專利名稱：來自放射形土壤桿菌p230的磷酸三酯酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠水解有機(jī)磷酸酯(organophosphate，OP)分子的酶。具體而言， 本發(fā)明涉及水解OP殺蟲劑的磷酸三酯酶(phosphotriesterase enzyme)及其編碼基因，該磷酸三酯酶鑒定自由土壤中分離得到的放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)菌株。本發(fā)明還涉及該鑒定的磷酸三酯酶的突變體，所述的突變體具有改變了的底物特異性。
背景技術(shù)：
有機(jī)磷酸酯殺蟲劑是環(huán)境以及一系列日用品中的不良污染物。最具敏感性的領(lǐng)域包括土壤的污染、再循環(huán)的灌溉廢水的污染(污染的廢水被下游的灌溉者使用或直接讓其流出農(nóng)場(chǎng))、以及在農(nóng)業(yè)和園藝出口商品中存在超標(biāo)的殘余物。有機(jī)磷酸酯類中毒是接觸此類化學(xué)品的農(nóng)業(yè)工人面臨的一個(gè)問題，對(duì)于在化學(xué)戰(zhàn)中接觸有機(jī)磷酸酯類的軍事人員來說也是如此。此外，戰(zhàn)略儲(chǔ)備的有機(jī)磷神經(jīng)毒劑也需要進(jìn)行解毒處理。因此，急需一些生物補(bǔ)救策略來清除或減少此類有機(jī)磷酸酯的殘余物和/或儲(chǔ)備。提出的方案之一涉及使用能夠使有機(jī)磷酸酯殘基固定或發(fā)生降解的酶。這些酶例如可被用于生物反應(yīng)裝置通過其能夠使被污染的水達(dá)到合格，或是用于洗滌溶液中以便在對(duì)水果、蔬菜或動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行收獲后殺蟲能夠降低殘余物的水平和存留時(shí)間。適合用于對(duì)有機(jī)磷酸酯殘余物進(jìn)行降解的酶包括來自細(xì)菌的OP水解酶(Mulbry，1992 ；Mulbry和 Kearney, 1991 ；Cheng 等，1999 ；US 5，484，728 ；US5, 589，386)、來自脊椎動(dòng)物的 OP 水解酶 (Wang 等，1993 ； 1998 ；Gan 等，1991 ；Broomfield 等，1999)、以及來自 OP 抗性昆蟲的 OP 水解酶(W0 95/19440和W097/19176)。符合要求的OP水解酶應(yīng)該能夠快速降解有機(jī)磷酸酯殘余物。研究得最為深入的OP降解酶是細(xì)菌的有機(jī)磷酸酯二水解酶(organophosphate dihydrolase, 0PD)，其由保藏號(hào)為 ATCC 27551 的黃桿菌菌種(Flavobacterium sp.)和缺陷短波單胞菌 MG (Brevundimonas diminuta MG) (Harper 等，1988 ；Mulbry 和 Karns，1989) 中的不同的質(zhì)粒上的相同的基因編碼。OPD是一種同二聚體蛋白，能夠水解很多種磷酸三酯 (氧OP和硫OP均可)(Dumas等，1989a,b)。其反應(yīng)機(jī)制直接或間接地涉及金屬離子，優(yōu)選為Zn++。OPD對(duì)于磷酸單酯或二酯不具有可檢測(cè)到的活性(Dumas等，1989a, b ； 1990)。已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichia coli) (ePHP)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) (mtPHP)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae) (mpPHP)的基因組中鑒定出了 OPD同源物(磷酸三酯酶同源蛋白(磷酸三酯酶homology proteins，PHP))，不過，僅對(duì)ePHP的磷酸三酯酶活性進(jìn)行了測(cè)試(Scanlan和Reid, 1995 ；Buchbinder等，1998)。在 ePHP的組裂解物中未檢測(cè)到其對(duì)任何一種測(cè)試的底物具有活性，例如ρ-硝基苯乙酸酯、雙 (ρ-硝基苯)磷酸酯、對(duì)氧磷(paraoxon)和p_硝基苯磷酸酯。
在脊椎動(dòng)物中也鑒定出了 OPD同源物(Davies等，1997)，盡管其在這些有機(jī)體中的功能仍是未知的。0PD、ePHP、mtPHP和哺乳動(dòng)物的PHP在氨基酸水平具有27-30%的相同性，不過mpPHP的相同性稍低。涉及與Si++結(jié)合的氨基酸殘基在迄今為止所鑒定到的磷酸三酯酶家族的六種成員中是保守的(Buchbinder等，1998)。自暴露于OP的細(xì)菌中已經(jīng)分離出另外三種截然不同的OP水解酶(Mulbry和 Karns, 1989 ；Mulbry, 1992 ；Cheng等，1999)。其中的兩種已經(jīng)得到了其序列信息，兩者之間以及與OPD之間均不相關(guān)。一種為來自交替單胞菌菌種(Alteromonas sp.)的氨?；彼岫拿?prolidase)，通常在X-Pro 二肽的水解中起作用。研究報(bào)道其對(duì)于殺蟲劑類 OP的活性適中，不過其k。at/K ^#異性常數(shù)尚未被報(bào)道(Cheng等，1999)。另一種為來自諾卡氏菌菌種(Nocardia sp. )B-1菌株的芳基二烷基磷酸酯酶(aryldialkylphosphatase) (ADPase)，其對(duì)于乙基對(duì)硫磷(parathion)的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnover number)與報(bào)道的OPD相比要低 4500 倍(Mulbry 和 Karns, 1989 ；Mulbry, 1992)。對(duì)氧磷酶或PONl是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一種截然不同的OP水解酶。與OPD相似，其為一種金屬酶(其金屬離子優(yōu)選為Ca++)，在血漿中與低密度脂蛋白結(jié)合，通常參與對(duì)氧化的脂質(zhì)化合物的代謝(Gan等，1991 ；Sorenson等，19%)。其對(duì)于對(duì)氧磷具有高度的活性，特異性常數(shù)在 IO6M-1Sec-1 左右(Doorn 等，1999 ；Hong 和 Raushel，1999)。還有證據(jù)顯示在大量的脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物以及微生物中存在其他的、被稱為二異丙基氟磷酸酯酶(diisopropyl fluorophosphatase) (DFPase)的酶(Wang 等，1998 ； Hoskin等，1999 ；Billecke等，1999)。這些酶在其生化特性的許多方面具有顯著的不同，但其共同特征為對(duì)于OP類化學(xué)武器毒劑都具有水解活性。僅有的一些序列信息提示它們與上述所有其他的OP水解酶均無關(guān)聯(lián)。對(duì)OP具有抗性的麗蠅(blowfly)和家蠅是對(duì)氧OP樣chlorfenvinfos (CVP)和羧酸酯OP樣馬拉硫磷(malathion)具有活性的酯酶的來源(Newcomb等，1997 ；Campbe 11等， 1998 ；Claudianos 等，1999 ；WO 95/19440 ；WO 97/19176)。將麗蠅酯酶 E3 (及其家蠅直向同源物(ortholog)，ALI)的第137位殘基的Gly以Asp取代導(dǎo)致其具有了對(duì)CVP的活性，而將其第251位殘基的Trp以Leu/Ser取代的突變導(dǎo)致其產(chǎn)生針對(duì)馬拉硫磷的活性。但這些酶對(duì)其OP底物的特異性常數(shù)要較OPD對(duì)對(duì)氧磷的特異性常數(shù)低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。因此需要更多的能夠用于生物補(bǔ)救策略的OP降解酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)建立了一種快速敏感的蠅毒磷(Coumaphos)( 一種硫OP殺蟲劑)水解熒光分析法，并用該方法自被污染的土壤中分離出一種能夠?qū)P作為唯一磷源的細(xì)菌。 16S rDNA測(cè)序?qū)⒃摷?xì)菌(分離物230)鑒定為放射形土壤桿菌的一種菌株。本發(fā)明人還已經(jīng)分離并鑒定了具有這種蠅毒磷水解活性的酶，并提供了該酶在生物補(bǔ)救策略中的用途。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種基本上純化的多肽，該多肽選自⑴包含SEQ ID NO 1的序列的多肽；(ii)包含SEQ ID NO 2的序列的多肽；(iii)包含SEQ ID NO 3的序列的多肽；(iv)包含SEQ ID NO 4的序列的多肽；或
(ν)包含與⑴至(iv)中任一序列的相同性大于90%的序列的多肽，其中所述的多肽能夠水解有機(jī)磷酸酯分子。優(yōu)選的有機(jī)磷酸酯分子包括，但不限于，蠅毒磷、香豆磷(coroxon)、對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、對(duì)硫磷-甲基、亞胺硫磷(phosmet)、倍硫磷(fenthion)、二嗪農(nóng)(diazinon)、毒死蜱 (chlorpyrifos)、dMUP、DFP、樂果(dimethoate)、馬拉硫磷和馬拉氧磷(malaoxon)。更優(yōu)選地，所述的有機(jī)磷酸酯是亞胺硫磷或倍硫磷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽可純化自放射形土壤桿菌菌種。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該肽與(i)至(iv)中任一多肽具有至少95%的相同性，更優(yōu)選地具有至少97%的相同性，而更進(jìn)一步優(yōu)選地與(i)至(iv)中任一多肽具有至少99%的相同性。在另一方面，本發(fā)明提供了一種基本上純化的多肽，該多肽選自⑴包含SEQ ID NO 1的序列的多肽；(ii)包含SEQ ID NO 2的序列的多肽；或(iii)與⑴或(ii)的相同性大于90%的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了一種融合多肽，其包含融合于至少一種其他多肽序列的本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，所述的至少一種其他多肽選自增強(qiáng)本發(fā)明的多肽的穩(wěn)定性的多肽，以及有助于對(duì)該融合多肽進(jìn)行純化的多肽。優(yōu)選地，所述的至少一種其他多肽是麥芽糖結(jié)合蛋白。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸包含選自以下的序列(i)SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列；(iii) SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列；(iv) SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列；(ν)編碼本發(fā)明的多肽的序列；或(vi)與(i)至(ν)中任一序列具有至少90%的相同性的序列，其中所述的多核苷酸編碼能夠水解有機(jī)磷酸酯分子的多肽。優(yōu)選地，所述的多核苷酸與上述⑴至(ν)中任一序列具有至少95%的相同性，更優(yōu)選地具有至少97%的相同性，且進(jìn)一步更優(yōu)選地具有至少99%的相同性。在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。優(yōu)選地，所述的載體適合于進(jìn)行多核苷酸的復(fù)制和/或表達(dá)。所述的載體可以是， 例如，質(zhì)粒、病毒或噬菌體，其具有復(fù)制起點(diǎn)、且優(yōu)選地具有用來表達(dá)該多核苷酸的啟動(dòng)子、 以及任選地具有該啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列(regulator)。該載體可以含有一或多個(gè)選擇標(biāo)記，例如細(xì)菌質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的新霉素抗性基因。該載體可以在體外用于例如產(chǎn)生RNA，或者用來轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了用于制備本發(fā)明的多肽的方法，該方法包括在可產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，并回收所述的多肽。此類細(xì)胞可被用于生產(chǎn)具有商業(yè)用途的量的所述被編碼的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了用于水解有機(jī)磷酸酯分子的組合物，該組合物包含本發(fā)明的多肽，以及一或多種可接受的載體。在另一方面，本發(fā)明提供了用于水解有機(jī)磷酸酯分子的組合物，該組合物包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及一或多種可接受的載體。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明可以用來水解樣品中的有機(jī)磷酸酯。例如，當(dāng)作物被噴灑有機(jī)磷酸酯殺蟲劑后，在被人食用之前，該有機(jī)磷酸酯的殘存物能夠自種子、果實(shí)和蔬菜上面被水解去除。類似地，被有機(jī)磷酸酯污染的土壤或水也可以用本發(fā)明的多肽進(jìn)行處理。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了用來水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，該方法包括將所述的樣品暴露于本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，該多肽被作為本發(fā)明的組合物而被提供。此外，優(yōu)選的是該方法進(jìn)一步包括將該樣品暴露于一種二價(jià)陽(yáng)離子。優(yōu)選地，所述的二價(jià)陽(yáng)離子是鋅。優(yōu)選地，所述的樣品選自土壤、水、生物物質(zhì)、或上述物質(zhì)的組合。優(yōu)選的生物學(xué)樣品包括來自植物的物質(zhì)例如種子、蔬菜或果實(shí)，以及來自動(dòng)物的物質(zhì)例如肉。優(yōu)選的有機(jī)磷酸酯分子包括但不限于蠅毒磷、香豆磷、對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、對(duì)硫磷-甲基、亞胺硫磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱、dMUP、DFP、樂果、馬拉硫磷和馬拉氧磷。更優(yōu)選地，所述的有機(jī)磷酸酯是亞胺硫磷或倍硫磷。樣品可以任何可行的途徑被暴露于所述的多肽。這包括將所述的多肽直接提供給該樣品，可以使用或不使用載體或賦形劑等等。所述的多肽也可以宿主細(xì)胞的形式被提供， 典型地為微生物，例如細(xì)菌或真菌，其表達(dá)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸。通常，所述多肽將作為本發(fā)明的組合物而被提供。樣品中存在的有機(jī)磷酸酯分子也可以通過將該樣品暴露于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)基因植物而被水解。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)基因植物。在另一方面，本發(fā)明用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，該方法包括將所述的樣品暴露于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，所述的樣品是土壤。此外，優(yōu)選的是所述的多肽至少產(chǎn)生于該轉(zhuǎn)基因植物的根部。在另一方面，本發(fā)明提供了于2001年4月20日保藏于澳大利亞政府分析實(shí)驗(yàn)室的、保藏號(hào)為NM01/21112的、一種分離的放射形土壤桿菌菌株。在另一方面，本發(fā)明提供了用于水解有機(jī)磷酸酯分子的組合物，該組合物包含本發(fā)明的放射形土壤桿菌菌株，以及一或多種可接受的載體。在另一方面，本發(fā)明提供了用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，該方法包括將所述的樣品暴露于本發(fā)明的放射形土壤桿菌菌株。本發(fā)明所公開的內(nèi)容可以被輕易地用于分離其他能夠水解有機(jī)磷酸酯的細(xì)菌菌種/菌株。例如，可通過在此所揭示的熒光檢測(cè)篩選方法來分離其他的細(xì)菌菌種/菌株?；蛘?，可基于本發(fā)明的多核苷酸來設(shè)計(jì)探針和/或引物，用以鑒定產(chǎn)生天然存在的本發(fā)明的多肽的變體的細(xì)菌。
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因此，在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的分離的細(xì)菌。優(yōu)選地，所述的細(xì)菌是放射形土壤桿菌菌種。更優(yōu)選地，該細(xì)菌是放射形土壤桿菌的一種菌株。在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的、分離的、天然存在的細(xì)菌在水解樣品中的有機(jī)磷酸酯中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了用于水解有機(jī)磷酸酯分子的聚合的海綿劑(sponge) 或泡沫劑(foam)，所述的泡沫劑或海綿劑包含固定于聚合多孔支持物上的本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，所述的多孔支持物包含聚氨酯(polyurethane)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的海綿劑或泡沫劑進(jìn)一步包含包埋或整合到所述多孔支持物的表面或內(nèi)部的碳。在另一方面，本發(fā)明提供了用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，該方法包括將所述的樣品暴露于本發(fā)明的海綿劑或泡沫劑。在另一方面，本發(fā)明提供了用于探測(cè)是否存在有機(jī)磷酸酯的生物傳感器，所述的傳感器包含本發(fā)明的多肽以及用于探測(cè)有機(jī)磷酸酯分子被所述的多肽水解的裝置。在另一方面，本發(fā)明提供了用于篩選水解有機(jī)磷酸酯分子的制劑的方法，該方法包括(i)將所述的有機(jī)磷酸酯暴露于候選制劑，并(ii)測(cè)定自步驟(i)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)，其中所述的熒光信號(hào)表明了有機(jī)磷酸酯的水解。優(yōu)選地，所述的有機(jī)磷酸酯是蠅毒磷或香豆磷。此外，優(yōu)選的是所述的制劑是多肽或微生物。本發(fā)明的多肽可以被誘變，且得到的突變體可用于從中篩選改變的活性，例如為底物特異性的改變。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生多肽的方法，所述的多肽具有增強(qiáng)的水解有機(jī)磷酸酯的能力或?qū)τ袡C(jī)磷酸酯的底物特異性被改變，該方法包括(i)在本發(fā)明的一種第一多肽中產(chǎn)生一或多個(gè)氨基酸的突變，(ii)測(cè)定該突變體水解有機(jī)磷酸酯的能力，并(iii)選擇一種突變體，該突變體與所述的第一多肽相比具有增強(qiáng)的水解有機(jī)磷酸酯的能力或?qū)τ袡C(jī)磷酸酯的底物特異性被改變。如實(shí)施例部分所述，已經(jīng)成功地用該方法生產(chǎn)出了如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的多肽。優(yōu)選地，該第一多肽為選自SEQ ID NO :1至4中的任一多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了由上述方法產(chǎn)生的多肽。在說明書全文中出現(xiàn)的“包含” 一詞，其含義應(yīng)理解為是指包括了所述的一個(gè)元素、整數(shù)或步驟，或是一組元素、整數(shù)或步驟，但并不排除任何其他元素、整數(shù)或步驟，或是其他組元素、整數(shù)或步驟。以下將通過下面這些非限制性的圖和實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。


圖1 蠅毒磷的結(jié)構(gòu)及其水解產(chǎn)物。圖2 :opdA的DNA序列(SEQ ID NO :5)。編碼信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域的區(qū)域以粗體顯示，其余部分的序列在此被稱為SEQ ID NO :6。圖3 =OpdA的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。信號(hào)肽以粗體顯示。圖4 =OPD (SEQ ID NO 17)和OpdA之間的氨基酸序列比對(duì)。分泌信號(hào)以粗體顯示。序列表注釋SEQIDNO= I-OpdA的多肽序列。
SEQIDNO2-減去信號(hào)序列的OpdA的多肽序列。
SEQIDNO3—OpdAl的多肽序列。
SEQIDNO4—0pdA2的多肽序列。
SEQIDNO5-編碼OpdA的多核苷酸序列。
SEQIDNO6-編碼減去信號(hào)序列的OpdA的多核苷酸序列。
SEQIDNO:7—編碼OpdAl的多核苷酸序列。
SEQIDNO8-編碼0pdA2的多核苷酸序列。
SEQIDNO9至16—PCR引物。
SEQIDNO:17—來自黃桿菌菌種的OPD的多肽序列。
具體實(shí)施例方式通用技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明所使用的重組DNA技術(shù)均為本領(lǐng)域人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。有關(guān)此類技術(shù)的文獻(xiàn)可參見例如J. Perbal的《A Practical Guide to Molecular Cloning》(John Wiley 禾口 Sons(1984))、J. Sambrook 等的《Molecular Cloning :A Laboratory Manual》(Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989))、T. A. Brown (編) 的《Essential Molecular Biology :A Practical Approach》第一禾口第二卷(IRL Press (1991))、D. Μ· Glover 和 B. D. Hames (編)的《DNA Cloning :A Practical Approach))第一至第四卷(IRL Press (1995 和 1996))、以及 F. Μ. Ausubel 等(編)的《Current Protocols in Molecular Biology》(Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括迄今為止所有的更新版))。有機(jī)磷酸酯有機(jī)磷酸酯是合成的有機(jī)磷酸酯和相關(guān)的化合物例如氨基磷酸鹽 (phosphoroamidate)。其具有通式(RR' X)P = 0 或(RR' X)P = S，其中 R 和 R'是短鏈基團(tuán)。對(duì)于用作殺蟲劑的有機(jī)磷酸酯，X是良好的離去基團(tuán)(leaving group)，其對(duì)于造成乙酰膽堿酯酶的不可逆抑制是必需的。本發(fā)明的多肽水解有機(jī)磷酸酯的磷酸酯鍵。這些有機(jī)磷酸酯可以是、但不限于氧和硫0P。有機(jī)磷酸酯可以具有芳香族或脂肪族離去基團(tuán)(X)。盡管有機(jī)磷酸酯作為殺蟲劑的用途是眾所周知的，但有機(jī)磷酸酯也被用作針對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)毒氣。因此，可以展望本發(fā)明的多肽也能夠用于水解殺蟲劑以外的有機(jī)磷酸
“基本上純化的多肽"是指一種多肽，其通常已經(jīng)自脂質(zhì)、核酸、其他多肽以及那些與其在天然狀態(tài)下有關(guān)聯(lián)的其他污染分子中分離出來。優(yōu)選地，所述的基本上純化的多肽自與其在天然狀態(tài)下有關(guān)聯(lián)的其他成分中被分離的程度為至少60%，更優(yōu)選地為至少 75%，最優(yōu)選地為至少90%。通過FASTA(Pearson和Lipman，1988)分析(GCG程序)來測(cè)定多肽的相同性的百分?jǐn)?shù)，其使用默認(rèn)設(shè)置和一長(zhǎng)度為至少50個(gè)氨基酸的查詢序列，由此該FASTA分析可對(duì)兩個(gè)序列在至少為50個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行比對(duì)。更優(yōu)選地，該FASTA分析可對(duì)兩個(gè)序列在至少為100個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行比對(duì)。進(jìn)一步優(yōu)選地，該FASTA分析可對(duì)兩個(gè)序列在至少為250個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行比對(duì)。更進(jìn)一步優(yōu)選地，該FASTA分析可對(duì)兩個(gè)序列在至少為350個(gè)氨基酸的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行比對(duì)。通過在核酸序列中造成核苷酸的適當(dāng)?shù)母淖?，或通過體外合成所需的多肽，可以制備氨基酸序列突變的本發(fā)明的多肽。此類突變包括例如氨基酸序列中的殘基的缺失、插入或取代?？蛇M(jìn)行缺失、插入或取代的組合以得到最終的構(gòu)建體，條件是最終的蛋白產(chǎn)物具有所需的特征。實(shí)施例8給出了本發(fā)明的突變的例子。在設(shè)計(jì)氨基酸序列的突變時(shí)，突變位點(diǎn)的定位以及突變的性質(zhì)取決于所要對(duì)其進(jìn)行修飾的特征?？蓪?duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行單個(gè)或系列修飾，例如，通過(1)首先以可供選擇的保守氨基酸進(jìn)行取代，然后根據(jù)得到的結(jié)果進(jìn)行更多基團(tuán)的選擇，(2)使靶殘基缺失或C3)在定位的位點(diǎn)附近插入其他殘基。氨基酸序列的缺失通常為大約1至30個(gè)殘基，更優(yōu)選地為大約1至10個(gè)殘基且典型地為大約1至5個(gè)相鄰的殘基。取代突變?yōu)槎嚯姆肿又械闹辽僖粋€(gè)氨基酸殘基被去掉并在其原來的位置上插入一個(gè)不同的殘基。進(jìn)行取代誘變時(shí)最受關(guān)注的位點(diǎn)包括被鑒定為活性位點(diǎn)的那些位點(diǎn)。其他受關(guān)注的位點(diǎn)是那些在各種物種中具有相同性的特定殘基。這些位點(diǎn)可能對(duì)生物學(xué)活性而言十分重要。這些位點(diǎn)，特別是那些屬于具有至少3個(gè)其他的相同性保守位點(diǎn)的序列的位點(diǎn)，優(yōu)選地以相對(duì)保守的方式進(jìn)行取代。此類保守取代顯示于表1，標(biāo)題為"代表性的取代〃。由于SEQ ID NO :1的序列與黃桿菌OPD酶的序列具有90%的相同性，因此SEQ ID NO :1可以被用來設(shè)計(jì)黃桿菌OPD酶的突變體，該酶具有所需的活性，但其相同性低于 90%。更具體地，可改變那些對(duì)于水解有機(jī)磷酸酯分子具有重要意義的氨基酸以與本發(fā)明的多肽相一致，而其他那些不影響此活性的氨基酸也可以被改變以確保相同性水平不會(huì)超過90%。此類OPD突變的例子包括L272F和/或H257Y的氨基酸改變。此類突變體也屬于本發(fā)明的范疇。表1.代表性的取代
原有殘基代表性取代Ala(A)val ；Ieu ；ile ；glyArg(R)Iys
權(quán)利要求
1.一種純化的多肽，該多肽選自(i)包含SEQ ID NO 1所示的序列的多肽； ( )包含SEQ ID NO 2所示的序列的多肽；(iii)包含SEQID NO 3所示的序列的多肽；(iv)包含SEQID NO :4所示的序列的多肽；或(ν)包含與⑴至(iv)中任一序列的相同性大于95%的序列的多肽， 其中所述的多肽能夠水解有機(jī)磷酸酯分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化的多肽，其中所述的有機(jī)磷酸酯分子選自蠅毒磷、香豆磷、對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、對(duì)硫磷-甲基、亞胺硫磷、倍硫磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱、dMUP、DFP、樂果、馬拉硫磷和馬拉氧磷。
3.—種純化的多肽，所述的多肽能夠水解亞胺硫磷和/或倍硫磷。
4.一種純化的多肽，所述的多肽能夠水解有機(jī)磷酸酯分子，并且其中所述的多肽與SEQ ID NO :17所示的多肽相比，具有增強(qiáng)的水解至少下述有機(jī)磷酸酯之一的能力蠅毒磷、香豆磷、對(duì)硫磷-甲基、亞胺硫磷、倍硫磷、毒死蜱、二嗪農(nóng)和/或dMUP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的純化的多肽，其中所述多肽可以自一種土壤桿菌 Agrobacterium sp.純化。
6.一種融合多肽，其包含融合于至少一種其他的多肽序列的根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的純化的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合多肽，其中所述的至少一種其他的多肽是麥芽糖結(jié)合蛋白。
8.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸包含選自如下序列的序列(i)SEQID NO 5所示的核苷酸的序列；(ii)SEQID NO 6所示的核苷酸的序列；(iii)SEQ ID NO 7所示的核苷酸的序列；(iv)SEQ ID NO 8所示的核苷酸的序列；(ν)編碼權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的多肽的序列；或 (vi)與⑴至(ν)中任一序列具有至少95%相同性的序列， 其中所述的多核苷酸編碼能夠水解有機(jī)磷酸酯分子的多肽。
9.一種包含根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的多核苷酸的載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其是病毒載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其是質(zhì)粒載體。
12.一種包含根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的載體的宿主細(xì)胞。
13.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，該方法包括在允許產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，并回收所述的多肽。
14.一種用于水解有機(jī)磷酸酯分子的組合物，該組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽和一或多種可接受的載體。
15.一種用于水解有機(jī)磷酸酯分子的組合物，該組合物包含根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞和一或多種可接受的載體。
16.一種用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，該方法包括將該樣品暴露于根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，其中所述多肽作為根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的組合物而被提供。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法， 進(jìn)一步包括將所述的樣品暴露于一種二價(jià)陽(yáng)離子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，其中所述的二價(jià)陽(yáng)離子是鋅。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法， 其中的樣品選自土壤、水、生物物質(zhì)或其組合。
21.一種用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，該方法包括將所述樣品暴露于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的多肽的轉(zhuǎn)基因植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，其中所述的多肽至少產(chǎn)生于所述轉(zhuǎn)基因植物的根部。
23.一種用于水解有機(jī)磷酸酯分子的聚合的海綿劑或泡沫劑，所述的泡沫劑或海綿劑包含固定于聚合多孔支持物上的根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用于水解有機(jī)磷酸酯分子的聚合的海綿劑或泡沫劑，其中所述的多孔支持物包含聚氨酯。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求M所述的用于水解有機(jī)磷酸酯分子的聚合的海綿劑或泡沫劑，其中所述的海綿劑或泡沫劑進(jìn)一步包含包埋或整合到所述多孔支持物的表面或內(nèi)部的碳。
26.一種用于水解樣品中的有機(jī)磷酸酯分子的方法，所述方法包括將所述的樣品暴露于根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)所述的用于水解有機(jī)磷酸酯分子的海綿劑或泡沫劑。
27.一種用于探測(cè)是否存在有機(jī)磷酸酯的生物傳感器，所述的傳感器包含根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的多肽以及用于探測(cè)有機(jī)磷酸酯分子被所述的多肽水解的裝置。
28.—種產(chǎn)生多肽的方法，所述的多肽具有增強(qiáng)的水解有機(jī)磷酸酯的能力或?qū)τ袡C(jī)磷酸酯的底物特異性被改變，該方法包括(i)在根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的一種第一多肽中產(chǎn)生一或多個(gè)氨基酸的突變，( )測(cè)定該突變體水解有機(jī)磷酸酯的能力，并(iii)選擇一種突變體，該突變體與所述的第一多肽相比具有增強(qiáng)的水解有機(jī)磷酸酯的能力或?qū)τ袡C(jī)磷酸酯的底物特異性被改變。
全文摘要
本發(fā)明提供了來自放射形土壤桿菌P230的磷酸三酯酶。具體地，本發(fā)明提供了自分離于土壤中的一種放射形土壤桿菌菌株中鑒定的水解OP殺蟲劑的磷酸三酯酶以及編碼該酶的基因。本發(fā)明還提供了該鑒定的磷酸三酯酶的突變體，所述突變體具有改變了的底物特異性。此外，本發(fā)明還提供了這些酶在生物補(bǔ)救策略中的用途。
文檔編號(hào)C02F1/00GK102229918SQ20111012643
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2002年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月15日
發(fā)明者麗貝卡·哈考特, 塔拉·薩瑟蘭, 約翰·奧克肖特, 羅賓·拉賽爾, 艾琳·霍恩 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織