一種細(xì)小顆粒,內(nèi)部具有和模板 分子相互補(bǔ)的基團(tuán),具有"記憶"功能,所以對(duì)模板分子具有很高的特異性和選 擇性。本發(fā)明采用制備的四環(huán)素分子印跡聚合物作為固相萃取小柱的填料可以用 于生物樣品和水溶液中實(shí)際樣品的前處理實(shí)踐,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)干擾檢測(cè)的動(dòng)物基質(zhì) 的去除,富集痕量殘留的四環(huán)素,提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明所述的方法具有特 異性好,容量高的特點(diǎn),回收率大于80%。
      具體實(shí)施方式
      下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實(shí)施,給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限 于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1:一.四環(huán)素分子印跡聚合物的制備將四環(huán)素模板o. lrnmol、功能單體甲基丙烯酸(MAA)、介導(dǎo)印跡的FeS04和交 聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),按l: 1: 4: 20摩爾比混合,溶解到4.5 ml致孔劑(甲醇水=9: l)中,置入安培瓶中,加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰(AIBN) 10mg;超聲5分鐘,然后沖入氮?dú)?分鐘,在氮?dú)獗Wo(hù)下封口, 6(TC水浴24小 時(shí),得四環(huán)素分子印跡聚合物。取出團(tuán)狀聚合物,加入乙醇用玻璃棒攪碎,洗滌 得0.1 1.5ixm顆粒,用丙酮懸浮棄去過(guò)細(xì)微粒。烘干聚合物后,用甲醇(含 10%醋酸)索氏抽提72小時(shí)去除模板,中間每隔8小時(shí)換一次液。脫液經(jīng)HPLC 測(cè)定洗脫完全后,6(TC烘干24小時(shí)備用。二. 四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板,將合成的分子印跡聚合物lOOmg用甲 醇勻漿,填充到聚丙烯固相萃取小柱中,柱體積為3ml,在抽真空狀態(tài)下壓緊填 料,最后加上聚乙烯篩板。三. 應(yīng)用四環(huán)素分子印跡固相萃取小柱純化、富集尿液中的四環(huán)素殘留 先后用l(M乙腈/乙酸/1.0 mol L—' HC1 (8:1:1, v/v/v) , 5ml雙蒸水,lml0.25 mmol L—1 FeS04對(duì)固相萃取柱活化預(yù)處理,注意不要抽干。加入2ml KH2P04 處理后的樣品,用1.5 ml甲醇(80%)淋洗小柱,抽干,然后用3ml乙腈/乙酸 /1.0 mol I/1 HC1 (8:1:1, v/v/v)的混合液洗脫四環(huán)素。洗脫液用0. 22um的濾 器過(guò)濾后,5 mol L—1 NaOH調(diào)節(jié)pH至2.0以上,以氮?dú)獯蹈珊笾匦氯芙庥?00 W流動(dòng)相,取樣品20ul上樣,用HPLC分離樣品并通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)樣品中 四環(huán)素的濃度。本發(fā)明合成的分子印跡聚合物可以特異的識(shí)別四環(huán)素,采用本發(fā)明所述的方 法可以用于含水樣品中四環(huán)素的分離,凈化和富集。對(duì)尿液中添加四環(huán)素 200y g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為90. 9%,對(duì)其它類藥物無(wú)特異性吸附。實(shí)施例2:一. 四環(huán)素分子印跡聚合物的制備-將四環(huán)素模板0. lmmol、功能單體甲基丙烯酸(MAA)、介導(dǎo)印跡的FeS04和交 聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),按l: 2: 6: 20摩爾比混合,溶解到5ml 致孔劑(甲醇水=9: 1)中,置入安培瓶中,加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰(AIBN) 10mg;超聲5分鐘,然后沖入氮?dú)?分鐘,在氮?dú)獗Wo(hù)下封口, 6(TC水浴24小 時(shí),得四環(huán)素分子印跡聚合物。取出團(tuán)狀聚合物,加入乙醇用玻璃棒攪碎,洗滌 得0. 1 L5um顆粒,用丙酮懸浮棄去過(guò)細(xì)微粒。烘干聚合物后,用甲醇(含 10%醋酸)索氏抽提64小時(shí)去除模板,中間每隔8小時(shí)換一次液。脫液經(jīng)HPLC 測(cè)定洗脫完全后,6(TC烘干24小時(shí)備用。二. 四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板,將合成的分子印跡聚合物150mg用甲 醇勻漿,填充到聚丙烯固相萃取小柱中,柱體積為6ral,在抽真空狀態(tài)下壓緊填 料,最后加上聚乙烯篩板。
      三.應(yīng)用四環(huán)素分子印跡固相萃取小柱純化、富集尿液中的四環(huán)素殘留 先后用6ml乙腈/乙酸/l.Omol L_1HC1 (8:1:1, v/v/v), 7ml雙蒸水,1. 5ml 0. 25 mmol L—1 FeS04對(duì)固相萃取柱活化預(yù)處理,注意不要抽干。加入5ml KH2P04 處理后的樣品,用2.0 ral甲醇(80%)淋洗小柱,抽干,然后用2ml乙腈/乙酸 /1.0 mol L—1 HC1 (8:1:1, v/v/v)的混合液洗脫四環(huán)素。洗脫液用0. 22um的濾 器過(guò)濾后,5 mol L—1 NaOH調(diào)節(jié)pH至2. 0以上,以氮?dú)獯蹈珊笾匦氯芙庥?00 W流動(dòng)相,取樣品20ul上樣,用HPLC分離樣品并通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)樣品中 四環(huán)素的濃度。本實(shí)施例效果為,采用本實(shí)施例所述的材料和方法對(duì)尿液中添加四環(huán)素 100u g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為89. 1%,對(duì)其它類藥物無(wú)特異性吸附。 實(shí)施例3:一. 四環(huán)素分子印跡聚合物的制備將四環(huán)素模板O. lmraol、功能單體甲基丙烯酸(MAA)、介導(dǎo)印跡的FeS04和交 聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),按l: 2: 8: 20摩爾比混合,溶解到6ml 致孔劑(甲醇水=9: 1)中,置入安培瓶中,加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰(AIBN) 10mg;超聲5分鐘,然后沖入氮?dú)?分鐘,在氮?dú)獗Wo(hù)下封口, 6(TC水浴36小 時(shí),得四環(huán)素分子印跡聚合物。取出團(tuán)狀聚合物,加入乙醇用玻璃棒攪碎,洗滌 得0.1 1.5um顆粒,用丙酮懸浮棄去過(guò)細(xì)微粒。烘干聚合物后,用甲醇(含 10%醋酸)索氏抽提72小時(shí)去除模板,中間每隔8小時(shí)換一次液。脫液經(jīng)HPLC 測(cè)定洗脫完全后,6(TC烘干24小時(shí)備用。二. 四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板,將合成的分子印跡聚合物100mg用甲 醇勻漿,填充到聚丙烯固相萃取小柱中,柱體積為3ml,在抽真空狀態(tài)下壓緊填 料,最后加上聚乙烯篩板。三. 應(yīng)用四環(huán)素分子印跡固相萃取小柱純化、富集尿液中的四環(huán)素殘留 先后用9ml乙腈/乙酸/l.Omol L_1HC1 (8:1:1, v/v/v), 5ral雙蒸水,1. 2ml0. 25 ramol L—1 FeS04對(duì)固相萃取柱活化預(yù)處理,注意不要抽干。加入10ml KH2P04 處理后的樣品,用1.5 ml甲醇(80%)淋洗小柱,抽干,然后用3ml乙腈/乙酸 /1.0 mol L—1 HC1 (8:1:1, v/v/v)的混合液洗脫四環(huán)素。洗脫液用0. 22um的濾 器過(guò)濾后,5 mol L—1 NaOH調(diào)節(jié)pH至2.0以上,以氮?dú)獯蹈珊笾匦氯芙庥?00
      W流動(dòng)相,取樣品20ul上樣,用HPLC分離樣品并通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)樣品中 四環(huán)素的濃度。本實(shí)施例效果為,采用本實(shí)施例所述的材料和方法對(duì)尿液中添加四環(huán)素 50 w g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為86. 2%,對(duì)其它類藥物無(wú)特異性吸附。 實(shí)施例4:一. 四環(huán)素分子印跡聚合物的制備將四環(huán)素模板0. lmraol、功能單體甲基丙烯酸(MAA)、介導(dǎo)印跡的FeS04和交 聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),按l: 2: 7: 20摩爾比混合,溶解到6.5 ml致孔劑(甲醇水=9: l)中,置入安培瓶中,加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰(AIBN) 10mg;超聲5分鐘,然后沖入氮?dú)?分鐘,在氮?dú)獗Wo(hù)下封口, 60'C水浴24小 時(shí),得四環(huán)素分子印跡聚合物。取出團(tuán)狀聚合物,加入乙醇用玻璃棒攪碎,洗滌 得0. 1 1.5wm顆粒,用丙酮懸浮棄去過(guò)細(xì)微粒。烘干聚合物后,用甲醇(含 10%醋酸)索氏抽提56小時(shí)去除模板,中間每隔8小時(shí)換一次液。脫液經(jīng)HPLC 測(cè)定洗脫完全后,6(TC烘干24小時(shí)備用。二. 四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板,將合成的分子印跡聚合物90mg用甲 醇勻漿,填充到聚丙烯固相萃取小柱中,柱體積為3ml,在抽真空狀態(tài)下壓緊填 料,最后加上聚乙烯篩板。三. 應(yīng)用四環(huán)素分子印跡固相萃取小柱純化、富集尿液中的四環(huán)素殘留 先后用7ml乙腈/乙酸/l.Omol L—'HC1 (8:1:1, v/v/v), 8ml雙蒸水,1. Oml0.25 mraol L—1 FeS04對(duì)固相萃取柱活化預(yù)處理,注意不要抽干。加入10ml KH2P04 處理后的樣品,用1.5 ml甲醇(80%)淋洗小柱,抽干,然后用2ml乙腈/乙酸 /1.0 mol L—1 HC1 (8:1:1, v/v/v)的混合液洗脫四環(huán)素。洗脫液用0. 22um的濾 器過(guò)濾后,5 mol L—1 NaOH調(diào)節(jié)pH至2.0以上,以氮?dú)獯蹈珊笾匦氯芙庥?00 W流動(dòng)相,取樣品20ul上樣,用HPLC分離樣品并通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)樣品中 四環(huán)素的濃度。本實(shí)施例效果為,采用本實(shí)施例所述的材料和方法對(duì)尿液中添加四環(huán)素 40 u g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為85. 3%,對(duì)其它類藥物無(wú)特異性吸附。 實(shí)施例5:一.四環(huán)素分子印跡聚合物的制備 將四環(huán)素模板O. lmmol、功能單體甲基丙烯酸(MAA)、介導(dǎo)印跡的FeS04和交 聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),按l: 1: 8: 20摩爾比混合,溶解到5ral 致孔劑(甲醇水=9: 1)中,置入安培瓶中,加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰(AIBN) 10mg;超聲5分鐘,然后沖入氮?dú)?分鐘,在氮?dú)獗Wo(hù)下封口, 6(TC水浴36小 時(shí),得四環(huán)素分子印跡聚合物。取出團(tuán)狀聚合物,加入乙醇用玻璃棒攪碎,洗滌 得0. 1 1.5um顆粒,用丙酮懸浮棄去過(guò)細(xì)微粒。烘干聚合物后,用甲醇(含 10%醋酸)索氏抽提72小時(shí)去除模板,中間每隔8小時(shí)換一次液。脫液經(jīng)HPLC 測(cè)定洗脫完全后,6(TC烘干24小時(shí)備用。二. 四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱的制備首先用甲醇沖洗固相萃取小柱和篩板,將合成的分子印跡聚合物80mg用甲 醇勻漿,填充到聚丙烯固相萃取小柱中,柱體積為3ml,在抽真空狀態(tài)下壓緊填 料,最后加上聚乙烯篩板。三. 應(yīng)用四環(huán)素分子印跡固相萃取小柱純化、富集尿液中的四環(huán)素殘留 先后用8ral乙腈/乙酸/1. 0 mol L—1 HC1 (8:1: 1, v/v/v) , 8ml雙蒸水,1. Oml0.25 mmol L—1 FeS(X對(duì)固相萃取柱活化預(yù)處理,注意不要抽干。加入10ml KH2P04 處理后的樣品,用1.5 ml甲醇(80%)淋洗小柱,抽干,然后用3ml乙腈/乙酸 /1.0 mol L—1 HC1 (8:1:1, v/v/v)的混合液洗脫四環(huán)素。洗脫液用0. 22um的濾 器過(guò)濾后,5 mol L—l NaOH調(diào)節(jié)pH至2. 0以上,以氮?dú)獯蹈珊笾匦氯芙庥?00 W流動(dòng)相,取樣品20ul上樣,用HPLC分離樣品并通過(guò)紫外檢測(cè)器檢測(cè)樣品中 四環(huán)素的濃度。本實(shí)施例效果為,采用本實(shí)施例所述的材料和方法對(duì)尿液中添加四環(huán)素 20 u g/g標(biāo)準(zhǔn)樣品的回收率為84. 2%,對(duì)其它類藥物無(wú)特異性吸附。
      權(quán)利要求
      1、一種利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素的方法,其特征在于,包括如下步驟第一步,制備四環(huán)素分子印跡聚合物①將模板分子四環(huán)素、功能單體甲基丙烯酸、介導(dǎo)印跡的金屬離子和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯,按模板分子金屬離子功能單體交聯(lián)劑摩爾比=11~5∶2~10∶20,混合溶解到致孔劑中,加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰,混合溶解后,體系置于安培瓶中,充入氮?dú)猓缓笤诘獨(dú)鈿夥障路饪冢?0~70℃熱引發(fā)聚合反應(yīng),其中金屬離子為Mg2+,F(xiàn)e2+,Cu2+中一種;②,將合成的聚合物攪拌分散后,得到粒徑在0.1~1.5μm之間的顆粒,除去微細(xì)的顆粒,最后通過(guò)索氏萃取進(jìn)一步除去模板分子;③,將除去模板分子的聚合物干燥過(guò)夜,獲得四環(huán)素的分子印跡聚合物。第二步,將四環(huán)素分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中,得到四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱;第三步,先后用乙腈、乙酸、HCl、雙蒸水、FeSO4對(duì)四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱活化預(yù)處理,加入KH2PO4處理后的尿樣,經(jīng)過(guò)淋洗四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱,即能洗脫、凈化和收集四環(huán)素。
      2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素 的方法,其特征是,第一步中,所述四環(huán)素和致孔劑的用量為當(dāng)模板分子為 0. lmmol時(shí),致孔劑的體積為4 7ml,其中所述致孔劑為甲醇和水的混合溶液, 甲醇和水體積比為9: 1 3。
      3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素 的方法,其特征是,第一步中,所述索氏萃取,其條件為萃取劑采用甲醇、醋 酸混合液,二者的體積比為9: 1 8: 2,萃取時(shí)間為24 72小時(shí)。
      4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素的方法,其特征是,第二步中,所述的填充到固相萃取柱管,是指用甲醇淋洗聚丙烯固相萃取小柱和篩板,稱量四環(huán)素分子印跡聚合物50mg 150mg,用乙醇 勻漿后,填充于商品化的l m1 6 ml聚丙烯固相萃取小柱內(nèi)。
      5、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四 環(huán)素的方法,其特征是,所述的填充到固相萃取柱管,是在抽真空狀態(tài)下,將勻 漿液裝入聚丙烯固相萃取小柱,填料的頂端和底端分別裝上聚乙烯篩板。
      6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素 的方法,其特征是,所述的篩板,其孔徑為0.5 um。
      7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素 的方法,其特征是,第三步中,所述的對(duì)四環(huán)素分子印跡聚合物固相萃取小柱活 化,是指用5 10ml乙腈、乙酸、HC1 , 5 10ml雙蒸水,1 2mlFeS04對(duì)四環(huán) 素分子印跡聚合物固相萃取小柱預(yù)處理,其中乙腈、乙酸、HC1體積比為8:1:1, HC1濃度為1.0 mol L1, FeS04濃度為0. 25 ramol L—1 。
      8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素 的方法,其特征是,第三步中,所述的加入KH2P04處理后的尿樣,是指9ml尿液 用約lml的0. 2 mol L-1朋2 04處理后,加入其中的1 10ml。
      9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素 的方法,其特征是,第三步中,所述的淋洗,是指用1 3 ml的體積濃度為80% 的甲醇淋洗固相萃取柱。
      10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素 的方法,其特征是,第三步中,所述的洗脫,是指用2 3ml乙腈、乙酸、HC1 的混合液,乙腈、乙酸、HC1體積比為8:1:1,其中HCl濃度為l.O mol L—'。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的利用分子印跡聚合物直接凈化含水樣品中四環(huán)素的方法,步驟為將模板分子四環(huán)素、功能單體甲基丙烯酸、介導(dǎo)印跡的金屬離子和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯混合溶解到致孔劑中,加入引發(fā)劑,封口,將合成的聚合物攪碎后,除去微細(xì)的顆粒,通過(guò)萃取除去模板分子,將除去模板分子的聚合物干燥過(guò)夜,獲得四環(huán)素的分子印跡聚合物;將四環(huán)素分子印跡聚合物填充到固相萃取柱管中;對(duì)固相萃取柱活化和預(yù)處理,加入KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>處理后的尿樣,經(jīng)過(guò)淋洗固相萃取柱,即洗脫、凈化四環(huán)素。本發(fā)明具有高選擇性、高特異性、耐不良環(huán)境和能夠直接在水環(huán)境中使用的優(yōu)點(diǎn)。
      文檔編號(hào)C02F1/58GK101397163SQ20081020264
      公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
      發(fā)明者張大兵, 武愛(ài)波, 瞿國(guó)潤(rùn) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)
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