專利名稱：一種基于基因強化與細胞強化耦合的生物強化新方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于基因強化與細胞強化耦合的生物強化新方法，可達到污染系統(tǒng)或生物 反應器中目標污染物的高效穩(wěn)定去除，屬于環(huán)境保護與資源綜合一水污染防治領域。
背景技術：
生物強化(Bioaugmentation)技術是通過向污染系統(tǒng)中投加具有特殊代謝功能的微生物， 來促進目標污染物降解的一種方法。該方法在難降解有機污染物治理中具有獨特的優(yōu)越性和 廣泛的應用前景。從發(fā)生機制上分，生物強化可分為細胞強化(Cell augmentation)和基因強 化(Gene-augmentation)。細胞強化是利用微生物細胞本身的代謝功能對環(huán)境污染物直接進行 分解，基因強化則向系統(tǒng)中引入編碼特殊降解功能的可移動基因片斷(Mobile genetic dements, MGES),通過基因片斷在微生物細胞間的水平轉移和擴散，使固有菌群獲得特殊降解功能， 進行目標污染物的分解。
傳統(tǒng)意義上的生物強化技術主要指細胞強化。從自然界篩選或通過基因工程方法構建高 效降解菌，擴大培養(yǎng)后加入到污染系統(tǒng)或反應器中，以達到改善系統(tǒng)性能或強化污染物去除 的目的。由于采用細胞強化投加的高效菌多為外源微生物，高效菌投加到污染系統(tǒng)后往往會 因無法適應實際環(huán)境而喪失活性或代謝功能，或對原系統(tǒng)微生物菌群平衡產生較大破壞作用。 如Bouchez等向硝化反應器加入好氧脫氮菌Mkrovi;^/fl flero血""n力ca"j,以期達到同時硝 化反硝化的目的。加入6.6%好氧脫氮菌時，只是收到了短暫的脫氮效果，當4天后再次加入 37.1%好氧脫氮菌，投菌量過大破壞了原來生態(tài)系統(tǒng)的平衡，導致原生動物生長過多和硝化效 果的波動。Ghyoot等向傳統(tǒng)活性污泥系統(tǒng)加入降解3-氯代苯甲酸(3-CBA)的純菌 ftewrfowowwp^WaBN210，因其適應實際環(huán)境能力差而無法發(fā)揮促進3-CBA的降解的作用。 基因強化是通過可移動基因片斷的水平轉移而促使強化系統(tǒng)中固有菌群產生特殊降解能 力，它是對固有菌群基因組進行原位修飾的一種方法，與細胞強化相比，其優(yōu)點在于(1) 基因強化過程中，供體細胞只是作為基因載體，故對供體細胞的環(huán)境適應和存活能力的要求 比較低；(2)基因強化過程一般以固有菌群作為基因受體細胞，固有菌本身具備良好的環(huán)境 適應和生存能力，其數量和活性易于在系統(tǒng)中保持；而細胞強化所采用的外源微生物往往適 應污染環(huán)境能力比較差。
早在1994年，DeRore等以攜帶質粒RP4::Tn4371的五"fera6acfer agg/omerara ￡>iG菌為供 體細胞，證實了質粒水平轉移對土壤中聯(lián)苯的強化降解作用。后來'雖然許多研究人員嘗試了不同質粒介導下基因強化對土壤系統(tǒng)、活性污泥及生物膜反應器中目標污染物的強化降解 效應。但總體看來,基因強化用于環(huán)境污染物去除的效應并不十分穩(wěn)定。如Bathe研究了 SBBR 系統(tǒng)攜帶pJP4質粒的基因工程菌對2，4-D的強化降解效應。發(fā)現(xiàn)投加工程菌后以2,4-D為唯 一碳源按8h/周期運行了 8d，期間基因強化效果并不顯著，隨后以卯h/周期運行2個周期， 基因強化效果才顯示出來；Bathe以攜帶pNB2質粒的基因工程菌/^eW0OT0"aj pW必pA^2 為供體菌，以半連續(xù)流實驗研究了質粒介導下基因強化對目標污染物3-氯苯胺的降解效應， 發(fā)現(xiàn)在運行前期幾乎無強化效果。但Yarlagadda研究了質粒TOL介導對好氧顆粒污泥強化降 解目標污染物苯乙醇的效應，發(fā)現(xiàn)連續(xù)九個反應周期強化體系對苯乙醇的去除效率均比對照 體系高70%。分析以上基因強化效應不穩(wěn)定的原因有直接向反應系統(tǒng)投加攜MGEs的供體 菌，受到反應運行條件和微生物自身特性限制，基因水平轉移效率較低，在短時間內很難形 成大量對目標污染物具有降解作用的接合子，阻礙的基因強化作用的發(fā)揮。
綜上分析，細胞強化雖然具有啟動快、效率高等特點，但高效菌篩選時間長、難度大、實 際環(huán)境適應能力差，投加后對系統(tǒng)固有菌群平衡影響大?；驈娀峭ㄟ^向污染系統(tǒng)中投加 攜帶可移動基因片斷的功能微生物并通過基因水平轉移使固有微生物獲得特殊降解功能，促 進目標污染物的降解。這種方法雖然一定程度上克服了細胞強化過程外源高效菌環(huán)境適應能 力差的問題，但由于可移動基因片斷在反應系統(tǒng)內水平轉移的效率有限，基因強化往往存在 效應滯后、不顯著等問題。鑒于細胞強化或基因強化單獨應用存在的不足，有必要通過細胞 強化與基因強化技術耦合，開發(fā)高效穩(wěn)定的生物強化新方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提出一種生物強化新方法，它將細胞強化與基因強化技術有效耦合， 克服了細胞強化中存在的高效菌篩選時間長、難度大、適應實際環(huán)境能力差的缺點，以及基 因強化應用效果滯后、不穩(wěn)定等問題，具有操作簡單，見效快，效果穩(wěn)定等優(yōu)點。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的方案是以攜帶可移動功能基因片斷(MGEs)的微生物 作為供體菌，從擬實施生物強化系統(tǒng)中取微生物樣品作為受體菌，通過系統(tǒng)外預接觸雜交反 應，形成接合子將雜交后的微生物混合液進行選擇性富集培養(yǎng)，獲得對目標污染物具有高 效降解性能的接合子細胞及其它微生物，然后以其為菌源發(fā)酵培養(yǎng)制備成高效菌劑；最后將 一定量高效菌劑按一定方式投加到擬實施生物強化的系統(tǒng)中'以達到系統(tǒng)目標污染物強化去 除的目的。
供體菌攜帶的可移動基因片斷包括質粒、轉座元件及其它可移動基因片斷'基因片斷上 含有編碼目標物降解的完整的功能基因簇；生物樣品取自擬開展生物強化的污染系統(tǒng)(如土壤、水體)或生物反應器。
生物樣品與基因供體菌系統(tǒng)外預接觸雜交方法具體為以營養(yǎng)培養(yǎng)基對供體菌進行擴大
培養(yǎng)，然后進行離心洗滌、收集，配成菌懸液；將生物樣品(土壤、沉積物或污泥)經多次
離心洗滌后配成懸濁液將供體菌與生物樣品按1/10-1/1 (質量比)混合，在25-35'C下振蕩 雜交反應6—24h (懸浮雜交)，期間補充一定量的目標污染物作為選擇壓力，同時添加一定 量易利用的有機營養(yǎng)物(如葡萄糖，乙酸鈉等)作為補充碳源；也可將供體菌與生物樣品的 混合液過濾到濾膜上，將濾膜取出放置營養(yǎng)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6—24h (濾膜雜交)，最后將 濾膜上的微生物洗脫到滅過菌的無機鹽培養(yǎng)基中。
雜交完成時雜交液中接合子數量較少，雜菌較多，需要進一步選擇性富集培養(yǎng)，具體方 法為將雜交反應液離心、洗滌后重懸于以一定量的目標污染物為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)36—96h。
高效降解菌的發(fā)酵培養(yǎng)與菌劑制備從經過選擇性富集培養(yǎng)的反應液中接種一定量的菌
液到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24—48h,離心收集菌體制備成干菌劑或液態(tài)菌劑。
高效菌劑的生物強化投加向擬進行生物強化的系統(tǒng)中直接或間接(如固定化)投加5 % —30%高效菌劑，即可達到強化降解目標污染物的目的。
有益效果
(1) 本發(fā)明提出了利用攜帶可移動基因片斷的基因供體菌與擬實施生物強化系統(tǒng)的微生 物樣品雜交反應獲得高效降解菌菌源的方法，豐富了高效菌獲取途徑，與從自然界 篩選髙效微生物的方法相比，具有簡單，快捷，獲取的菌株環(huán)境適應性強等優(yōu)點--
(2) 利用本發(fā)明提出的基于基因強化與細胞強化耦合的生物強化方法進行污染物強化降 解時，菌種投加量要比傳統(tǒng)生物強化方法降低10—20%，并可獲得更加高效、穩(wěn)定 的生物強化效果。


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圖1生物膜反應器內2,4-D的生物強化降解效應
圖2模擬河流沉積物系統(tǒng)內2，4-D的生物強化降解效應
具體實施例方式
(1) 將攜帶可移動功能基因片斷的微生物預培養(yǎng)到對數增長期后，離心收集菌體并用無菌 磷酸鹽緩沖溶液洗滌2 — 3次，最終重懸于無機鹽培養(yǎng)基中，制備供體菌菌懸液；
(2) 從擬進行生物強化系統(tǒng)中取微生物樣品作為基因強化的受體菌，如果樣品中微生物數量較低，可預先擴培；如果微生物濃度較高，則可直接經離心、洗滌后用無菌磷酸鹽緩 沖溶液配成菌懸液；
(3) 取供體菌和受體菌菌懸液，按照質量比1/10-1/1混合，在25 — 30'C下振蕩培養(yǎng)6—24h 進行懸浮雜交，或供受體菌混合后過濾到聚碳酸脂濾膜上，將濾膜置于營養(yǎng)平板培養(yǎng)基 上進行膜面雜交；
(4) 將雜交后的培養(yǎng)液以選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)36—96h，淘汰對目標污染物不具有降解功能 的微生物，選擇性富集具有降解功能的接合子及其它微生物；然后再以其為接種液進行 高效菌的發(fā)酵培養(yǎng)，并制備高效菌劑；
(5) 將上述高效菌劑按照5% —30%比例(投加菌/同有菌，質量比)投加到擬進行生物強 化的污染系統(tǒng)或生物反應器中，接觸12h后即可開始正常的運行階段。
實例1活性污泥反應器中2,4-D的生物強化降解
2，4-二氯苯氧基乙酸是一種難降解有機污染物，普通活性污泥法對其降解效率較低。為了 強化活性污泥系統(tǒng)對該物質的去除，采用了本發(fā)明中基于基因強化與細胞強化耦合的生物強 化新方法。具體如下
(1) 以攜帶質粒pJP4 (其上含編碼2,4-D降解功能的基因簇(押))的基因工程菌/^Wowo"似
SM1443::g^&(pJP4::dsRed)為供體菌，以LB營養(yǎng)培養(yǎng)基將該菌擴大培養(yǎng)36h,然后離心 收集菌體，并以無菌磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，最后制成菌懸液；
(2) 從活性污泥反應器中取一定量的污泥，按照上述方法離心洗滌菌體，也以無機鹽培養(yǎng)基 制備成菌懸液；
(3) 雜交反應取供體菌和活性污泥菌懸液，按照l: 1 (質量比)加入到錐形瓶內，同時加 入2,4-D作為碳源(初始濃度為50mg/L)， 30'C， 150r/min下振蕩反應12h;
(4) 選擇性富集培養(yǎng)雜交結束后，將雜交反應液沉淀，棄上清，再次補充含2， 4-D的新鮮 無機鹽培養(yǎng)液，30°C, 150r/min下繼續(xù)培養(yǎng)50h;
(5) 高效菌的發(fā)酵培養(yǎng)從經過選擇性富集培養(yǎng)的反應液中接種lmL菌懸液到LB培養(yǎng)基中， 30°C， 150r/miii下培養(yǎng)36h，離心收集菌體并將其配成2,4-D降解高效菌劑；
(6) 高效菌投加強化活性污泥系統(tǒng)將高效菌劑按10%投加量直接投加到活性污泥系統(tǒng)，接 觸反應6h，開始連續(xù)流運行，2，4-D初始濃度為400mg/L，生物強化系統(tǒng)啟動期縮短13h，去除 速率提高368%，高效菌能夠在系統(tǒng)中得到穩(wěn)定保持。
實例2生物膜反應器內2,4-D的生物強化降解以基因工程菌/^ewab/wwKM;wricfa SM1443::她2c(pJP4::dsRed)為供體菌，經擴大培養(yǎng)、離心洗 滌后制備成菌懸液；取一定量活性污泥，將基因工程菌按10%投菌量加入到活性污泥中，同 時加入400mg/L 2,4-D并以半連續(xù)流方式進行選擇性富集培養(yǎng)；培養(yǎng)過程取微生物樣品，用 2,4-D為唯一碳源的抗性平板篩選到能高效降解2，4-D的接合子。將接合子細胞以LB培養(yǎng)基擴 大培養(yǎng)后，直按10%接投加到某一含懸浮填料為載體的生物膜反應器中。對于初始濃度約為 180 mg/L的2,4-D，強化系統(tǒng)在44h可將初始濃度約為180 mg/L的2,4-D降解完全，而對照系統(tǒng) 經過115對其去除率僅為75% (如圖l)。
實例3污染水體沉積物中2，4-D的生物強化降解
污染水體(河流及湖泊)中難降解有機物的去除受到普遍關注，尤其是對于寒冷季節(jié)北方地 表水中有機物的去除。通過基因水平轉移獲得2,4-D降解高效菌，對其擴大培養(yǎng)后投加到河流 沉積物中，也可促進2,4-D的降解。具體方法如下取一定量河流沉積物，加入無菌磷酸鹽溶 液，混合，然后按照供體菌沉積物-l: 10向沉積物中加入攜帶質粒pJP4的供體菌，3(TC， 150r/min條件下接觸反應48h，通過含抗性和2,4-D為唯一碳源的選擇性平板篩選到對2,4-D具 有強降解能力的接合子；接合子采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)36h后，離心收集，并向沉積物中投加4% 的接合子；在反應溫度為7'C, 2，4-D初始濃度為4.5mg/L條件下，生物強化系統(tǒng)2,4-D不經延滯 期即開始降解，40d得到完全去除，而對照系統(tǒng)經過約32d延滯期后才開始降解，50d后得到全 部去除(如圖2)。
權利要求
1.一種基于基因強化與細胞強化耦合的生物強化新方法，其特征在于(1)以攜帶可移動功能基因片斷的微生物為供體菌，擬實施生物強化的污染系統(tǒng)或生物反應中的土著微生物為受體菌，通過系統(tǒng)外的預接觸雜交反應產生接合子；(2)從雜交后菌液中選擇性富集培養(yǎng)對目標污染物具有高效降解性能的接合子及其它微生物，制備成高效菌劑。(3)向擬實施生物強化的污染系統(tǒng)或生物反應中按照一定方式投加一定量的該高效菌劑，以達到目標污染物強化去除的目的。
2. 根據權利要求1所述的可移動基因片斷，包括質粒、轉座元件及其它可移動基因片斷；
3. 根據權利要求1所述的預接觸雜交反應，可采用懸浮雜交和膜面雜交兩種方式，雜交時供 受體菌比例為1/10-1/1,雜交時間6—24h。
4. 根據權利要求1所述的高效菌選擇性富集培養(yǎng)方法，具體為將雜交后的菌懸液以一定量 的目標污染物為唯一選擇壓，培養(yǎng)36—96h，再以其為菌源采用營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)24—48h。
5. 根據權利要求l所述的向污染系統(tǒng)投加高效菌的方法，可采用直接投加或固定化投加的方 式，投加量為5—30%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于基因強化與細胞強化耦合的生物強化新方法。首先，以攜帶可移動功能基因片斷的微生物為供體菌，以擬實施生物強化系統(tǒng)內的固有微生物為受體菌，通過預雜交反應及選擇性富集培養(yǎng)，獲得對目標污染物具有高效降解性能的接合子及其它微生物；再以其為生物強化的菌源，通過發(fā)酵培養(yǎng)制備高效菌劑；向擬實施生物強化的污染系統(tǒng)中按一定方式投加5％-30％(投加菌與固有菌質量比)高效菌劑，即可達到強化污染物去除的目的。本發(fā)明與傳統(tǒng)生物強化方法相比，具有高效菌源易得、環(huán)境適應性強，菌劑投加量少，對固有系統(tǒng)菌群結構影響小，見效快，效果穩(wěn)定等優(yōu)點。
文檔編號C02F3/34GK101549911SQ20091000054
公開日2009年10月7日 申請日期2009年1月16日 優(yōu)先權日2009年1月16日
發(fā)明者何孟常, 全向春, 楊志峰, 林春野, 華 湯 申請人:北京師范大學