專利名稱：一種菌酶聯(lián)合修復(fù)土壤ddt污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種土壤DDT污染的生物修復(fù)方法，特別是一種利用白腐菌一游離漆 酶聯(lián)合修復(fù)土壤中DDT污染的方法。
背景技術(shù)：
有機(jī)氯農(nóng)藥DDT (雙對氯苯基三氯乙烷)作為一種高效的殺蟲劑曾被廣泛使用， 但由于其具有高毒和高殘留性，因此，DDT已在2001年聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)通過的 《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》中要求全球統(tǒng)一行動優(yōu)先控制和消除的12種 持久性有機(jī)污染物(POPs)之一。盡管中國早在1983年就停用DDT，但由于DDT仍被用作 瘧疾防治藥劑或農(nóng)藥三氯殺螨醇的原料，導(dǎo)致環(huán)境中不斷有新的DDT輸入，所以土壤中仍 有大量的DDT殘留。一些地區(qū)土壤中殘留的DDT濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國家土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18407-2001)。DDT可通過食物鏈在脂肪中積累，嚴(yán)重干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，引發(fā)生殖障礙，甚至 導(dǎo)致“三致”(致癌、致畸、致突變)作用。鑒于DDT可通過食物鏈給農(nóng)產(chǎn)品安全和人體健康 帶來的潛在危害，開發(fā)有效修復(fù)土壤DDT污染的修復(fù)方法是十分緊迫的。近年來，一些物理的、化學(xué)的和生物的修復(fù)方法已被應(yīng)用于土壤DDT污染的清除。 與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法相比，生物修復(fù)技術(shù)是利用特定的生物(植物、微生物或原生動物 等)吸收、轉(zhuǎn)化、清除或降解農(nóng)藥污染物，從而實(shí)現(xiàn)土壤凈化、生態(tài)效應(yīng)恢復(fù)的生物技術(shù)，是 一種公認(rèn)的有效、安全、廉價和無二次污染的方法而日益受到重視。上述不同生物修復(fù)技術(shù) 本身也還存在各種缺陷亟待進(jìn)一步研究解決，如植物修復(fù)需要的時間可能過長、微生物修 復(fù)存在接種微生物與土著微生物的競爭問題、接種微生物更多地是利用土壤本源有機(jī)物而 不是污染物作為底物問題、在DDT濃度較低時修復(fù)效果欠佳問題等；本申請人在專利號為 200710032998. 3的發(fā)明中公開了一種修復(fù)土壤DDT污染的方法，將漆酶投加到DDT污染的 土壤中直接催化降解殘留在土壤中的DDT，降解效率高，是一種有效的土壤DDT污染的治理 方法，對解決當(dāng)今土壤DDT污染做出了重要貢獻(xiàn)，但是酶修復(fù)也存在不足，包括酶純化和提 取耗時長、花費(fèi)高和易失活等缺陷，影響了其實(shí)際推廣應(yīng)用。鑒于土壤DDT污染的微生物修復(fù)技術(shù)和酶修復(fù)技術(shù)兩者各自存在一些優(yōu)點(diǎn)和一 些不足，需要對二者進(jìn)行取長補(bǔ)短，發(fā)揮其協(xié)同作用。但是具體如何尋找微生物和酶的合適 的調(diào)配機(jī)制，包括合適的調(diào)配對象以及調(diào)配比例等，使微生物修復(fù)技術(shù)和酶修復(fù)技術(shù)能有 效發(fā)揮協(xié)同作用，這一直是本領(lǐng)域的技術(shù)難題，缺少具體可行的技術(shù)方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有DDT污染土壤的修復(fù)技術(shù)的不足，提供一種被DDT污染 土壤的微生物聯(lián)合修復(fù)方法，采用本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)低成本、高效、安全的土壤修復(fù)。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
提供一種利用白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法，包括以下步驟
3(1)將白腐菌液與DDT污染土壤混合均勻；所述白腐菌液投加量為每15g 土壤投加 5mL 15mL白腐菌液，白腐菌菌落數(shù)為3 X IO9 CFU/mL ；
(2)往步驟(1)混合了白腐菌液的土壤中投加游離漆酶。如果土壤的DDT污染濃度為5 mg/kg，那么步驟(2)所述游離漆酶最佳投加量為每 克土壤6 U，其它污染水平的DDT污染土壤也適合。步驟(2)是在白腐菌液與DDT污染土壤混合均勻14天后投加游離漆酶。本發(fā)明可采用氣相色譜儀方法，每隔7天對經(jīng)上述處理的土壤中的DDT殘留量進(jìn) 行分析檢測。所述白腐菌為市售品，為木材腐生菌，引起木材白色腐朽或褐色腐朽，菌肉白色或 污白色，稍厚，菌柄側(cè)生或偏生，有微細(xì)絨毛，后變光滑。白腐菌的培養(yǎng)和游離漆酶的制備可參照本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)，本發(fā)明提供優(yōu)選的白腐 菌培養(yǎng)和游離漆酶的制備方法如下
本發(fā)明以土豆作為培養(yǎng)基的主要成分，然后加入一些營養(yǎng)物，在往復(fù)式頻率為130 rpm、溫度為的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)白腐菌，最佳培養(yǎng)時間為9天左右；上述培養(yǎng)基 的組成主要為土豆 200g、水 1000mL、葡萄糖 20 g、KH2P04 3 g、MgS04 1.5 g、VBl 0. 01 g 及5 g酵母膏。所述游離漆酶的制備方法包括以下步驟
(A)將培養(yǎng)好的白腐菌培養(yǎng)液離心，然后取上清液為粗酶液；
(B)往步驟(A)制備得到的粗酶液中加入硫酸銨粉末使溶液中硫酸銨飽和度達(dá)到20%，
常溫靜置；
(C)將步驟(B)靜置后的體系在4！下冷凍離心，取上清液，在上清液中加入固體硫酸 銨至其飽和度達(dá)到80%，靜置后冷凍離心，收集沉淀，用pH4. 6的0. 02 mol/L醋酸鹽緩沖溶 液溶解所得到的沉淀蛋白，除去不溶性蛋白，即制得游離漆酶。步驟(B)所述靜置時間優(yōu)選為2小時。步驟(C)所述靜置時間優(yōu)選為8小時。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下的有益效果
(1)本發(fā)明采用白腐菌一游離漆酶直接聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染是有效的、可行的，白腐 菌和游離漆酶發(fā)揮了聯(lián)合增效作用，對土壤中DDT的降解率均達(dá)到了 50%以上，是一種高 效、安全、無二次污染的修復(fù)土壤DDT污染的方法。(2)白腐菌對濃度較高的污染物的降解效果比較好，而對于濃度小的污染物的降 解效果不很理想；游離漆酶對于低濃度的污染物的降解效果比較理想，但游離漆酶存在純 化和提取耗時長、花費(fèi)高等缺陷，本發(fā)明將白腐菌一游離漆酶聯(lián)合使用，有效解決DDT污染 土壤修復(fù)難題。(3)本發(fā)明所用的白腐菌與游離漆酶制備方法簡單，施用操作簡便，與現(xiàn)有物理化 學(xué)修復(fù)方法相比修復(fù)成本低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。下述實(shí)施例中所采用的材料、試 劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料；所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1游離漆酶的制備 (1)白腐菌的培養(yǎng)
液態(tài)培養(yǎng)基的組成以200g 土豆作為培養(yǎng)基，然后加入葡萄糖20g、KH2P04 3g、MgS04 1. 5g、VBl 0. Olg 及 5g 酵母膏和 IOOOmL 水。將白腐菌菌種(購自中國科學(xué)院廣州化學(xué)有限公司，其他公司出品的常規(guī)白腐菌 菌種也可適用)直徑為10 mm的菌片2片接種量接入上述100 mL培養(yǎng)基中，在往復(fù)式頻率 為130 rpm、溫度為的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)白腐菌。(2)游離漆酶的分離純化
將部分培養(yǎng)好(培養(yǎng)至9天的程度為最佳的)的白腐菌培養(yǎng)液倒入塑料離心杯，置于 4000 rpm的冷凍離心機(jī)中4 °C下離心15 min，取其上清液即為漆酶粗酶液；然后在得到的 每100 mL粗酶液中，在攪拌時緩緩加入研細(xì)的硫酸銨粉末11. 3 g，使溶液中硫酸銨飽和度 達(dá)到20%，25 °C靜置2 h，在4 ！下冷凍離心后棄去沉淀，取上清液進(jìn)一步純化；每100 mL 上清液中再加入固體硫酸銨42. 4 g至飽和度達(dá)到80%，靜置8 h后在同樣條件下冷凍離心 收集沉淀，用PH4. 6的0. 02 mol/L醋酸鹽緩沖溶液溶解所得到的沉淀蛋白，并除去不溶性 蛋白，即可制得游離漆酶，此漆酶為黃色的液體狀；利用ABTS測定漆酶的活性。實(shí)施例2
研究白腐菌加菌量對白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的影響。供試土壤為赤紅壤，取自廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)樹木園。土壤室內(nèi)風(fēng)干后過2 mm篩備 用。該土壤均未檢測出DDT。將DDT溶液與供試土壤在室溫下均勻混合制備出5 mg/kg的 DDT污染赤紅壤，放置4周后進(jìn)行修復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)中保持土壤的含水率為15%左右。實(shí)驗(yàn)設(shè) 置對照(不加菌、不加漆酶)、加菌量1 (白腐菌投加量為5 mL/15 g 土、漆酶投加量為6 U/g 土)、加菌量2 (白腐菌投加量為10 mL/15 g 土、漆酶投加量為6 U/g 土)、加菌量3 (白腐菌 投加量為15 mL/15 g 土、漆酶投加量為6 U/g 土)共4個處理。其中白腐菌是在第1天投 加，白腐菌的菌落數(shù)為3X IO9 CFU/mL左右；游離漆酶是在第15天投加，漆酶的投加量均為 6 U/g 土。試驗(yàn)每個處理用土 15 g，設(shè)3個重復(fù)，分別置于燒杯中試驗(yàn)處理觀天。試驗(yàn)前測試供試土壤中的DDT初始濃度，其后分別在第7、14、21、觀天進(jìn)行取樣分 析。稱取10 g 土壤置于索式抽提器中，用體積比為1 : 1的石油醚和丙酮混合液100 mL 浸泡10 h后抽提6 h。同時做空白試驗(yàn)。將抽提液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10%的無水硫 酸鈉溶液，搖蕩1 min后靜止分層，取上層石油醚層并加入相當(dāng)于石油醚層體積1/10的濃 硫酸分配3 4次，直至上下層都呈無色為止。再加入剩余石油醚層體積一半的10%無水 硫酸鈉溶液洗滌，直至石油醚層溶液至中性，過無水硫酸鈉脫水，濃縮，定容至10 mL，待測。 最后利用氣相色譜進(jìn)行分析檢測。氣相色譜儀為HP5890 II，色譜柱為 HP-5，30 mXO. 320 mm (id)XO. 25 μ m ；載氣 為99. 999%的高純氮?dú)猓瑲饣覝囟?20 °C，柱溫195 °C，檢測器(E⑶)溫度為M5 °C，載 氣流速2 mL*min-l。采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2 μ L0表1描述了加菌量對DDT降解率 的影響。由表1可知，對照處理中，DDT的降解率隨時間緩慢增加，降解過程不顯著；當(dāng)加菌 量分別為5 mL、10 mL、15 mL時，28天后DDT的降解率均達(dá)到了 50%以上，這說明白腐菌與 游離漆酶能有效地降解土壤中的DDT，這為采用白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染提供了保證。 表1加菌量對DDT降解率的影響結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種菌酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將白腐菌液與DDT污染土壤混合均勻；所述白腐菌液投加量為每15g 土壤投加5 mL 15 mL白腐菌液，白腐菌菌落數(shù)為3 X IO9 CFU/mL ；(2)往步驟(1)混合了白腐菌液的土壤中投加游離漆酶；所述游離漆酶最佳投加量為 每克土壤6U。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法，其特征 在于步驟(2)是在白腐菌液與DDT污染土壤混合均勻2周后投加游離漆酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法，其特征 在于步驟(1)所述白腐菌是將白腐菌接種于培養(yǎng)基中并置于往復(fù)式頻率為130 rpm、溫度為的恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)得到；所述培養(yǎng)基的組成主要為土豆200 g、水1000 mL、葡 萄糖 20 g、KH2P04 3 g、MgS04 1.5 g、VBl 0. 01 g 及 5 g 酵母膏。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法，其特征 在于步驟(2)所述游離漆酶的制備方法包括以下步驟(A)將培養(yǎng)好的白腐菌培養(yǎng)液在離心，取上清液為粗酶液；(B)往步驟(A)制備得到的粗酶液中加入硫酸銨粉末使溶液中硫酸銨飽和度達(dá)到20%，常溫靜置；(C)將步驟(B)靜置后的體系在4！下冷凍離心，取上清液，在上上清液中加入固體硫 酸銨至其飽和度達(dá)到80%，靜置后冷凍離心，收集沉淀，用pH4. 6的0. 02 mol/L醋酸鹽緩沖 溶液溶解所得到的沉淀蛋白，除去不溶性蛋白，即制得游離漆酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述利用白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法，其特征 在于步驟(B)所述靜置時間為2小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述利用白腐菌一游離漆酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法，其特征 在于步驟(C)所述靜置時間為8小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種菌酶聯(lián)合修復(fù)土壤DDT污染的方法。本發(fā)明將白腐菌和游離漆酶以先后次序與含有DDT的土壤在室溫下均勻混合，利用白腐菌—游離漆酶聯(lián)合對土壤DDT污染進(jìn)行修復(fù)。本發(fā)明所述方法對土壤中DDT的降解率均達(dá)到了50%以上，是一種操作簡便、成本低廉、無二次污染的修復(fù)土壤DDT污染的方法。
文檔編號B09C1/10GK102091717SQ201110022829
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月20日
發(fā)明者趙月春, 馬偉娟 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)