專利名稱：一種降解六六六的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種降解六六六的菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
六六六作為一種應(yīng)用廣泛的光譜有機(jī)氯農(nóng)藥，為持久性有機(jī)污染物，能夠通過大氣輸送的方式進(jìn)行全球輸送，并通過食物鏈富集的方式對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響.目前有機(jī)氯農(nóng)藥污染已經(jīng)成為一個倍受關(guān)注的全球性環(huán)境問題。它在環(huán)境中存在非常穩(wěn)定，而它在環(huán)境中主要的a、P、Y和S (甲體、乙體、丙體、丁體)等4種異構(gòu)體，其不同異構(gòu)體在環(huán)境中的穩(wěn)定性也不一樣，這主要取決于氯原子在環(huán)己烷結(jié)構(gòu)上的不同排列結(jié)構(gòu)，他們在環(huán)境中的持久性順序?yàn)镻-HCH > 8 -HCH > Y -HCH > a-HCH。在斯德哥爾摩公約中，六六六已經(jīng)被列為12種持久性有機(jī)污染物之一。在這4種異構(gòu)體中，只有丙體六六六(Y-HCH，又稱為林丹)具有殺蟲活性，主要用來防治農(nóng)作物害蟲。我國也于1983年開始禁止生產(chǎn)六六六(HCHs)等有機(jī)氯農(nóng)藥，雖然有機(jī)氯農(nóng)藥已禁止使用20多年，但環(huán)境中仍然能檢出有機(jī)氯農(nóng)藥殘留。六六六在環(huán)境中有脂溶性大毒性大等特點(diǎn)，主要蓄積在人體脂肪體或是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，存留最久的是P -六六六，可在口服后持續(xù)排泄6個月，并且隨著食物鏈發(fā)生富集作用，同時刺激大腦運(yùn)動及小腦，使臟器營養(yǎng)失調(diào)，發(fā)生變性壞死。中國曾經(jīng)是生產(chǎn)和使用六六六的大國，自20世紀(jì)60年代初開始使用有機(jī)氯農(nóng)藥，到1983年停止生產(chǎn)，產(chǎn)量呈逐年持續(xù)增長趨勢。由于進(jìn)入水環(huán)境中的六六六，可被水中的懸浮物(包括泥土、有機(jī)顆粒及浮游生物等)吸附；進(jìn)入水體和土壤表面的農(nóng)藥也可通過揮發(fā)而進(jìn)入到地面表層的大氣中，而空氣中的顆粒物或呈氣態(tài)的農(nóng)藥又可隨氣流中的塵埃飄流攜帶到一定距離，沉降于底質(zhì)環(huán)境中；土壤中的農(nóng)藥也可通過滲透的形式從土壤上層滲透到土壤下層，進(jìn)而污染地下水。所以禁止使用后，并不意味著六六六的危害不存在了，據(jù)對水體中的農(nóng)藥檢測，黃河部分河段、白洋淀地區(qū)端村水域生態(tài)系統(tǒng)、珠江三角洲地區(qū)都檢測到了一定濃度的六六六。農(nóng)藥在環(huán)境中的分解，是通過生物學(xué)和化學(xué)兩種途徑進(jìn)行的，農(nóng)藥的生物學(xué)分解是農(nóng)藥消失的重要原因。環(huán)境中的六六六在微生物的作用下會發(fā)生降解，一般認(rèn)為六六六生物降解在厭氧條件下比有氧條件下進(jìn)行更快。不少微生物可分解六六六，如梭狀芽胞桿菌，假單孢菌等。有機(jī)氯農(nóng)藥的化學(xué)性分解是在各種理化因素作用下進(jìn)行的，這些理化因素包括陽光、堿性環(huán)境、空氣、濕度等、其中陽光對有機(jī)氯農(nóng)藥的分解有重要作用。一般情況下有機(jī)氯農(nóng)藥中的六六六在土壤中消失時間需6年半。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種降解六六六的菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的鞘脂單胞桿菌(Sphingobium japonicum) LZ-2,其保藏號為CGMCCNo. 3540。上述菌為鞘脂桿菌目、鞘脂桿菌科、鞘脂桿菌屬、鞘氨醇單胞菌。、
所述鞘脂單胞桿菌(Sphingobiumjaponicum) LZ-2CGMCC No. 3540 在降解農(nóng)藥中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述農(nóng)藥為六六六。所述六六六為丙體六六六。所述降解的溫度為15°C -45°C，具體為25°C _35°C，尤其優(yōu)選為25°C。所述降解的pH為5. 5-8. 5，具體為5. 5-7. 5，尤其優(yōu)選為5. 5。所述的菌在制備降解農(nóng)藥的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述農(nóng)藥為六六六,所述農(nóng)藥具體為丙體六六六。
所述的菌在對六六六污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。LZ-2已于2009年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. 3540,分類命名為 Sphingobium japonicum。丙體六六六的化學(xué)名稱為Y-異構(gòu)體-I,2,3,4,5,6-六氯環(huán)己燒。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No. 3540 是從長期受六六六和滴滴涕等有機(jī)氯農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選的，該菌能以林丹(丙體六六六)為唯一碳源和能源生長，并可以在10小時內(nèi)完全降解20mg/l的林丹,使用pH值為5. 5的無機(jī)鹽培養(yǎng)液按10%接種量接種本發(fā)明的六六六降解菌，在25°C對10 IOOmg/I的林丹有良好的降解效果。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明該菌在20天內(nèi)可以降解土壤中20mg/kg的林丹，對污染的土壤中有良好的降解效果，可以特別應(yīng)用于修復(fù)點(diǎn)源或面源六六六污染的土壤和水體。


圖I為菌株LZ-2降解Y -六六六的產(chǎn)物的色譜2為菌株LZ-2對20mg/l y -六六六的降解曲線3為pH值對菌株LZ-2降解Y -六六六的影響圖4為溫度對菌株LZ-2降解Y -六六六的影響圖5為底物濃度對菌株LZ-2降解Y -六六六的影響圖6為LZ-2在土壤中降解Y-六六六的曲線圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例l、Sphingobium japonicum LZ-2的分離、純化及鑒定I、分離將從天津農(nóng)藥廠附近采集的長期受六六六和滴滴涕等有機(jī)氯農(nóng)藥污染的活性土樣接種到以^-此則丙體六六六』。!^/!)作為唯一碳源的無機(jī)鹽溶液中振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接培養(yǎng)6次后，菌懸液以10倍梯度稀釋接種到含Y -HCH的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱培養(yǎng)。選取生長快，菌落規(guī)則，傳代穩(wěn)定的菌落，純化2-3次后得到純菌株；將分離出的5株菌作為復(fù)篩菌株在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至相同的0D_nm值I. 0，以10% (105cfu/g)的接種量接入含有20mg/l y -HCH的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C，180rpm搖床培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液。在IOml的培養(yǎng)液中加入等量正己烷，劇烈振蕩，混合物在4°C下，IOOOOrpm離心lOmin，小心收集下層有機(jī)相。此有機(jī)溶劑萃取過程重復(fù)3次。抽提液中加入無水硫酸鈉干燥后，用正己烷適當(dāng)稀釋，然后抽提液用氣相色譜分析。用氣相色譜(GC-ECD)定量測定降解率，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照，所用的氣相色譜的檢測條件為Agilent J&ff GCColumns, Agilent Agilent 7890A,色譜柱為HP-55PhenylMethyl Siloxan : 1281. 58306,HP-55 % Phenyl Methyl Siloxan,長度 30m,直徑 320 u m,厚度 0. 25 u m。升溫程序；80°C保持 I. 5min,以 20°C /min 升至 190°C，保持 Omin，以 5°C /min 升至 230°C，保持 Omin，以 25°C /min升至290°C，保持Omin ;加熱器為270°C，壓力10. 875psi，載氣流速2. OmL/min，進(jìn)樣量I U L，平均速率37. 143cm/sec，滯留時間I. 3461分鐘。前檢測器y -E⑶加熱器300°C，尾吹流量30ml/min。在這些檢測條件下，Y-HCH的保留時間分別為11. 28min。將測得的每個樣品對應(yīng)的峰面積代入預(yù)先建立的峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以計(jì)算出Y -HCH的濃度。降解率(％ )=(對照組Y -HCH的濃度-樣品組Y -HCH的濃度)/對照組Y -HCH的濃度X 100。最終篩選到降解效率最高(76% )的一株菌，將該菌株命名為LZ-2，轉(zhuǎn)入牛肉膏蛋白胨斜面保存。上述無機(jī)鹽培養(yǎng)液是按下述比例配制的在IOOOrnl水中，K2HPO4,1. 5g/l ；KH2PO4,
0.5g/l ； (NH4)2SO4jO. 5g/l ；NaCl,0. 5g/l ；MgS04,0. 2g/l ；CaCl2,0. 05g/l ；FeS04,0. 02g/l ；酵母粉，0. 002g/l, pH7. 0，121 °C高壓滅菌 20min。無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基是將上述無機(jī)鹽培養(yǎng)液加入占無機(jī)鹽培養(yǎng)液總重量的I. 5%(g/1)的瓊脂。上述LB培養(yǎng)基與文獻(xiàn)(微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]，北京，高等教育出版社，1988，75-78)中相同。將LZ-2采用美國BI0L0G微生物分類鑒定系統(tǒng)對降解菌進(jìn)行分類鑒定。將純化的LZ-2菌株在Biolog培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h ;采用干管法以GN/GP-IF制備菌懸液，調(diào)整濁度52 %T ;菌懸液以每孔150 ill接種于GN-Microplate鑒定板，測定每個孔的吸光度值，原理微生物利用碳源進(jìn)行呼吸時，會將四唑類氧化還原染色劑，從無色還原成紫色，從而在微生物的鑒定板上形成該微生物特征性的反應(yīng)模式或“指紋”，通過纖維光學(xué)讀取設(shè)備——讀數(shù)儀來讀取顏色變化，由于對光密度的吸收值的差異，計(jì)算機(jī)通過概率最大模擬法，并將該反應(yīng)模式或“指紋”與數(shù)據(jù)庫相比較，將目標(biāo)微生物與數(shù)據(jù)庫的相關(guān)菌的特征數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，對分析的微生物進(jìn)行最大限度的匹配，可以在瞬間得到鑒定結(jié)果，確定所分析的微生物的屬名或種。測定的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對，由軟件自動給出鑒定結(jié)果。經(jīng)BIOLOG技術(shù)鑒定LZ-2為鞘脂單胞桿菌(Sphingobium japonicum)。LZ-2已于2009年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. 3540,分類命名 Sphingobium japonicum。2、鑒定將Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No. 3540 接種到 LB 平板上 30°C培養(yǎng) 4 天后，觀察，該菌形成黃色扁平的，具有清晰邊緣、不透明的菌落；I)顯微鏡觀察，該菌有極生鞭毛，G-，直或彎桿狀；2)革蘭氏染色試驗(yàn)a.將培養(yǎng)18_24h的培養(yǎng)物涂片，要涂得薄些。b.將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，Imin后水洗。
c.滴加助染劑，Imin后水洗。d.滴加脫色劑，搖動玻片，直至無紫色脫落為止(約20-30S)水洗。e.滴加復(fù)染劑，Imin后水洗，晾干，鏡檢。結(jié)果為呈紫色者為革蘭氏陽性菌，紅色者為陰性菌，結(jié)果其為革蘭氏陰性菌。3)細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深；再加a-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。結(jié)果該菌株細(xì)胞色素氧化酶反應(yīng)呈陽性，具有假單胞菌的特征。4)過氧化氫酶試驗(yàn)部分細(xì)菌具有分解雙氧水的酶，能分解雙氧水產(chǎn)生氧氣和水。過氧化氫酶陽性細(xì)菌滴加3%雙氧水后，可立即產(chǎn)生大量氣泡，呈陽性反應(yīng)。結(jié)果該菌株具有接觸酶和氧化酶活性。5)細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深；再加a-萘酚溶液一滴，陽性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。同時鏡檢觀察菌體顏色結(jié)果該囷株廣黃色色素。6)鏡檢觀察該菌體周圍產(chǎn)莢膜。7)將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終濃度為0.75 I %。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種Sphingobiumjaponicum LZ-2CGMCC No. 3540 經(jīng) 30°C培養(yǎng) 18 24 小時，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有CO2和H2等氣體形成，小倒管內(nèi)則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。結(jié)果該菌株能利用葡萄糖、半乳糖、海藻糖和阿拉伯糖氧化產(chǎn)酸。實(shí)施例2、Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No. 3540 的降解性能的測定一、六六六的降解和菌株生長實(shí)驗(yàn)Sphingobium japonicum LZ-2CGMCC No. 3540 的單菌落先在 LB 培養(yǎng)基中大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至OD6tltlnm值為1.5，培養(yǎng)物41、6000印111離心51^11，用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液(成分如實(shí)施例I中所述)洗滌菌體沉淀，并用無機(jī)鹽培養(yǎng)液配置成菌懸浮液，以10%的接種量(I. 5X105cfu/g)分別接入含有20mg/l y -HCH (丙體六六六，Y -HCH (分析純)購自Sigma-Aldrich (USA) 233390，即為林丹)的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，于25°C，180rpm搖床培養(yǎng)12h，得到培養(yǎng)液，每隔2h取樣一次，用氣相色譜(GC-ECD)定量測定降解率(檢測條件同實(shí)施例I)，以未接種菌株LZ-2的培養(yǎng)基(含20mg/l y -HCH)作為對照。具體為將IOml培養(yǎng)液中加入等量正己烷，劇烈振蕩，混合物在4°C、3000rpm離心IOmin分層，小心收集上層有機(jī)相。此有機(jī)溶劑萃取過程重復(fù)3次。抽提液中加入無水硫酸鈉干燥后，用正己烷適當(dāng)稀釋，然后抽提液用氣相色譜分析。標(biāo)準(zhǔn)品為20mg/l y -HCH，保留時間為12. 88min ；不同時間的抽提液在保留時間為12. 88min的峰對應(yīng)的為Y -HCH(見圖I)。降解率(％ )=(對照組Y -HCH的濃度-樣品組Y -HCH的濃度)/對照組、-HCH的濃度X 100。LZ-2 菌株在 25 °C，180rpm 搖床培養(yǎng) 2h、4h、6h、8h、10h、12h Y -HCH 的降解率分 別為71. 21%,39. 98%、19. 52%,7. 12%,0. 15%,0% ；對照在25°C，180rpm搖床培養(yǎng)2h、4h、6h、8h、10h、12h Y-HCH的降解率分別為
98.62%,97. 97%,97. 32%,96. 7%,96. 43%,96. 5% ；LZ-2 菌株在 25°C，180rpm 搖床培養(yǎng) 2h、4h、6h、8h、10h、12h Y-HCH 的濃度分別為14. 242mg/l、7. 996mg/l、3. 904mg/l、l. 424mg/l、0. 03mg/l、0mg/l ；對照在25°C，180rpm搖床培養(yǎng)2h、4h、6h、8h、10h、12h Y-HCH的降解率分別為19. 724mg/l、19. 594mg/l、19. 464mg/l、19. 34mg/l、19. 286mg/l、19. 3mg/l ；用DU 800分光光度計(jì)測定LZ-2菌株在25°C，180rpm搖床培養(yǎng)2h、4h、6h、8h、10h、12h 在 600nm 的光密度，分別為 0. 13,0. 19,0. 28,0. 36,0. 39,0. 43 ；相比之下，在未接種菌株的培養(yǎng)基中沒有檢測到六六六的降解和細(xì)胞的生長。將上述結(jié)果作圖如圖2所示，其中， -為LZ-2菌株對20mg/L丙體六六六的降解曲線，▲-為未接入LZ-2菌株的降解對照組，■-為LZ-2菌株生長曲線，從圖中可以看出，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中LZ-2在10小時之內(nèi)，可以完全降解一定量的丙體六六六。二、不同因素對菌株LZ-2降解特性影響的研究I、pH值對菌株LZ-2降解Y -六六六的影響LZ-2的單菌落先在LB培養(yǎng)基中30°C擴(kuò)大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至0D6(l(lnm值I. 5，培養(yǎng)物4°C、6000rpm離心5min,用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液(成分如實(shí)施例I中所述)洗漆菌體沉淀，配置成菌懸浮液，以10%的接種量(I. 5X105cfu/g)分別接入含有20mg/l Y-HCH的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別將初始培養(yǎng)液的pH值分別調(diào)為5. O、5. 5、6. O、6. 5、7. O、7. 5、8. O、8. 5,并以不接菌作為對照，每個樣品兩個平行。在30°C下、200rpm培養(yǎng)30h。用GC測定培養(yǎng)基中六六六的濃度，計(jì)算降解率(方法同實(shí)施例I)，萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結(jié)果如圖3所示，該菌株在pH值為5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5條件下，六六六的降解率分別為 52. 71%,98. 85%,96. 89%,95. 99%,89. 15%,82. 45%, 78. 77%,46. 55% ；而對照在pH值為5. O、5. 5、6. O、6. 5、7. O、7. 5、8. O、8. 5條件下，六六六的降解率分別為 98. 8%,99. 1%,99. 4%,98. 9%,99. 3%,99. 5%,99. 5%,99. 6% ；表明，該菌株在pH5. 5-7. 5的范圍內(nèi)生長和降解效果均較好，其中在pH5. 5時的降解能力最強(qiáng)。2、溫度對菌株LZ-2降解Y-六六六的影響LZ-2的單菌落先在LB培養(yǎng)基中30°C擴(kuò)大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至0D6(l(lnm值I. 5，培養(yǎng)物4°C、6000rpm離心5min,用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液洗漆菌體沉淀,配置成菌懸浮液，以10%的接種量(I. 5X105cfu/g)分別接入7份含有20mg/l y -HCH的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(pH5. 5)，分別將培養(yǎng)溫度分別調(diào)為15°C、20°C、25°C、30 V、35°C、40 V、45°C，200rpm培養(yǎng)30h，并以不接菌的培養(yǎng)基在與上述相同條件下放置作為對照，每個樣品兩個平行。用GC測定培養(yǎng)基中六六六的濃度，計(jì)算降解率(方法同實(shí)施例I)，萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結(jié)果如圖4所示，該菌株在15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45C條件下，六六六的降解率為 76. 83%,87. 97%,93. 27%,91. 15%,85. 76%,61. 07%,42% ；而對照在15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C條件下，六六六的降解率分別為
99.4%,99. 3%,98. 4%,98. 1%,98. 6%,99. 3%,99. 6% ；表明，菌株在25-35°C時的降解效率都比較高，其中在25°C時降解速度最快。
3、菌株LZ-2對不同濃度的Y -六六六的降解LZ-2的單菌落先在LB培養(yǎng)基中30°C擴(kuò)大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至0D6(l(lnm值I. 5，培養(yǎng)物4°C、6000rpm離心5min,用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液(成分如實(shí)施例I中所述)洗漆菌體沉淀，配置成菌懸浮液，以10%的接種量(I. 5X105cfu/g)分別接種于IOml含不同濃度(10，30，50,80,120,150mg/l) Y -六六六的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(PH值為5.5)中，在25°C下、200rpm培養(yǎng)7天。并以不接菌作為對照，每個樣品兩個平行。用GC測定培養(yǎng)基中六六六的濃度，計(jì)算降解率(方法同實(shí)施例I)萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結(jié)果如圖5所不，該菌株在Y -六六六濃度為10mg/l, 30mg/l, 50mg/l, 80mg/l,120mg/l,150mg/l 條件下，六六六的降解率分別為 91. 74%,96. 14%,98. 30%,87. 99%,67. 87%,60% ；而對照在Y-六六六濃度為 10mg/l, 30mg/l, 50mg/l, 80mg/l, 120mg/l, 150mg/l 條件下，六六六的降解率分別為 98. 43%,97. 52%,97. 31%,98. 45%,99. 54%,99. 74% ；表明，當(dāng)外加Y-六六六的濃度在10_50mg/l時，菌株可以在一周內(nèi)將其完全降解。然而，當(dāng)外加Y-六六六的濃度超過50mg/l時，則表現(xiàn)出明顯的底物抑制效應(yīng)，Y-六六六的降解速度明顯減慢。三、LZ-2對六六六污染土壤的生物修復(fù)在北京中國科學(xué)院動物研究所校園中采集土壤樣品，樣品用直徑2mm的濾網(wǎng)過濾，除去土壤中的顆粒物質(zhì)。土壤樣品存放于4°C冰箱。取一部分土壤樣品，用氯仿熏蒸法對土壤進(jìn)行消毒處理先將氯仿加入盛有土壤的容器中，密閉容器，使其散發(fā)為氣態(tài)，滲入土壤樣本以殺死所有微生物，再開啟容器使土樣中殘余氣態(tài)氯仿全部散發(fā)。將Y-六六六加入到IOOg 土壤中，使其終濃度為20mg/kg,攪拌混合均勻。將LZ-2的細(xì)胞懸液以每g 土壤IO6個細(xì)胞接種量加入到IOOg熏蒸和未熏蒸的土壤中，攪拌混合均勻。未接種LZ-2的熏蒸的土壤和未接種LZ-2的未熏蒸的土壤作為對照。土壤置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d。在整個培養(yǎng)期間，不斷噴灑添加無菌的去離子水，以保持土壤的含水量在50%附近。測定LZ-2在土壤中是否對Y-HCH具有降解作用，同時研究HZ-I在有額外的碳源存在下與土壤中其他微生物的相互關(guān)系，本研究中分別將HZ-I接種到熏蒸土壤和未熏蒸土壤兩種處理中，未接種的熏蒸土壤和未接種的未熏蒸土壤作為對照，每個對照和處理都重復(fù)三次。熏蒸的土壤,接種在0天、2. 5天、5天、7. 5天、10天、12. 5天、15天、17. 5天、20天剩余丙體六六六濃度為20mg/kg、18. 872mg/kg、17. 18mg/kg、15. 21mg/kg、13. 21mg/kg、8. 523mg/kg、4. 92mg/kg、0mg/kg、0mg/kg ；未熏蒸的土壤，接種在2天、2. 5天、5天、7. 5天、10天、12. 5天、15天、17. 5天、20天剩余丙體六六六濃度為20mg/kg、18. 92mg/kg、17. 92mg/kg、16. 92mg/kg、14. 93mg/kg、12. 123mg/kg、6. 754mg/kg、2. 64mg/kg、0mg/kg ；未熏蒸的土壤,未接種在2天、2. 5天、5天、7. 5天、10天、12. 5天、15天、17. 5天、20 天剩余丙體六六六濃度為20mg/kg、19. 89mg/kg、19. 78mg/kg、19. 87mg/kg、18. 98mg/kg、18. 99mg/kg、17. 98mg/kg、17. 98mg/kg、17. 68mg/kg熏蒸的土壤,未接種在2天、2. 5天、5天、7. 5天、10天、12. 5天、15天、17. 5天、20天剩余丙體六六六濃度為20mg/kg、19. 99mg/kg> 19. 97mg/kg> 19. 98mg/kg> 19. 89mg/kg、19. 87mg/kg、19. 87mg/kg、19. 88mg/kg、19. 84mg/kg ；作圖如圖6所示， _熏蒸的土壤，接種；■-未熏蒸的土壤，接種；籲-熏蒸的土 壤，未接種；▲_未熏蒸的土壤，未接種，可以看出，在20天內(nèi)，兩種對照中的Y-HCH的濃度幾乎都沒有變化，Y-HCH在經(jīng)熏蒸的土壤中的降解速率明顯比在未熏蒸土壤快，在熏蒸的土壤中17天基本可以完全降解，而在未熏蒸土壤中需要20天。20天后LZ-2能從未經(jīng)熏蒸的土壤中分離出來，這說明在該土壤中的降解作用主要由LZ-2完成。以上結(jié)果說明，LZ-2菌株在施入土壤中后，沒有出現(xiàn)不產(chǎn)生降解或降解率急劇下降的現(xiàn)象，它的降解性能仍然穩(wěn)定和優(yōu)良，這就為該菌株作為受六六六污染的土壤修復(fù)劑提供了科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)表明該菌對六六六污染的土壤有良好的修復(fù)能力，為該菌的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.Sphingobium japonicumLZ-2,其保藏號為 CGMCC No. 3540。
2.權(quán)利要求I所述Sphingobiumjaponicum LZ-2CGMCC No. 3540在降解農(nóng)藥中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于 所述農(nóng)藥為六六六。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于 所述六六六為丙體六六六。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在干 所述降解的溫度為15°C _45°C，所述降解的溫度具體為25°C _35°C，所述降解的溫度尤其優(yōu)選為25で。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在干 所述降解的PH為5. 5-8. 5，所述降解的pH具體為5. 5-7. 5，所述降解的pH尤其優(yōu)選為5.50
7.權(quán)利要求I所述的菌在制備降解農(nóng)藥的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于 所述農(nóng)藥為六六六，所述農(nóng)藥具體為丙體六六六。
9.權(quán)利要求I所述的菌在對六六六污染土壤的生物修復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種降解六六六的菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的鞘脂單胞桿菌(Sphingobium japonicum)LZ-2，其保藏號為CGMCC No.3540。所述鞘脂單胞桿菌(Sphingobium japonicum)LZ-2CGMCC No.3540在降解農(nóng)藥中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的Sphingobium japonicum LZ-2 CGMCC No.3540是從長期受六六六和滴滴涕等有機(jī)氯農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選的，該菌能在10小時內(nèi)完全降解20mg/l的林丹。
文檔編號C02F3/34GK102757906SQ201110112430
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者喬傳令, 蘭文升, 劉正, 宋文麗, 崔峰, 張衡, 江紅 申請人:中國科學(xué)院動物研究所