專利名稱：除磷菌的培養(yǎng)及其在污水處理中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及I^seudouchrobactrum saccharolyticum菌株的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，以及該菌株在污水處理，尤其是除磷中的應(yīng)用寸。
背景技術(shù)：
城市污水所存在的含磷物質(zhì)基本上都是不同形式的磷酸鹽。依據(jù)物理特征可將污水中磷酸鹽類物質(zhì)分成溶解性和非溶解性；依據(jù)化學(xué)特征，則可分為正磷酸鹽、聚合磷酸鹽和有機(jī)磷酸鹽。由于磷元素在生物化學(xué)過程中起到重要的主導(dǎo)作用。所有的微生物都含有相當(dāng)數(shù)目的磷，磷是微生物細(xì)胞的主要組分，也是導(dǎo)致赤潮頻繁發(fā)生的重要原因，給自然水體造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響。因此，在污水處理過程中會(huì)進(jìn)行除磷操作，通常通過生物作用，尤其是微生物的作用完成含磷物質(zhì)的分解和/或同化，成為磷化氫氣體和/或被限制于菌體中，從而從水中去除，以此達(dá)到除磷和凈化水質(zhì)的目的。當(dāng)前，除磷菌的研究較少。周康群等(一株新的厭氧除磷功能菌株的鑒定與活性.化工學(xué)報(bào)，2008，39 (6) :1522-1530)分離出一株 Pseudouchrobactrum saccharolyticum菌株(被稱為P2菌株)，該菌株在采用葡萄糖和乙酸鈉的復(fù)合碳源、蛋白胨和氯化銨的復(fù)合氮源時(shí)，取得最佳除磷效果。但是，該菌株未能向公眾公開發(fā)放，因此無法在實(shí)踐中投入使用，也無法進(jìn)行環(huán)境安全性評(píng)價(jià)測(cè)試，更無法合法地在國內(nèi)使用，因此喪失了在產(chǎn)業(yè)化上的實(shí)用性。為此，在已經(jīng)能夠獲得的 Pseudouchrobactrum saccharoyticum 菌株中， Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976 株(簡稱為 108976 菌株)被廠商要求使用含！“巧口切casein soy agar (Bio-Rad產(chǎn)品號(hào)為64554)的復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)或者運(yùn)用血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)，這些培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，對(duì)于污水處理這樣要求低成本但用量大的產(chǎn)業(yè)來說，是很不合適的。本申請(qǐng)人進(jìn)行了一系列長期嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯抗ぷ?，發(fā)現(xiàn)，如果按照廠商要求使用含 Trypto casein soy agar (Bio-Rad產(chǎn)品號(hào)為64554)的復(fù)合培養(yǎng)基，不但價(jià)格昂貴，而且 108976菌株培養(yǎng)的效果差，導(dǎo)致除磷效率相當(dāng)?shù)?；更令人意想不到的是，如果?duì)108976菌株采用本發(fā)明的單一碳源和氮源培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度可以更低更接近于實(shí)際環(huán)境溫度，不但相對(duì)于復(fù)合碳源和氮源的培養(yǎng)基沒有顯著的除磷效率降低，相反還得到了一定程度的提升， 這樣還有效地節(jié)約了成本并且方便了培養(yǎng)基的配制；另外，本發(fā)明的菌株對(duì)環(huán)境安全，可以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題在于，提供一種替代現(xiàn)有報(bào)道但無法獲得的除磷菌的 Pseudouchrobactrum saccharolyticum菌株的培養(yǎng)方法，其不但可以替換掉原108976菌株廠商要求的較為昂貴的培養(yǎng)基，采用成本更為低廉、更易于配制的單一碳源和氮源的培養(yǎng)基，在更為節(jié)能的較低溫度下，就可以取得與復(fù)合碳源和氮源的培養(yǎng)基相當(dāng)?shù)某仔剩?甚至在長期(21天)培養(yǎng)后，除磷效率甚至高于采用復(fù)合碳源和氮源的培養(yǎng)基。另外，本申請(qǐng)的目的還在于上述培養(yǎng)方法中采用的培養(yǎng)基，以及該菌株在污水處理中的應(yīng)用等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了培養(yǎng)能獲得的I^seudouchrobactrum saccharoIyticum 1^去，^1 ^ Pseudochrobactrum saccharoIyticum 1 禾中于培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)基包含酵母膏、KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, CaCl2, FeSO4, 葡萄糖、和蛋白胨，且不包含其他碳源和氮源。其中，培養(yǎng)的對(duì)象，即I^seudouchrobactrum saccharolyticum菌株，應(yīng)當(dāng)是能夠獲得的，即能夠提供本領(lǐng)域技術(shù)人員取得菌株的商業(yè)來源，否則本領(lǐng)域技術(shù)人員無法從合法渠道獲得菌株，進(jìn)而無法實(shí)施和/或比較本發(fā)明；而依賴于從污泥中篩選，更無法預(yù)期能夠獲得本發(fā)明的菌株。目前能夠通過合法渠道獲得 Pseudouchrobactrum saccharoIyticum ^ " Pseudochrobactrum saccharoIyticum CIP 108976株，其可購自法國巴斯德研究所菌物保藏中心(CIP，LMnstitut Pasteur, 可 # JAL http://www. crbip. pasteur. fr/fiches/fichecata. jsp ？ crbip = 108976)。 在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，能獲得的i^seudouchrobactrum saccharolyticum菌株是 Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976 株。本發(fā)明第一方面的方法可用于除磷。根據(jù)本發(fā)明的具體試驗(yàn)分析結(jié)果，盡管本發(fā)明的采用的培養(yǎng)基比廠商要求的BiO-Rad的復(fù)合培養(yǎng)基(產(chǎn)品號(hào)為64554)要便宜，但是更具有除磷作用；即使相比復(fù)合碳源和氮源的培養(yǎng)基，本發(fā)明的培養(yǎng)基更適于 Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976株提高除磷效果，尤其是除無機(jī)磷的效果。更為難得的是，Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP108976株在本發(fā)明的適當(dāng)調(diào)整了微量元素比例的培養(yǎng)基中，能夠在較低的溫度下就達(dá)到現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道需要較高溫度才能達(dá)到的除磷效果。因此優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，厭氧培養(yǎng)的溫度為^_32°C。 在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，厭氧培養(yǎng)的溫度為30°C。這樣的溫度達(dá)到的效果已經(jīng)相當(dāng)于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的在35°C才能達(dá)到的效果，甚至更高；而較低的溫度更加適于我國常年的氣候，能夠降低加溫所需的能耗并能夠減少保溫材料或者設(shè)施的使用。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，培養(yǎng)基的pH值為5. 8-6. 5。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，培養(yǎng)基的PH值為6.0。這一點(diǎn)與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的相吻合。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠應(yīng)用常用的酸或堿來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值，使其達(dá)到規(guī)定的范圍?？梢杂脕碚{(diào)節(jié)pH值的常用酸或堿包括鹽酸、檸檬酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀等，優(yōu)選是鹽酸、氫氧化鈉，它們不會(huì)額外引入碳源和氮源。優(yōu)選酸或堿是稀的酸或堿，如濃度為0. 01-0. 5mol/L的酸或堿，例如濃度可以是 0. 05,0. 1,0. 2 或 0. 3mol/L。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，培養(yǎng)基的配方為每1000體積培養(yǎng)基中，酵母膏約0. 25重量份、KH2PO4約0. 5重量份、K2HPO4約0. 64重量份、MgSO4約0. 1重量份、CaCl2 約0. 075重量份、FeSO4約0. 04重量份、葡萄糖約1. 5重量份、和蛋白胨約1. 5重量份，余量為水。該配方微調(diào)了微量元素的比例，使得低溫除磷效率得以提升到與現(xiàn)有文獻(xiàn)相當(dāng)甚至更高的水平。在本文中，體積和重量相比較時(shí)，體積和重量單位取ml和g的比例關(guān)系，即當(dāng)體積單位取ml時(shí)，重量單位取g，當(dāng)然本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠理解，當(dāng)體積單位取L時(shí)，重量單位取kg，才能保持ml和g的比例關(guān)系。在本文中，“約”表示以相應(yīng)的數(shù)值士 10%為上下限所構(gòu)成的數(shù)值范圍，例如，約1.5重量份表示1.5士 10%重量份，S卩1.35-1.65重量份。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過計(jì)算方便地?fù)Q算出數(shù)值范圍。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中， 培養(yǎng)基的配方為每 IOOOml 培養(yǎng)基中，酵母膏 0. 25g, KH2PO4O. 5g、K2HPO4O. 64g、MgSO4O. lg、 CaCl2O. 075g、FeSO4O. 04g、葡萄糖 1. 5g、和蛋白胨 1. 5g，余量為水。在第二方面,本發(fā)明提供了用于培養(yǎng)I^seudouchrobactrum saccharolyticum菌株的，尤其是用于培養(yǎng)Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976株的培養(yǎng)基，其包含酵母膏、KH2P04、K2HP04、MgS04、CaCl2、FeS04、葡萄糖、和蛋白胨，且不包含其他碳源和氮源。優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的方法中，培養(yǎng)基的pH值為5. 8-6. 5。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，培養(yǎng)基的PH值為6.0。優(yōu)選在本發(fā)明第二方面的方法中，培養(yǎng)基的配方為每1000體積培養(yǎng)基中，酵母膏約0. 25重量份、KH2PO4約0. 5重量份、K2HPO4約0. 64重量份、MgSO4約0. 1重量份、CaCl2 約0. 075重量份、!^e(SO4)2約0. 04重量份、葡萄糖約1. 5重量份、和蛋白胨約1. 5重量份， 余量為水。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，培養(yǎng)基的配方為每IOOOml培養(yǎng)基中，酵母膏0. 25 個(gè)、KH2PO4O. 5 個(gè)、K2HPO4O. 64g,MgSO4O. lg,CaCl2O. 075g,FeSO4O. 04g、葡萄糖 1. 5g、和蛋白胨 1.5g，余量為水。在第三方面，本發(fā)明提供了 Pseudouchrobactrum saccharolytticum 菌株(尤其是Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976株)在除去水中磷元素的方法中的應(yīng)用。Pseudouchrobactrum saccharolyticum菌株，優(yōu)選是經(jīng)過本發(fā)明培養(yǎng)方法培養(yǎng)的 Pseudouchrobactrum saccharolyticum菌株，具備在水體中除磷的能力，因而可以應(yīng)用于除去水中磷元素的方法中，尤其是除去含磷量與本發(fā)明的培養(yǎng)基含磷量相當(dāng)?shù)乃械牧自?，?yōu)選水中的磷元素是無機(jī)磷，例如可以來源于磷肥的磷污染源。本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見了。


圖1顯示了 0-21天培養(yǎng)菌株時(shí)不同階段消耗掉的總磷量，其中使用的培養(yǎng)基為 (1)為對(duì)照培養(yǎng)基；(2)為單一碳源、氮源培養(yǎng)基；(3)為單一碳源、雙氮源培養(yǎng)基；(4)為雙碳源、單一氮源培養(yǎng)基；( 為雙碳源、雙氮源培養(yǎng)基。圖2顯示了 0-21天培養(yǎng)菌株時(shí)不同階段產(chǎn)生的磷化氫的量，其中使用的培養(yǎng)基為⑴為對(duì)照培養(yǎng)基；⑵為單一碳源、氮源培養(yǎng)基；⑶為單一碳源、雙氮源培養(yǎng)基；
為雙碳源、單一氮源培養(yǎng)基；( 為雙碳源、雙氮源培養(yǎng)基。
具體實(shí)施例方式以下本發(fā)明將通過具體的實(shí)驗(yàn)來說明本發(fā)明菌株和培養(yǎng)方法，為了突出本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明采用周康群等(化工學(xué)報(bào)，2008，39 (6) :1522-1530)描述的方法進(jìn)行，以下實(shí)施例未盡之處可以參見該文獻(xiàn)的詳細(xì)描述。實(shí)施例1不同培養(yǎng)基活化的效果
將可購自法國巴斯德研究所菌物保藏中心(CIP，L，Institut Pasteur)的 Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976 株分別接種于如下 IOOOml 培養(yǎng)基，以 30°C充氮?dú)鈪捬跖囵B(yǎng)(1)對(duì)照培養(yǎng)基取Trypto casein soy agar (購自Bio-fcid公司，產(chǎn)品號(hào)為 64554) 40g，用蒸餾水定容至IOOOml并調(diào)節(jié)pH至6. 0，121°C滅菌15分鐘后通氮?dú)獬酰?2)單一碳源、氮源培養(yǎng)基取酵母膏 0. 25g,KH2PO4O. 5g,K2HPO4O. 64g,MgSO4O. lg、 CaCl2O. 075g、FeSO4O. 04g、葡萄糖1.5g、和蛋白胨1.5g，用蒸餾水定容至1000ml并調(diào)節(jié)pH 至6. 0，121°C滅菌15分鐘后通氮?dú)獬酰?3)單一碳源、雙氮源培養(yǎng)基取酵母膏 0. 25g、KH2PO4O. 5g、K2HPO4O. 64g、 MgSO4O. lg、CaCl2O. 075g、FeSO4O. 04g、葡萄糖 1. 5g、蛋白胨 1. 0g、和氯化銨 0. 5g，用蒸餾水定容至1000ml并調(diào)節(jié)pH至6. 0，121°C滅菌15分鐘后通氮?dú)獬酰?4)雙碳源、單一氮源培養(yǎng)基取酵母膏 0. 25g、KH2PO4O. 5g、K2HPO4O. 64g、 MgSO4O. lg、CaCl2O. 075g、FeSO4O. 04g、葡萄糖 1. 0g、乙酸鈉 0. 5g、和蛋白胨 1. 5g，用蒸餾水定容至1000ml并調(diào)節(jié)pH至6. 0，121°C滅菌15分鐘后通氮?dú)獬酰?5)雙碳源、雙氮源培養(yǎng)基取酵母膏 0. 25g,KH2PO4O. 5g,K2HPO4O. 64g,MgSO4O. lg、 CaCl2O. 075g、FeS040. 04g、葡萄糖1. 0g、乙酸鈉0. 5g、蛋白胨1. 0g、和氯化銨0. 5g，用蒸餾水定容至1000ml并調(diào)節(jié)pH至6. 0，121°C滅菌15分鐘后通氮?dú)獬酢７謩e在厭氧培養(yǎng)的第0、7、14、21天取樣，分別測(cè)定水體中總磷含量和磷化氫產(chǎn)生量。結(jié)果如圖1和2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，除磷的效果和磷化氫產(chǎn)生量的變化關(guān)系基本一致，并且基本與時(shí)間呈現(xiàn)出正比遞增關(guān)系。對(duì)照培養(yǎng)基活化出的菌株的除磷能力的效率很低；而使用單一碳源、氮源培養(yǎng)基的效果盡管在早期不如使用雙碳源、雙氮源培養(yǎng)基的效果，但是到了 21天時(shí)卻超過了雙碳源、雙氮源培養(yǎng)基的效果，這可能是由于成分多樣后培養(yǎng)基原料消耗的不均一而造成的；而使用單一碳源、雙氮源培養(yǎng)基的效果和使用雙碳源、 單一氮源培養(yǎng)基的效果基本相當(dāng)，但都低于使用單一碳源、氮源培養(yǎng)基的效果。采用單一碳源、氮源培養(yǎng)基在于30°C培養(yǎng)21天后，除磷率達(dá)到23. 8%，與現(xiàn)有技術(shù)需要35°C才能達(dá)到的效果相當(dāng)，這可能是由于選用的菌株以及本發(fā)明人優(yōu)化的培養(yǎng)基所造成的。實(shí)施例2菌株的環(huán)境安全性評(píng)價(jià)實(shí)施例1中單一碳源、氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)的Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976株培養(yǎng)物(包括菌株和培養(yǎng)基殘留)，委托上海市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心(中國上海) 進(jìn)行環(huán)境安全性評(píng)價(jià)，沒有發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致危害的環(huán)境安全性問題，可以安全地實(shí)際投入應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)能獲得的Pseudouchrobactrumsaccharolyticum菌株的方法，其包括將 Pseudochrobactrum saccharolyticum菌株接種于培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)基包含酵母膏、KH2PO4、K2HPO4, MgSO4、CaCl2、!^eSO4、葡萄糖、和蛋白胨，且不包含其他碳源和氮源。
2.權(quán)利要求1所述的方法，該方法用于除磷。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述能獲得的I^seudouchrobactrum saccharolyticum 1Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中厭氧培養(yǎng)的溫度為^_32°C，優(yōu)選為30°C。
5.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中培養(yǎng)基的pH值為5.8-6. 5，優(yōu)選為6. O。
6.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中培養(yǎng)基的配方為每1000體積培養(yǎng)基中，酵母膏約0. 25重量份、KH2PO4約0. 5重量份、Κ2ΗΡ04約0. 64重量份、MgSO4約0. 1重量份、CaCl2約 0. 075重量份、FeSO4約0. 04重量份、葡萄糖約1. 5重量份、和蛋白胨約1. 5重量份，余量為水。
7.用于培養(yǎng)能獲得的Pseudouchrobactrumsaccharolyticum菌株的，尤其是用于培養(yǎng)Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976株的培養(yǎng)基在除去水中磷元素的方法中的應(yīng)用，其包含酵母膏、KH2P04、K2HP04、MgS04、CaCl2、FeS04、葡萄糖、和蛋白胨，且不包含其他碳源和氮源。
8.權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其pH值為5.8-6. 5，優(yōu)選為6. O。
9.權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)基，其配方為每1000體積培養(yǎng)基中，酵母膏約0.25重量份、KH2PO4約0. 5重量份、K2HPO4約0. 64重量份、MgSO4約0. 1重量份、CaCl2約0. 075重量份、FeSO4約0. 04重量份、葡萄糖約1. 5重量份、和蛋白胨約1. 5重量份，余量為水。
10.Pseudouchrobactrumsaccharolyticum 菌株(尤其是 Pseudochrobactrum saccharolyticum CIP 108976株)在除去水中磷元素的方法中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及除磷菌的培養(yǎng)及其在污水處理中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了培養(yǎng)Pseudouchrobactrum saccharolyticum菌株的方法，其包括將Pseudochrobactrum saccharolyticum菌株接種于培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，其中所述培養(yǎng)基包含酵母膏、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、葡萄糖、和蛋白胨，且不包含其他碳源和氮源。
文檔編號(hào)C02F3/34GK102477398SQ201010553760
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者張期建, 張正軍, 王光永, 王軍, 王宇, 蘇斌 申請(qǐng)人:生態(tài)潔環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?br>