專利名稱：高效去除水體中亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨氮的門多薩假單胞菌cy004及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水環(huán)境微生物治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株去除水體中亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨氮的門多薩假單胞菌CY004的篩選及應用。

背景技術(shù)：
目前，我國在水污染防治方面做了很多工作，但是養(yǎng)殖水體和天然水體富營養(yǎng)化問題仍然非常嚴峻。調(diào)查表明(金相燦等，1995)我國大部分湖泊、水庫已達到富營養(yǎng)化或超過富營養(yǎng)化程度。水體的“富營養(yǎng)化”使水體變得腥臭難聞，魚類和其他生物大量死亡，藍藻暴發(fā)，高溫季節(jié)很多地方無水可飲。水體中含有的營養(yǎng)鹽類元素氮、磷超標是引起富營化的主要原因(Rffollety and Jlhatfield，2002)。而隨著我國集約化高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝態(tài)氮含量超標現(xiàn)象非常嚴重，水體中的亞硝態(tài)氮、氨氮是導致水產(chǎn)動物致病的主要根源之。據(jù)農(nóng)業(yè)部和國家環(huán)境保護總局近日聯(lián)合發(fā)布的一份公報顯示，2003年由于環(huán)境污染造成的可測算天然漁業(yè)資源經(jīng)濟損失達到36.36億元。因此水體中氮素的去除，對于保護環(huán)境、發(fā)展?jié)O業(yè)經(jīng)濟和保障人類健康都具有重要的意義。如何經(jīng)濟、高效地去除水體中的氮素已成為水污染控制領(lǐng)域的研究重點和熱點。
氮以有機氮和無機氮兩種形態(tài)存在于水體中。有機氮有蛋白氮、多肽、氨基酸和尿素等，它們來源于飼料殘餌、生活污水、農(nóng)業(yè)廢棄物(植物秸稈、牲畜糞便等)和工業(yè)廢水(如羊毛加工、制革、印染、食品加工等)。無機氮指主要以NH3、NH4+、N2、N2O、NO、NO2-、NO2、NO3-等價態(tài)存在(鄭平等，2004)，許多研究證明，除了分子態(tài)氮以外，所有無機氮素循環(huán)中間產(chǎn)物積累均會對人類和環(huán)境產(chǎn)生不良影響。氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮是水體中無機氮的主要存在形式。
氮素在水體的轉(zhuǎn)化主要是依靠微生物的作用，生物脫氮(biological nitrogenremoval，BNR)方法是指通過微生物的硝化和反硝化作用來脫除水體中的氮素污染(Prakasam and Loehr，1972)。硝化作用是指硝化菌將氨氮氧化成硝酸鹽氮的過程，包括兩個步驟第一步是由亞硝酸菌(Nitrosobacter)將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，第二步是由硝酸菌(Nitrobacter)從將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。反硝化作用是指反硝化細菌將硝態(tài)氮(鹽)、亞硝態(tài)氮(鹽)及其它氮氧化物轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨饣虻钠渌鼩鈶B(tài)氧化物的生物學過程(Kim et al，2005)。反硝化細菌是所有能以NO3-為最終電子受體，HNO3還原為N2的細菌總稱，在種類學上沒有專門的類群，分散于10個不同的細菌科中。一般條件下，反硝化細菌都是利用氧氣作為電子受體，而在含氧量很低或缺氧的條件下能利用硝酸鹽及亞硝酸鹽中氧進行呼吸，并釋放N2。大多數(shù)反硝化細菌是異養(yǎng)型兼性厭氧細菌，能夠利用多種有機物作為電子受體。自然界中最普遍的反硝化菌屬是假單胞菌屬(Pseudomonas)，其次是產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)。
傳統(tǒng)理論認為，細菌的反硝化是一個嚴格的厭氧過程。反硝化菌優(yōu)先使用DO(dissolvedoxygen)呼吸，阻止了硝酸鹽或亞硝酸鹽作為最終電子受體。這成為制約傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)研究應用的瓶頸一方面，亞硝酸細菌為化能自養(yǎng)菌，生長速率緩慢，導致反應啟動時間長，并且亞硝酸細菌對污水組成成分、pH和溫度等的改變都敏感(Mobarry et al，1996)。另一方面，硝化過程是在好氧環(huán)境中完成的，而反硝化是在缺氧過程中進行的。這使得整個脫氮過程必須經(jīng)過好氧和缺氧兩個環(huán)節(jié)(Joo et al，2005)。然而，Robertson和Kuenen在實驗室中觀察到在氧氣存在的條件下發(fā)生了反硝化現(xiàn)象，細菌好氧反硝化的發(fā)現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)理論的認識，為生物脫氮技術(shù)提供了一種嶄新的思路。人們在各種不同的環(huán)境下諸如土壤，溝渠，池塘，活性污泥，沉積物等都分離出了一些好氧反硝化菌。國內(nèi)外很多研究者發(fā)現(xiàn)并分離出好氧反硝化菌，大致可歸為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及紅球菌屬(Rhodococcus)等。這些微生物均能在好氧的條件下將硝酸鹽或者亞硝酸鹽還原。
近年來國內(nèi)外對氮污染的治理日益重視，生物脫氮技術(shù)因其迅速安全倍受青睞。而作為生物脫氮技術(shù)之一的細菌好氧反硝化與傳統(tǒng)的細菌厭氧反硝化相比更具有以下獨特優(yōu)勢 ①細菌能在有氧條件下進行反硝化，使得硝化和反硝化能夠同時進行。硝化的產(chǎn)物可直接作為反硝化作用的底物，避免了硝酸、亞硝酸的積累對硝化反應的抑制，加速了硝化-反硝化進程。且反硝化釋放出的OH-可部分補償硝化反應所消耗的堿，能使系統(tǒng)中pH值相對穩(wěn)定。
②與傳統(tǒng)的化學自養(yǎng)硝化菌不同，好氧反硝化菌(多數(shù)也是異養(yǎng)硝化菌)可將氨在好氧條件下直接轉(zhuǎn)化成氣態(tài)產(chǎn)物，且反應可由單一反應器一步完成。這降低了操作難度和運行成本。
③大部分好氧反硝化菌能很好適應厭氧(或缺氧)周期變化，在有氧/缺氧交替時具有生態(tài)生長優(yōu)勢。其生長速度快、產(chǎn)量高，要求的溶解氧濃度較低，能在偏酸性環(huán)境中生長。細菌培養(yǎng)投資少，且反應速度快，反硝化徹底，適合治理大面積氮污染水域。
④養(yǎng)殖水體和天然水體的溶氧一般在4mg/L以上，厭氧生物脫氮無法實現(xiàn)，而好氧反硝化菌能夠在高溶氧條件下快速脫氮，生長繁殖。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，在好氧條件下篩選一株能高效好氧反硝化的細菌，該菌具有高效好氧反硝化的特點，可以利用有機碳源，在污水中快速生長和脫氮，同時不產(chǎn)生NO2及N2O，并且能在不同的自然環(huán)境溫度下生長，有很強的實際應用價值，該細菌的高效脫氮性能在國內(nèi)尚屬首次報道，理論研究意義巨大。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn) 申請人:于2007年5月從中國廣東省中山市南美白對蝦養(yǎng)殖池塘底泥中分離得到一株對亞硝態(tài)氮有高降解能力的菌株，其在好氧條件下對氨氮及亞硝態(tài)氮都有很好的降解能力。經(jīng)形態(tài)觀察，生理生化試驗和16S rDNA鑒定，該CY004菌株在分類學上屬于門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina ymp)。申請人于2009年9月10日將該菌株送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號(CCTCC NO)M 209197。
與此同時，申請人公開了篩選能去除水體中的亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨氮的門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina ymp)CY004的方法，包括下列步驟 1.微生物選擇富集培養(yǎng) 將水樣靜置棄去上清液，取池塘污泥接種于加杜氏小管的試管中(反硝化培養(yǎng)基)，接種量為1～5％，在20～35℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，將其觀察杜氏小管中是否有氣體產(chǎn)生；對于把產(chǎn)氣的試管，基本可以確定基本沒有所需菌株。
2.取產(chǎn)氣的試管，從中吸取0.1ml，梯度稀釋至合適濃度，涂布在BTB固體培養(yǎng)基平板中，30℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，平板倒置； 3.從BTB培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中挑取藍色單菌落，接種于反硝化硝化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中，接種量5～10％，在30～35℃、120～180rpm的條件下恒溫振蕩培育2～3d，測定硝酸鹽，亞硝酸鹽的含量。硝態(tài)氮基本消耗的培養(yǎng)液，即為目的菌株。
4.取所篩目的菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，測定其反硝化，確定是否遺傳穩(wěn)定，遺產(chǎn)穩(wěn)定即為所需。
本篩選方法可以高通量篩選樣品中是否含有反硝化細菌，直觀的通過產(chǎn)氣驗證，并且達到定向富集的作用，減少后續(xù)工作量，達到快速篩選的目的，適合從大量樣品中分離分析反硝化微生物。所篩選的好氧反硝化細菌可以利用亞硝酸鹽作為唯一氮源的培養(yǎng)基中正常生長繁殖，對環(huán)境有較強的適應能力，遺傳穩(wěn)定，在實際工程應用中有較大的發(fā)展?jié)摿?。以下對本發(fā)明作進一步的描述 本發(fā)明所用的菌株分離篩選方法、降解力測定方法及所分離篩選得到的菌株的特性如下 一、菌株分離篩選、降解力測定及相關(guān)培養(yǎng)基的制備 反硝化培養(yǎng)基硝酸鉀2.0g、七水合硫酸鎂0.2g、磷酸氫二鉀0.5g、酒石酸鉀鈉20g、蒸餾水1L、pH 7.2(加20g瓊脂即為固體培養(yǎng)基)，121℃濕熱滅菌30分鐘。
BTB篩選培養(yǎng)基L-天冬酰胺酸1g、KNO3(或者NaNO2)1g、KH2PO4 1g、琥珀酸鈉8.5g、FeCl2.6H2O 0.05g、CaCl2.2H2O 0.2g、MgSO4.7H2O 0.07g、1ml/L BTB[pH指示劑溴百里酚](1％，溶于乙醇)，瓊脂20g、pH 7.0～7.2。
二、門多薩假單胞菌CY004株的分離和篩選 將水樣靜置棄去上清液，取活性污泥接種于加杜氏小管的試管中(反硝化培養(yǎng)基)，接種量為2％，在20～35℃溫箱中培養(yǎng)2d，觀察杜氏小管中是否有氣體產(chǎn)生；沒產(chǎn)氣的試管，基本可以確定基本沒有所需菌株。取產(chǎn)氣的試管，從中吸取0.1ml，梯度稀釋至合適濃度，涂布在BTB固體培養(yǎng)基平板中，30℃溫箱中培養(yǎng)2～3d，平板倒置。從BTB培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中挑取藍色單菌落，接種于反硝化硝化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中，接種量1％，在25～30℃、120～180rpm的條件下恒溫振蕩培育2～3d，測定亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨氮的含量。亞硝態(tài)氮基本消耗的培養(yǎng)液，即為目的菌株。取所篩目的菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，測定其反硝化，確定是否遺傳穩(wěn)定，遺產(chǎn)穩(wěn)定即為所需。
將本發(fā)明篩選的菌株CY004的16SrDNA序列用常用的細菌16SrDNA測序方法檢測(Alfreider等，2002)，該CY004的16SrDNA序列見表1，將CY004的16SrDNA序列到NCBI網(wǎng)站進行BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)其與多株門多薩假單胞菌的序列同源性達到97％，經(jīng)鑒定，確定本發(fā)明分離的菌株為一株門多薩假單胞菌，其分類命名為Pseudomonas mendocina ymp。
表1 CY00416SrDNA序列 三、門多薩假單胞菌菌株CY004的菌學特征 CY004株為革蘭氏陰性菌，桿狀，菌落淡黃色；氧化酶、產(chǎn)氨、淀粉水解試驗為陰性，甲基紅、V.P、硫化氫、明膠液化、精氨酸脫羧、賴氨酸脫羧、尿素水解及檸檬酸鹽實驗陽性，可以在6.5％ NaCl固體培養(yǎng)基生長，不產(chǎn)熒光，葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖及甘露醇發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，生長溫度范圍4～45℃，最適生長溫度范圍18～28℃。
四、菌株CY004對亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨氮的降解性能 將菌株CY004接種于反硝化細菌液體培養(yǎng)基，經(jīng)24h活化后，6000r/min離心5分鐘，倒掉上清液用生理鹽水將實驗菌株做成菌濃度為1×106cfu/mL菌懸液，接種2％菌懸液到模擬污水中，該水樣亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮和氨氮濃度分別為100mg/L，水體溫度25±1℃，pH7.2±0.5，定時取樣離心，測定氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的降解率。
降解情況好氧培養(yǎng)條件下，菌株CY004可在以亞硝酸鈉或硝酸鈉為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長。經(jīng)過48h培養(yǎng)，可將初始濃度為100mg/L的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨氮分別降解為4.79mg/L 0.18mg/L與3.3mg/L，降解率分別為95.2％、99.8％和96.7％。結(jié)果見表2、表3和表4，通過測定總氮發(fā)現(xiàn)，15％的氮被細胞同化轉(zhuǎn)化為內(nèi)源氮，其余氮均轉(zhuǎn)化為氮氣，無N2O產(chǎn)生。
表2CY004在好氧條件下對NO2-反硝化作用 表3CY004在好氧條件下對NH4+反硝化作用 表4CY004在好氧條件下對NO3-反硝化作用 五、菌株CY004的動物安全性測定 將菌株CY004轉(zhuǎn)接到肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后離心去掉上清液，制成菌含量為2×1011cfu/mL的液體水劑，分別投加到各養(yǎng)殖水體，觀察其對水生動物的安全性。各個濃度組試驗魚為30尾，蝦每個濃度組30只，以長74cm×寬78cm×高47cm的玻璃缸作為試驗容器，每個玻璃缸裝經(jīng)充分曝氣的自來水200L，用加熱棒加熱并控制水溫為25±1℃，pH7.2～7.8。
A、對異育銀鯽的急性毒性試驗 10ppm、100ppm、1000ppm、5000ppm CY004細菌使用后，9天內(nèi)試驗魚均攝食活動正常，成活率100％，2×1011cfu/mL濃度的CY004細菌對異育銀鯽的96小時LD50＞5000ppm。
B、對鰱魚的急性毒性試驗 10ppm、100ppm、1000ppm、5000ppm CY004細菌使用后，9天內(nèi)試驗魚均攝食活動正常，成活率100％，2×1011cfu/mL濃度的CY004細菌對鰱魚的96小時LD50＞5000ppm。
C、對淡水青蝦的急性毒性試驗 10ppm、100ppm、1000ppm的CY004細菌使用后，9天內(nèi)試驗蝦均攝食活動正常，成活率100％，2000ppm的CY004細菌使用48h后，水體變渾濁，蝦有缺氧癥狀，9天后成活率73％。2×1011cfu/mL濃度的CY004細菌對淡水青蝦的96小時LD50＞1000ppm。
D、對斑點叉尾鮰的急性毒性試驗 10ppm、100ppm、1000ppm、5000ppm的CY004細菌使用后，9天內(nèi)試驗魚均攝食活動正常，成活率100％，2×1011cfu/mL濃度的CY004細菌對斑點叉尾鮰的96小時LD50＞5000ppm。
E、對小白鼠毒性實驗 小白鼠隨機分組，每組20只，雌雄各10只，給藥前稱重。試驗分口灌給藥、拌料給藥兩組，各組按照高中低三個劑量給藥，其中高劑量組分別口灌和拌料給菌2×1011cfu/只，每天給藥一次。同時設(shè)實驗對照組合空白組。
各組小鼠用CY004細菌投喂后，每天觀察小白鼠的外表、行為、飲食等情況。30天試驗結(jié)束于末次給藥后24h，采血測定紅細胞總數(shù)、血紅蛋白、白細胞、淋巴細胞、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、AST、ALK指標，并對各結(jié)果作方差檢驗。各組小白鼠采血后立即解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、子宮、睪丸的病理變化。
30天試驗結(jié)束后，各試驗組合對照組小白鼠的活動、顏色光澤、呼吸排泄均正常，飼料消耗及小白鼠體重增長均無差異(P＞0.1)，心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、子宮、睪丸均正常，試驗組和對照組小白鼠的血液學和血液生化指標經(jīng)t檢驗結(jié)果，表明小白鼠口灌和拌料投喂CY004細菌制劑后，t值均＞0.1，兩者無差異，表明CY004細菌對小白鼠無毒性。
F、鯽魚口灌CY004細菌的致病性試驗 將CY004細菌培養(yǎng)液離心，用生理鹽水稀釋至2×1011cfu/mL，分別灌入2mL、0.6mL、0.2mL的CY004細菌稀釋液，每2天一次，連灌三次，同時設(shè)口灌2mL滅菌LB培養(yǎng)基的對照組，口灌結(jié)束后連續(xù)觀察15天，各試驗組和對照組鯽魚口灌CY004細菌后均未出現(xiàn)死亡，成活率為100％，與對照組相比體重未有明顯變化，體表、和內(nèi)臟未出現(xiàn)異常變化，試驗表明口灌CY004細菌對鯽魚無致病性。
G、注射CY004細菌的致病性試驗。
將CY004細菌培養(yǎng)液離心，用生理鹽水稀釋至2×1011cfu/mL，分別腹腔注射鯽魚20尾每組，分為2組，各注射1mL、0.5mL的CY004細菌稀釋液，對照組注射滅菌生理鹽水0.5mL；中華絨螯蟹于第三足基部注射20只，每只注射0.1mL，對照組注射滅菌生理鹽水0.1mL；南美白對蝦注射20尾，每尾0.1mL，對照組注射滅菌生理鹽水0.1mL；小白鼠20只每組，分為2組，各注射1mL、0.5mL的CY004細菌稀釋液，對照組注射滅菌生理鹽水0.5mL；各動物組觀察15天，試驗期間水溫為25±1℃，水體溶氧在4.0mg/L以上，pH7.35，室溫為28±2℃，各試驗組均為出現(xiàn)死亡，與對照組相比體重未有明顯變化，體表、和內(nèi)臟未出現(xiàn)異常變化，試驗表明注射CY004細菌對水產(chǎn)動物無致病性。
六、菌株CY004的環(huán)境安全性測定 蚤類是淡水生物的重要類群，是淡水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動中的重要環(huán)節(jié)。它們對各種毒物有很強敏感性。國內(nèi)外已廣泛用其評價各種產(chǎn)品的毒性，進行水污染監(jiān)測及制定各種水質(zhì)標準。本試驗選擇了淡水常見生物多刺裸腹蚤(Moina macrocopa Straus)作為試驗生物，研究菌株CY004對其的毒性，為確認菌株CY004對生態(tài)環(huán)境安全性建立提供必要的參數(shù)。
試驗動物品種多刺裸腹蚤(Moina macrocopa Straus)是室內(nèi)長期培養(yǎng)的孤雌生殖的單個幼蚤，母蚤采自長江水產(chǎn)研究所窯灣基地的成魚試驗場。選用實驗室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生6～24h的幼蚤為試驗蚤，試驗蚤應是同一母體的后代，試驗時選取健康活潑個體。每小燒杯中放入用稀釋水洗凈的試驗蚤10只。
飼養(yǎng)條件以高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司生產(chǎn))為餌。在1～2L的圓玻璃缸或燒杯中，加入500～1000mL培育水(自然曝氣3d以上的自來水過濾)，加人10～20個多刺裸腹蚤，用40℃左右的水溶化干酵母后投喂，每天早晚各一次。在室內(nèi)日光燈(距離2～3m)下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22±1℃，pH7.2±0.5，溶解氧3mg/m3以上，每周全換培養(yǎng)液1～2次。選擇懷卵量高的水蚤10～20個，投喂充足的餌料，在實驗前24h用孔徑為1mm的篩子將幼蚤濾去，在實驗前6～12h進行第二次過篩，所得到新出生的幼水蚤為出生6～24h大小的幼蚤。
試驗方法將CY004細菌液體培養(yǎng)液離心，用生理鹽水稀釋至2×1011cfu/mL，選擇5個試驗濃度，并設(shè)置對照組。試驗水中的菌株CY004的試驗濃度分為100ppm、1000ppm、2500ppm、5000ppm、10000ppm共5個試驗組，空白對照組中不加菌液。試驗時用1000mL燒杯注入800mL試驗液，每杯中放入用稀釋水洗凈的試驗蚤10只。然后將小燒杯放入水浴鍋中培養(yǎng)，控制溫度在22±1℃，每天用日光燈(距離2～3m)照射12h。試驗期間不投餌，試驗時間24h。蚤死亡的判斷方法一般采用肉眼觀察，檢查蚤類停止活動，需反復轉(zhuǎn)動試驗容器，以15s內(nèi)蚤類活動距離不超過本身的長度為標志，即使觸角和鰓還能活動或腸子仍在蠕動也算停止活動。
試驗結(jié)果在高濃度組，水質(zhì)變渾，但蚤類活動能力反而增強，沒有集群行為，燒杯中上下都有分布。CY004細菌對多刺裸腹蚤的急性試驗結(jié)果見表2。由表2可以看出，濃度為2×1011cfu/mL的CY004菌液對多刺裸腹蚤的24h-LC50大于10000ppm，遠遠大于菌株CY004的脫氮使用濃度，正常使用不會造成環(huán)境污染和對水生態(tài)的影響。
表5 菌株CY004對多刺裸腹蚤急性毒性試驗結(jié)果(水溫21～23℃) 七、菌株CY004對實際污水的處理能力測定 將CY004細菌培養(yǎng)液離心，用生理鹽水稀釋至1×106cfu/mL，按1％的接種量接入生活污水中，室溫(22～25℃)培養(yǎng)72h測定水體中亞硝酸氮和氨氮的量，結(jié)果顯示菌株CY004對兩種氮源的去除率分別為97.3％和97.1％。按1‰的接種量接入養(yǎng)殖廢水中，室溫(22～25℃)培養(yǎng)72h測定水體中亞硝酸氮和氨氮的量，結(jié)果顯示菌株CY004對兩種氮源的去除率分別為96.1％和90％。實驗結(jié)果表明，正常發(fā)酵情況下，CY004細菌濃度達到1×1010cfu/mL以上時，每升CY004細菌制劑可以用于1000m3水體用于快速脫氮。
八、菌株CY004液體菌劑制備 該菌劑發(fā)酵流程是斜面菌種→活化→三角瓶液體菌種→發(fā)酵罐發(fā)酵→檢驗→包裝→成品菌劑。
所述的菌劑具體工藝步驟如下 1)將以上所述的，保藏在CCTCC，保藏編號為NO.M209197，保藏日期2009年9月10日，接入反硝化培養(yǎng)基牛肉膏5.0g，硝酸鉀2.0g、葡萄糖5.0g、七水合硫酸鎂0.2g、磷酸氫二鉀1.0g、酒石酸鉀鈉20g、蒸餾水1L、pH 7.2(加20g瓊脂即為固體培養(yǎng)基)，121℃濕熱滅菌30分鐘。37℃條件下培養(yǎng)24小時； 2)制作三角瓶液體菌種將試管菌株接種于反硝化液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，該培養(yǎng)基按以下方法制作硝酸鉀3.0g、亞硝酸鈉3.0g、葡萄糖5.0g、牛肉膏5.0g、七水合硫酸鎂0.2g、磷酸氫二鉀0.5g、酒石酸鉀鈉20g、蒸餾水1L、pH 7.2，121℃濕熱滅菌30分鐘。
2)發(fā)酵罐發(fā)酵在發(fā)酵罐中按以下配方調(diào)好料硝酸鉀2.0kg、葡萄糖5.0kg、酵母膏8.0kg、亞硝酸鉀鈉2.0kg、七水合硫酸鎂0.2kg、磷酸氫二鉀0.5kg、醋酸鈉5kg、過濾無菌水1噸。保持32±2℃，接種5％三角瓶液體菌種，充分通氣攪拌發(fā)酵，72小時發(fā)酵完成，檢驗，包裝。
本方法制備的菌液有效活菌數(shù)大于1×1010cfu/mL。

具體實施例方式 實施例1、菌株的分離、篩選與鑒定 一、菌株的分離篩選 1、配制如下培養(yǎng)基 反硝化培養(yǎng)基硝酸鉀2.0g、七水合硫酸鎂0.2g、磷酸氫二鉀0.5g、酒石酸鉀鈉20g、蒸餾水1L、pH 7.2(加20g瓊脂即為固體培養(yǎng)基) BTB篩選培養(yǎng)基L-天冬酰胺酸1g、KNO3(或者NaNO2)1g、KH2PO4 1g、琥珀酸鈉8.5g、FeCl2.6H2O 0.05g、CaCl2.2H2O 0.2g、MgSO4.7H2O 0.07g、1ml/L BTB[pH指示劑溴百里酚](1％，溶于乙醇)，瓊脂20g、pH7.2。
2、好氧反硝化菌篩選 ①、微生物選擇富集培養(yǎng)將水樣靜置棄去上清液，取活性污泥接種于加杜氏小管的試管中(反硝化培養(yǎng)基)，接種量為5％，在28℃溫箱中培養(yǎng)48h，觀察杜氏小管中是否有氣體產(chǎn)生。
②、取產(chǎn)氣的試管，從中吸取0.1ml，梯度稀釋至合適濃度，涂布在BTB固體培養(yǎng)基平板中，28℃溫箱中培養(yǎng)48h，平板倒置。
③、從BTB培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中挑取藍色單菌落，接種于反硝化硝化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基中，接種量5％，在28℃、160rpm的條件下恒溫振蕩培育48h，測定硝酸鹽，亞硝酸鹽的含量。硝態(tài)氮基本消耗的培養(yǎng)液，即為目的菌株。
④、取所篩目的菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，測定其反硝化，確定是否遺傳穩(wěn)定，遺產(chǎn)穩(wěn)定即為所需。
實施例2、門多薩單胞菌CY004對生活污水和養(yǎng)殖廢水氨氮的去除能力測定 試驗所用生活污水取之荊州東門護城河排污口，測定其氨氮濃度為62.15mg/L，亞硝酸鹽濃度為5.2mg/L、pH6.0-6.8；養(yǎng)殖廢水取之長江大學黃鱔養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖污水，氨氮濃度為5.72mg/L，亞硝酸鹽濃度為0.7mg/L，pH7.5～8.5。將濃度為1×107cfu/mL CY004菌劑，按1‰的接種量接入污水中。室溫培養(yǎng)72小時，測定兩種污水中氨氮的含量，確定污水脫氮能力，具體實驗結(jié)果見表1。
表6 菌株CY004對氨氮去除效果
表7菌株CY004對亞硝態(tài)氮去除效果

權(quán)利要求
1.一種能去除水體中的氨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina ymp)CY004，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(CCTCC NO)M209197。
2.權(quán)利要求1所述的菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體、景觀水體和工業(yè)生活污水凈化中的應用。
3.權(quán)利要求2所述的應用，其中包括水體中去除氨態(tài)氮、硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于水環(huán)境生物治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株對氨氮、硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮有強降解作用的菌株CY004的分離篩選、安全性測定、菌液制備方法和對生活污水和養(yǎng)殖污水的處理應用。本發(fā)明的CY004菌株已經(jīng)保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保減號為CCTCC NOM 209197)。通過形態(tài)學觀察、生理生化分析和16S rDNA同源性分析，鑒定CY004菌株為門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina ymp)。該菌株能夠快速降解水體中氨氮、硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮，對白鰱、鯽魚、青蝦、中華絨螯蟹、小白鼠等動物沒有致病性，其在常溫下對實際污水中的亞硝酸鹽、氨氮有很好的降解作用，72h培養(yǎng)后，對水產(chǎn)養(yǎng)殖污水中亞硝態(tài)氮和氨氮的降解率可達到96.1％和90％，對生活污水中亞硝態(tài)氮和氨氮的降解率可達到97.3％和97.1％，有很好的應用前景。
文檔編號C02F3/34GK101787353SQ20091027336
公開日2010年7月28日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者袁科平, 鄒世平, 李谷, 何力, 鄭衛(wèi)東, 艾曉輝 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所