專利名稱：一種水中緩釋微生態(tài)菌劑的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和微生態(tài)制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌是一種成熟的微生態(tài)制劑，將其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，能起到凈化養(yǎng)殖水體，降低水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)病率，提高存活率等有益效果。目前市場上的枯草芽孢桿菌制劑均為其芽孢干粉，使用前必須先行活化，由于該菌株為好氧菌，濃度過高繁殖過快將迅速降低水中溶解氧，影響水產(chǎn)動物的生存，因此，投料濃度有一定的限制，且使用周期較短，在7 15天之間。本發(fā)明將提供一種在水中緩釋的枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，解決其投料濃度較低，使用周期較短的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可有效凈化養(yǎng)殖水體、降低水產(chǎn)動物的發(fā)病率的水中緩釋的微生態(tài)菌劑及其制備方法。本發(fā)明制劑的制備方法1、枯草芽孢桿菌的制備1. 1培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(g/L)營養(yǎng)瓊脂20，pH7. 0-7. 2種子培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏12，氯化鈉 5，MnSO4O. 5，ρΗ7· 0-7. 2。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖80 100，豆餅粉10 15，玉米淀粉5 7，(NH)2S044, K2HP048, CaCl22, ρΗ7· 0-7. 2。1· 2培養(yǎng)條件斜面培養(yǎng)37°C恒溫培養(yǎng)48h。種子培養(yǎng)從試管斜面接種一環(huán)至種子培養(yǎng)基，200rpm, 37°C搖床培養(yǎng)16h。發(fā)酵培養(yǎng)將種子液以3 5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，5L發(fā)酵罐，500rpm， 37°C 培養(yǎng) 40 48h。1. 3枯草芽孢桿菌芽孢的收集取發(fā)酵培養(yǎng)液，IOOOOrpm離心5min收集芽孢，80°C鼓風(fēng)干燥4h，得到芽孢粉末。2、微膠囊的制備方法2.1微膠囊評估指數(shù)包埋率(encapsulated efficiency, EE)=(投入的芽孢總量-溶液中未包埋的芽孢量)/投入的芽孢總量X100%載菌量(Bacteria loading, BL)=微膠囊中芽孢總量/微膠囊總質(zhì)量X 100%評估指數(shù)(evaluating indicator, EI) = (EE+BL) /22. 2微膠囊的制備將0. 8g的明膠和1. 5g的海藻酸鈉混合后融于IOOml蒸餾水，投入2%芽孢干粉充分混勻，通過2mm的銳孔，邊攪拌邊擠壓滴入10%的氯化鈣固化液，形成直徑為3 5mm的微膠囊，其芽孢包埋率達(dá)到87%以上。3、本發(fā)明制劑的應(yīng)用效果將本發(fā)明產(chǎn)品應(yīng)用于河蝦養(yǎng)值，其投料周期為60天，水體pH控制7. 0 7. 5之間， 氨氮含量低于0. %ig/L，溶解氧高于3. Omg/L，河蝦存活率為99%以上。起到了有效凈化水體和降低發(fā)病率的作用。


圖1海藻酸鈉質(zhì)量濃度對微膠囊的影響圖2明膠質(zhì)量濃度對微膠囊的影響圖3CaCl2質(zhì)量濃度對微膠囊的影響圖4芽孢質(zhì)量濃度對微膠囊的影響
具體實施例方式實施例1 枯草芽孢桿菌芽孢的富集培養(yǎng)本發(fā)明所使用的枯草芽孢桿菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 3871，保藏日期2010年5月M日。將該菌從保存的斜面轉(zhuǎn)接于新鮮斜面，于37°C恒溫培養(yǎng)48h。從斜面接種一環(huán)至50ml種子培養(yǎng)基，37°C>200rpm搖床震蕩培養(yǎng)16h。5L發(fā)酵罐中裝入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，以5%的接種量接入種子液，500rpm，37°C 培養(yǎng)4 得到芽孢發(fā)酵液。將發(fā)酵液于IOOOOrpm離心5min收集芽孢，80°C鼓風(fēng)干燥4h，得到芽孢粉末作為微膠囊芯材。實施例2 枯草芽孢桿菌微膠囊的制備以明膠和海藻酸鈉作為混合壁材，以枯草芽孢桿菌芽孢干粉作為芯材，以氯化鈣作為固化液，采用銳孔凝固法制備微膠囊。研究了各個成分對微膠囊物理性能的影響。1、海藻酸鈉質(zhì)量濃度對微膠囊制備的影響保持明膠濃度為0. 6% ,CaCl2濃度為10%，芯材芽孢濃度為2%，采用不同濃度的海藻酸鈉制備微膠囊結(jié)果如圖1 海藻酸鈉濃度小于1. 5%時，微膠囊的載菌量和包埋率與海藻酸鈉濃度成正比，之后成反比。這可能是由于海藻酸鈉質(zhì)量濃度太低時，明膠-海藻酸鈉聚電解質(zhì)膜過薄，形成的微球機械強度低，不能有效地對芯材進(jìn)行包埋；而海藻酸鈉質(zhì)量濃度過高時，體系黏度大，包埋效果不佳。海藻酸鈉最佳添加濃度為1.5%。2、明膠質(zhì)量濃度對微膠囊制備的影響保持海藻酸鈉濃度為1. 5% ,CaCl2濃度為10%，芯材芽孢濃度為2%，采用不同濃度的明膠制備微膠囊結(jié)果如圖2 明膠添加濃度在0. 8%時，微膠囊的載菌量和包埋率都達(dá)到最佳效果。3、CaCl2質(zhì)量濃度對微膠囊制備的影響保持海藻酸鈉濃度為1. 5%，保持明膠濃度為0. 8%，芯材芽孢濃度為2%，采用不同濃度的CaCl2固化液制備微膠囊結(jié)果如圖3 微膠囊的評估指數(shù)與CaCl2添加量成正比， 當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度達(dá)到10%時，微膠囊的載菌量和包埋率均達(dá)到最佳效果，繼續(xù)添加CaCl2 不能明顯增加微膠囊的評估指數(shù)。
4、芯材芽孢質(zhì)量濃度的確定根據(jù)上訴實驗結(jié)果，保持海藻酸鈉濃度為1. 5%，保持明膠濃度為0. 8%, CaCl2濃度為10%不變，研究枯草芽孢桿菌的最佳添加量，結(jié)果如圖4 微膠囊的載菌量隨著芽孢濃度的增加而增加，而包埋率隨著濃度的增加而降低，當(dāng)芽孢濃度為2. 0%時，兩者效果之和最佳，評估指數(shù)達(dá)到最高值。5、不同pH條件下微膠囊的緩釋作用將枯草芽孢桿菌微膠囊置于不同pH值得緩沖體系中，24h后測膠囊內(nèi)剩余芽孢量，計算其釋放速率，結(jié)果見表1 低PH值下，微膠囊殼體的海藻酸鈣緩慢溶解，從而增加微膠囊的通透性，芯材枯草芽孢桿菌向水體的滲透速率增加。水體PH值下降是養(yǎng)殖水體水質(zhì)下降的表現(xiàn)之一，本發(fā)明利用這一特性，使微膠囊的釋放速率隨水質(zhì)下降而增加，從而有效的調(diào)控水體質(zhì)量。表1微膠囊緩釋速率及使用周期
權(quán)利要求
1.一種微生態(tài)緩釋菌劑，其特征是枯草芽孢桿菌微膠囊制品。
2.如權(quán)利要求1所述的微膠囊制品，其制備方法為以2.0%枯草芽孢桿菌芽孢為芯材，以0. 8%明膠和1. 5%海藻酸鈉為復(fù)合壁材，以10%氯化鈣為固化劑，采用銳孔凝固法制得微膠囊/微球，包埋率達(dá)87%以上，直徑為3 5mm。
3.如權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑，其作用效果為有效凈化水體，降低水體氨氮含量，提高水體溶解氧，降低養(yǎng)殖動物的發(fā)病率。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種水中緩釋的微生態(tài)菌劑，為枯草芽孢桿菌微膠囊制品，主要應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖以及環(huán)境水體凈化。它是以2.0％枯草芽孢桿菌芽孢為芯材，以0.8％明膠和1.5％海藻酸鈉為復(fù)合壁材，以10％氯化鈣為固化劑，采用銳孔凝固法制得微膠囊，包埋率達(dá)87％以上，微膠囊直徑為3～5mm。本發(fā)明產(chǎn)品應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，可起到凈化水體、抑制病原菌的作用，使用周期達(dá)60天以上。
文檔編號C02F3/34GK102409035SQ20111011625
公開日2012年4月11日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者史勁松, 張旦旦, 竇文芳, 許正宏 申請人:江南大學(xué)