專利名稱：一株纖維素降解菌株lcd51的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖維素降解微生物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素是自然界中最豐富的碳水化合物，是一類可再生的重要資源和能源。纖維素不 溶于水，在環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、難降解，并廣泛存在于農(nóng)作物秸稈、城市固體廢物、畜禽養(yǎng) 殖廢棄物和造紙廢水中，是難降解污染物之一。目前，從環(huán)境中分離和選育纖維素酶高產(chǎn) 菌株，挖掘纖維素酶產(chǎn)生菌的資源，利用微生物的酶解作用，解決環(huán)境污染問題，甚至轉(zhuǎn)化 為能源已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株纖維素降解菌株LCD51的應(yīng)用，能去除畜禽養(yǎng)殖廢水中的 纖維素。
本發(fā)明所提供的纖維素降解菌株LCD51，為水氏黃桿菌(F/aw6a"en'wm m/zwto//) LCD51 CCTCC NO: M 209100，已于2009年5月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)， 保藏號CCTCC N0:M 209100。
一株纖維素降解菌株LCD51的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為水氏黃桿菌 (F/avo6acfen'wm m/zwto//) LCD51 CCTCC N0:M 209100應(yīng)用于含纖維素廢水(含有纖維素 的廢水，纖維素的濃度為300-500mg/L)的處理中。
所述的水氏黃桿菌(M"w6a"m'wm w/^to'0 LCD51 CCTCC N0:M 209100應(yīng)用于含纖 維素廢水的處理方法為挑取水氏黃桿菌(尸/aw)&a"en'ww OT/zwto//) LCD51單菌落，于LB 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的水氏黃桿菌(F/avo6acfen'wm/m'zwtoz'Z) LCD51:含纖維 素廢水(如畜禽養(yǎng)殖廠廢水)的體積比為0. 5-2: 100取水氏黃桿菌(Mavo6a"m'Mw mfewto//) LCD51接種于含纖維素廢水(如畜禽養(yǎng)殖廠廢水)中，30-35'C恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反 應(yīng)48-72小時(shí)。
所述的LB固體培養(yǎng)基為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000mL，瓊脂15g (固)，pH7.0。
所述的畜禽主要有豬、牛、羊、馬戶、兔、雞、甲鳥、鵝等。
本發(fā)明的有益效果是從畜禽養(yǎng)殖場排污口的池底污泥中(取自湖北省鄂州市市郊某種 豬養(yǎng)殖場排污口的池底污泥)篩選到一株在纖維素條件下具有一定生長能力的新菌株。一 株纖維素降解菌株LCD51有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力；能在72小時(shí)之內(nèi)去 除廢水中的纖維素21-28mg/L。


圖1是纖維素降解菌株LCD51的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1:核DNA， 2:擴(kuò)增產(chǎn)物，3: Marker)。
圖2是纖維素降解菌株LCD51的電鏡圖片。 圖3是纖維素降解菌株LCD51的纖維素酶活數(shù)據(jù)圖。
具體實(shí)施例方式
—、 一株纖維素降解菌株LCD51的篩選方法
'(一)、材料準(zhǔn)備-1 、實(shí)驗(yàn)廢水和池底污泥取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口 。
32、 培養(yǎng)基
篩選培養(yǎng)基(g/L): Na2HP043.0， NH4N030. 8， MgS04 7H20 0. 1 ， CaCl20. 1， CMC-Na2. 0， 微晶纖維素粉l.O，濾紙2.0，稻草2.0， pH值7.0 7.2。
產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L): Na2HP043.0， N,30.8， MgS04 7H20 0. 5， CaCl20.5， FeS04 7H20 0.01， MnS04 H20 0. 01， ZnS04 0. 01， CMC-Na 10. 0 (或微晶纖維素粉5. 0或纖維二糖5. 0)， 蛋白胨1.0，酵母提取物0.5， pH值7.0 7.2。
LB液體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨10. Og，酵母提取物5. Og， NaCl 10. Og，蒸餾水 lOOOmL， pH7.0。
LB固體培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g, NaC110.0g，蒸餾水 lOOOmL，瓊脂15g， pH7.0。
LB斜面培養(yǎng)基(g/L)為蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 lOOOmL,瓊脂20g (固)，pH7. 0。
3、 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備 國華SHA-B恒溫振蕩器， SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，
臥式壓力蒸汽滅菌器------上海醫(yī)用核子儀器廠，
光學(xué)顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH計(jì)等-----Hana有限公司，
超凈工作臺， 鼓風(fēng)干燥箱，
KYKY-1000B掃描電子顯微鏡， PTC200型PCR儀， 電泳儀及電泳槽， UVP凝膠紫外觀測儀，
微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑廠，DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自 美國Promega公司、酶、dNTP、 DNAMarker、 酶均購自日本Takara公司。
(二)、菌株的篩選分離與純化
1) 、初篩①稱取1克畜禽養(yǎng)殖場排污口的池底污泥樣品(樣品為池底污泥，取自湖 北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口)，用20mL無菌水水洗，8000 離心5 min，棄上 清，再加20mL水，重懸土樣；重懸后再加20mL水離心(8000rpm離心5min)，棄上清， 重懸土樣，此步驟重復(fù)操作3次，得到泥水混合物，備用；
② 將泥水混合物轉(zhuǎn)入裝有100mL篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，3(TC恒溫靜至培養(yǎng) 至培養(yǎng)基渾濁，得到菌懸液A;
③ 取5 mL菌懸液A于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周；將 培養(yǎng)一周后的菌懸液取5 mL于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周， 重復(fù)操作5-6次，最后得到的菌懸液B;
④ 將最后得到的菌懸液B中取20 于LB平板上涂布；置30。C下恒溫培養(yǎng)1-3天， 挑取長勢良好、菌落形態(tài)各不相同的菌落，經(jīng)2-5次純化后{純化用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng) 物(LB平板上的菌落)少許在平板上進(jìn)行劃線；當(dāng)接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基表面上往后移 動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì) 胞長成一個(gè)菌落，即得到純化后的單菌落}，得到待鑒定的菌落，保種備用。
2) 、 二次篩選將待鑒定的菌落經(jīng)前培養(yǎng)后在LB液體培養(yǎng)基中隔夜培養(yǎng)后，點(diǎn)種到篩 選培養(yǎng)基平板上，30。C恒溫培養(yǎng)2~4 d，往培養(yǎng)皿中加入30mL的1 mg/mL的剛果紅溶液， 染色lh，棄去染液，加入50mL的1 mol/L的NaCl溶液,洗滌1 h，若菌落的周圍會(huì)出現(xiàn)清
4晰的透明圈，說明細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶，依據(jù)透明圈的直徑大小選擇直徑大的產(chǎn)酶菌株。
用接種針挑取直徑大的產(chǎn)酶菌株(在菌落特征上有明顯差異的單菌)，對挑取的產(chǎn)酶菌
株在LB平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至獲得單一菌株，并于LB斜面培養(yǎng)基上劃線保種，得到
一株菌株LCD51，即纖維素降解菌株LCD51。 二、纖維素降解菌株LCD51的鑒定
1、對纖維素降解菌株LCD51的鑒定
對纖維素降解菌株LCD51進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rRNA分子的鑒定，從分子水
平確定纖維素降解菌株的種屬。
16S rRNA序列分析主要按照以下步驟
1) 提取細(xì)菌核DNA，
a) 集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于JB液體培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)，取其菌 懸液lmL于1.5mL的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。
b) 加STE緩沖液lmL洗一次，振蕩重懸細(xì)菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
c) 加600 nLTE緩沖液，劇烈振蕩重懸細(xì)菌，加入10%的SDS 65pL， 65t:水浴5-10min。
d) 加等體積酚氯仿抽提三次。
e) 小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3MNaAc， 12000 rpm離心10min。 徹底棄上清。
f) DNA沉淀用70%乙醇洗一次，風(fēng)千后溶于20pL TE緩沖液備用。
TE緩沖液lO腿ol /L Tris-Cl (pH8.0); l腿ol /L EDTA-Na2 (pH8. 0)， STE緩沖液0. lmol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl (pH8.0) l腿ol/L EDTA (p朋.O)，
2) 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增，
PCR擴(kuò)增引物參照Weisburg等人的方法合成。 Pl:正向引物5， AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3， P2:反向引物5， GGTTACCTTGTTACGACTT3， 在50|aL反應(yīng)體積中，加入lnL模板DNA (0. l叫)，0. 5|_iL Pl和P2 (終濃度為0. 5一)， lpLdNTP (每種NTPO. 2 mM)， 0. 5)aLTaq聚合酶(2 U)禾n 5 IOXPCR緩沖液。PCR擴(kuò)增 條件為94 。C預(yù)變性5 min;在94 。C變性30s， 61-65 。C退火30s， 72 。C延伸lmin， 循環(huán)30次；最后72 。C終延伸10 min。
3) PCR產(chǎn)物的回收
將PCR產(chǎn)物以1X瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放 入1. 5mL離心管中加2倍體積TE， 65'C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取 上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍體積的10rnol/L乙酸銨和2倍 體積無水乙醇沉淀，離心，用70%乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。
4) 16S rDNA的全序列測定和分析
PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。 P-f: CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC; P-r: GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC 。 加入liaL模板DNA (<0. lpg)， PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94 °C 1 min， 55 °C 30s， 72 。C 2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373 A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，
最終從分子水平上確定該菌的種屬。 2、 16S rRNA序列測定 本發(fā)明采用對16SrRNA序列測定和分析的方法對細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的 核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1421bp的擴(kuò)增帶(用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1所不。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定 其全序列。
<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢) <120>—株纖維素降解菌株LCD51的應(yīng)用 <160〉1421
<210>1
<211〉1421bp
<212〉DNA
<213>水氏黃桿菌(F/(2TO6a"en'ww附/zwto//) <400>1
AGCGGCAGGCCTAATACATGCAAGTCGGACGGGATCCATCGGTAGCTTGCTACCGATGGT60
GAGAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGAGCAACCTACCCATATCAGGGGGATAGCCCG120
AAGAAATTCGGATTAACACCGCATGACACTGCTTTCCGGCATCGGGAGGTGGTCAAATAT180
TCATAGGATATGGATGGGCTCGCGTGACGTTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAA240
GGCGACGATGTCTAGGGGCTCTGAGAGGAGAATCCCCCACACTGGTACTGAGACAGGAAC300
CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGTCAATGGGGGCAACCCTGAACCAA360
CCATGCCGCGTGCAGGACGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGTTAGGGAATAM420
CCCCGCTACGTGTAGCGGGCTGAATGTACCTAAAGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCC480
AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTG540
CGTAGGCGGCACTTTAAGTCAGGGGTGAAATACGGCAGCTCAACTGTCGCAGTGCCCTTG600
ATACTGMGTGCTTGAATGCGGTTGAAGACGGCGGAATGAGACAAGTAGCGGTGAAATGC660
ATAGATATGTCTCAGAACACCGATTGCGAAGGCAGCTGTCTAAGCCGTTATTGACGCTGA720
TGCACGAAAGCGTGGGGATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTMACGA780
TGATGACTCGATGTTTGCGATATACCGTAAGCGTCCAAGCGAAAGCGTTAAGTCATCCAC840
CTGGGGAGTACGCCCGCAAGGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG■
AGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAAAGTTACT960
GAAGGGCGCAGAGACGCGCCCGTCCTTCGGGACAGGAAACTAGGTGCTGCATGGCTGTCG1020
TCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATGTTTAG1080
TTGCCAGCACGTCAAGGTGGGGACTCTAAACAGACTGCCTGCGCAAGCAGAGAGGAAGGC1140
TGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGCTACAATGGA1200
TGGTACAGCGGGCAGCTACACAGCAATGTGATGCCAATCTCGAAAAGCCATTCACAGTTC1260
GGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTAGGATTCGCTAGTAATCGCGTATCAGCA1320
ATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGAAAGCTG1380
GGGGTACCTAAAGCATGAAACCGCAAGGAGCGTGTTAGGGT1421
三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性
菌株LCD51的菌落形態(tài)菌落呈橘紅色、不透明、圓形、表面光滑，中心凸出、邊緣 整齊；生理特征細(xì)菌呈規(guī)則的直桿狀，單個(gè)或成對排列，常呈V形排列，蘋蘭氏陰性， 運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧，不產(chǎn)生氧化酶和接觸酶。最適生長pH值6.5 7.5，最適生長溫度25 35°C，不能在6(TC生長。同時(shí)對菌表觀也做了掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖2。
6四、菌株LCD51為新的菌株
采用BLAST分析法對菌株LCD51的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)， 菌株LCD51與水氏黃桿菌(FtowZwcfen'wwwfewtoz7)的同源性高達(dá)99. 0%。
綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，菌株LCD51命名為水氏黃桿菌(Maw^cfen'wm m/^to/O LCD51。查閱有關(guān)資料，尚水氏黃桿菌屬有關(guān)畜禽養(yǎng)殖廢水中降解纖維素能力研究 的報(bào)道。水氏黃桿菌(F/avo6a"m'ww mfzwto'0 LCD51為新的菌株，已于2009年5月6日 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC N0:M 209100。
本發(fā)明從湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口的池底污泥(沉積底泥)中篩選分離 出這一株細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解纖維素養(yǎng)殖廢水的功能。這拓寬了人們對水氏黃桿菌 (尸/m;o&故n'鵬在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含纖維素畜禽養(yǎng)殖廢水 提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
五、菌株LCD51的應(yīng)用
(一)、挑取水氏黃桿菌(Maw6"cfeWww w/^to7) LCD51單菌落，于LB固體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的水氏黃桿菌(F/aw6a"en'wm mfewtofZ) LCD51:含纖維素廢水(如 畜禽養(yǎng)殖廠廢水)的體積比為0.5-2: 100取水氏黃桿菌(尸/aw6acren'MOT /m'zwto//) LCD51 接種于含纖維素廢水(如畜禽養(yǎng)殖廠廢水，即實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng) 殖場排污口)中，30-35。C恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反應(yīng)48-72小時(shí)。
所述的LB固體培養(yǎng)基為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸餾水 1000mL，瓊脂15g (固)，pH7.0。
(二)、菌株LCD51產(chǎn)纖維素酶的能力
纖維素是大分子的聚集，由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)交錯(cuò)而成。將天然纖維素分解，必須依 靠內(nèi)切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG)三種酶協(xié)同作用 才能完成。為了考察菌株對纖維素的降解能力，研究了在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，細(xì)菌生產(chǎn)三種酶 的能力。取產(chǎn)酶培養(yǎng)基100mL加入250ml的錐形瓶中，加入菌株LCD51的菌懸液(菌懸液 配希"用接種環(huán)挑取LCD51菌落于10mL LB液體培養(yǎng)基中，30'C震搖培養(yǎng)12小時(shí))lmL， 加入含纖維素廢水(實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口) 100mL (纖維 素的濃度為300-500mg/L)， 3CTC、震搖培養(yǎng)一周，檢測各種酶活(見圖3)。結(jié)果表明。該 菌株在一周內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纖維二糖酶(BG) 三種酶酶活可分別達(dá)到16. 0， 4. 0， 16.1 U/mL。
為了考察該菌株在實(shí)際處理畜禽養(yǎng)殖廢水的中降解纖維素的能力，研究了該菌株投加到 畜禽養(yǎng)殖廢水厭氧反應(yīng)器中，纖維素的降解效率。在長期(穩(wěn)定運(yùn)行三個(gè)月以上)穩(wěn)定運(yùn) 行的反應(yīng)器中加入菌株LCD51的菌懸液(菌懸液配制用接種環(huán)挑取LCD51菌落于10mL LB 液體培養(yǎng)基中，3CTC震搖培養(yǎng)12小時(shí))10mL，反應(yīng)器中含纖維素廢水(實(shí)驗(yàn)廢水，取自湖 北省鄂州市市郊某種豬養(yǎng)殖場排污口)為1000mL (纖維素的濃度為300-500mg/L)， 3(TC、 靜止一周，再穩(wěn)定運(yùn)行30天，在反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行期間定期檢測纖維素的去除效率，與未投 加該菌株的對照反應(yīng)器對比，結(jié)果表明，該菌株能在72小時(shí)之內(nèi)去除廢水中的纖維素 21-28mg/L;該菌株能使該反應(yīng)器處理纖維素的去除效率提高7-10%(原始處理率為65-70%， 加入菌株LCD51后處理率為72-80%)。
權(quán)利要求
1.一株纖維素降解菌株LCD51的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51 CCTCC NOM 209100應(yīng)用于含纖維素廢水的處理中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株纖維素降解菌株LCD51的應(yīng)用，其特征在于所述的水 氏黃桿菌(F/"w^"en'ww m/zwto/O LCD51 CCTCC N0:M 209100應(yīng)用于含纖維素廢水的處 理方法為挑取水氏黃桿菌(F/aw6acten'ww mfewto//) LCD51單菌落，于LB固體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的水氏黃桿菌(F/m;o6acfen'wm w/2wto7) LCD51:含纖維素廢水的體積 比為0.5-2: 100取水氏黃桿菌(HawZ^"en'wm脂'zwto7) LCD51接種于含纖維素廢水中， 30-35。C恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反應(yīng)48_72小時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一株纖維素降解菌株LCD51的應(yīng)用，其特征在于所述的LB 固體培養(yǎng)基為蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaCl 10.0g，蒸餾水1000mL，瓊脂 15g， pH7.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種纖維素降解微生物的應(yīng)用。一株纖維素降解菌株LCD51的應(yīng)用，其特征在于所述菌株的應(yīng)用為水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51 CCTCC NOM 209100應(yīng)用于含纖維素廢水的處理中。具體處理方法為挑取水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51單菌落，于LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的水氏黃桿菌(Flavobacteriummizutaii)LCD51∶含纖維素廢水的體積比為0.5-2∶100取水氏黃桿菌(Flavobacterium mizutaii)LCD51接種于含纖維素廢水中，30-35℃恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反應(yīng)48-72小時(shí)。本發(fā)明有良好的去除畜禽養(yǎng)殖廢水中纖維素的能力。
文檔編號C02F3/34GK101665285SQ20091006306
公開日2010年3月10日 申請日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者珩 劉, 琨 劉, 平 李, 王焰新, 王艷紅, 蕾 童 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)