專利名稱：一種高效異養(yǎng)硝化細菌篩選方法、篩選的菌株及其菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效異養(yǎng)硝化細菌篩選方法、篩選的菌株以及菌劑的制備方法， 生產(chǎn)出的水質(zhì)凈化微生物制劑可用于污水處理、水產(chǎn)養(yǎng)殖、水族箱或流動水系等水治理工程，屬于利用微生物對污水治理的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，亞硝酸鹽對人和動物毒性己引起重視，對亞硝酸鹽中毒的病理學的研究很多。動物亞硝酸鹽中毒最明顯的特征是，血液中高鐵血紅蛋白(MHb)的含量升高，紅細胞的載氧能力下降，造成組織缺氧，神經(jīng)麻痹，甚至窒息死亡，國外稱之為“褐血癥”(Brown Blood)。亞硝酸鹽對人類健康的影響集中于二點，一是可引起高鐵血紅朊癥，二是亞硝酸鹽在人體內(nèi)形成有致癌危害的亞硝胺。亞硝酸鹽是氨轉(zhuǎn)化為硝酸鹽過程中的中間產(chǎn)物，在養(yǎng)殖水體中由于大量的投餌而留下的殘餌、水體中水生動物的大量排泄物的累積和定期使用的消毒藥劑，把有害和有益的細菌同時大量殺滅，氧氣的供應(yīng)不足，造成大量累積的氨氮硝化過程受阻，形成養(yǎng)殖時水中氨氮和亞硝酸氮含量高。據(jù)長期在各地養(yǎng)殖塘的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)有50%以上的養(yǎng)殖魚塘會出現(xiàn)亞硝酸鹽含量超標，國外也有提到亞硝酸鹽積累是常見的水質(zhì)現(xiàn)象。更值得重視的是水中亞硝酸鹽含量超標目前已成為魚蝦養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控最棘手的問題。現(xiàn)在，控制亞硝酸鹽水平是水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要工作方向。解決好水產(chǎn)養(yǎng)殖亞硝態(tài)氮問題，將會促進我國經(jīng)濟和環(huán)境保護方面的可持續(xù)性發(fā)展。傳統(tǒng)對亞硝態(tài)氮的處理主要有換水法、化學氧化法及物理吸附法等，但都存在治標不治本或產(chǎn)生二次污染的問題。微生物修復(fù)指利用微生物的生命代謝活動降低環(huán)境中的有毒有害物質(zhì)的濃度使其無害化，從而使被污染的環(huán)境能夠部分或完全恢復(fù)到初始狀態(tài)的過程，具有效果好、投資少、安全性高等特點。目前已報道的亞硝酸鹽降解菌主要有硝化桿菌屬(Nitrobacter sp.)、石肖化螺菌屬(Nitrospira sp.)禾口石肖化球菌屬(Nitrococcus sp.) 等。但該類菌均為專性化能自養(yǎng)菌，對底物的要求專一性很強，嚴格好氧，且其生長緩慢，平均世代時間在IOh以上。正是這些菌的自身特性所局限，目前國內(nèi)外亞硝酸鹽降解菌菌劑的開發(fā)和使用程度較低，國外的產(chǎn)品價格比較昂貴，且主要用于水族箱等觀賞水生生物的養(yǎng)殖。但近來的研究表明，有些異養(yǎng)微生物也能進行硝化作用，如脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)禾口紅球菌(I h0d0C0CCUS sp.)等。與自養(yǎng)硝化細菌相比，異養(yǎng)硝化細菌具有生長速率快、要求溶解氧濃度低、能耐受更酸環(huán)境的優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對高濃度亞硝酸鹽的耐受能力強、亞硝酸鹽去除率高的異養(yǎng)硝化細菌的篩選方法、篩選得到的菌株以及以該菌株制備水質(zhì)凈化微生物制劑的生產(chǎn)方法。該方法所得到的異養(yǎng)硝化細菌——經(jīng)中國科學院微生物研究所鑒定為蠟狀芽孢桿菌，能夠較快的適應(yīng)環(huán)境，生長速率高，對低濃度和高濃度含亞硝酸鹽的污水均有很強的降解能力。本發(fā)明以上述蠟狀芽孢桿菌為出發(fā)菌株所制得的水質(zhì)凈化微生物制劑，活菌數(shù)高， 發(fā)酵周期短，發(fā)酵工藝簡便。所制得的產(chǎn)品能有效的緩解養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽超標的現(xiàn)狀， 降低環(huán)境污染。一種高效異養(yǎng)硝化細菌篩選方法，包括以下步驟(1)配制硝化細菌富集培養(yǎng)基，對菌種進行擴培和馴化所用富集培養(yǎng)基配方如下葡萄糖5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 05g、 FeSO4 · 7Η200· 02g、CaCl2O. Olg、NaNO2O. 1 2g、水 1L, ρΗ7· 2 ；將 IOml 含異養(yǎng)硝化細菌的活性污泥接種于90ml富集培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min的條件下恒溫震蕩培育，1 2d后，取上清液5ml加至IOOml新鮮的富集培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)，如此反復(fù)5次；每次逐漸提高培養(yǎng)液中NaNO2的濃度，其中NaNO2初始濃度為0. lg/L，然后提高至0. 5g/L、lg/L、l. 5g/L， 最終濃度為2g/L ；(2)將富集培養(yǎng)后的菌株轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)，分離純化，獲得降解率高的菌株。一株高效異養(yǎng)硝化細菌是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，保藏編號為CGMCC NO. 4918。一種水質(zhì)凈化微生態(tài)制劑的制備方法以所述蠟狀芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)過搖床種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵進行制備。采用LB培養(yǎng)基，300C，培養(yǎng)Mh，獲取新鮮斜面菌種用于種子培養(yǎng)。所述搖床種子培養(yǎng)條件為pH 7. 2、溫度30°C，轉(zhuǎn)速180 200r/min，培養(yǎng)10 12h ；培養(yǎng)基的組成為葡萄糖 5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4. 7H20 0. 05g、FeSO4. 7H20 0. 02g、 CaCl2O. Olg、NaNO2O. 5g、H2O 1L。所述液體發(fā)酵條件為20L罐裝量為12L，攪拌速度200 220r/min，初始pH 7.0 7.2，通氣量1 (0.9 1)，接種量3% (接種搖床種子培養(yǎng)液)J8 30°C溫度下發(fā)酵M ^h ；培養(yǎng)基組成為玉米粉15g/L，豆粕粉10g/L，酵母粉6g/L，NaCl 5g/L， MgSO4. 7H20 lg/L, K2HP042g/L, MnSO4. H2O 0. 05g/L, CaCO3 0. 01g/L，其余為水。本發(fā)明的異養(yǎng)硝化細菌篩選方法按照下述具體步驟進行一、采集含有土著異養(yǎng)硝化細菌的樣品實驗中的樣品采集于湖南省長沙市某小龍蝦養(yǎng)殖基地，采集點為塘邊3cm深的潮濕活性污泥。二、配制硝化細菌富集培養(yǎng)基，對菌種進行擴培和馴化所用富集培養(yǎng)液主要組分為無機鹽，包括微量元素狗、Mg、Ca等，配方如下葡萄糖 5g、K2HP040. 5g、MgS04. 7H20 0. 05g、FeS04. 7H20 0. 02g,CaCl2O. Olg^NaNO2O. 1 2g、水 1L， pH7. 2。其中微量元素1 是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的組成部分，亦是菌體氧代謝不可或缺的元素，該配方中以FeSO4. 7H20的形式加入；Mg參與多種輔酶和激活因子的合成，其對ATP酶有激活作用，可促進細胞內(nèi)ATP的生成，從而加快菌體的生長，該培養(yǎng)基中以MgSO4. 7H20的形式加入；Ca是一些酶的激活劑，并且參與多種信號傳導(dǎo)過程，該配方中以CaCl2的形式加入。NaNO2是該培養(yǎng)基中的唯一氮源，同時亦為細菌的生長提高能源。將IOml活性污泥接種于90ml富集培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min的條件下恒溫震蕩培育1 2d后，利用鹽酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009. 33-2008)測剩余亞硝酸鹽的濃度，當亞硝酸鹽濃度降到10mg/L以下時，取上清液5ml加至IOOml新鮮富集培養(yǎng)基中相同條件培養(yǎng)，如此反復(fù)5次。每次逐漸提高培養(yǎng)液中NaNO2的濃度，其中NaNO2初始濃度為 0. lg/L，然后提高至 0. 5g/L、lg/L、l. 5g/L，最終濃度為 2g/L。本發(fā)明將NaNO2作為選擇因子作為富集培養(yǎng)過程中選擇壓力，淘汰非目標菌群，通過逐漸提高培養(yǎng)液NaNO2濃度的方法進行富集，其中NaNO2初始濃度為0. lg/L，最終濃度為2g/L。本發(fā)明方法可使污泥中的碳化菌等雜菌的生長明顯受到抑制，有利于硝化細菌成為優(yōu)勢菌群，并耐受越來越高的亞硝酸鹽濃度，最終達到處理濃度高達2g/L的亞硝酸鹽廢水，使污水中高濃度亞硝酸鹽能夠降到0. 2mg/L以下。三、將富集培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)，分離純化，以降解率高的菌為優(yōu)選菌富集馴化完成后，取Iml富集培養(yǎng)液以10—1梯度進行稀釋直到10_7，將各稀釋度的菌液涂布到異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)1 2d，挑取形態(tài)不同的菌落進行分離純化。將分離純化后的菌株分別挑取1環(huán)接種于IOOml亞硝酸鹽初始濃度為Ig/ L的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，30°C、180r/min搖床震蕩培養(yǎng)Mh。菌液在離心機中(5000r/min) 離心;3min以去除菌體，利用鹽酸萘乙二胺分光光度法(GB/T 5009. 33-2008)測其對亞硝酸鹽的去除率。將富集培養(yǎng)物通過多次平板涂布分離，獲得1株亞硝酸鹽降解效果較好的菌株，接種于LB斜面上，編號為N419，4°C冰箱中保存。把降解菌株送至中科院微生物研究所進行菌種鑒定，根據(jù)顯微形態(tài)、生理生化特征(結(jié)果見表1)、16S rRNA基因序列等實驗數(shù)據(jù)，該菌株的鑒定結(jié)果為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，并于2011年5月30日在中國北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，蠟狀芽孢桿菌N419 (Bacillus cereus)，保藏號為 CGMCCNo. 4918。本發(fā)明篩選所得的異養(yǎng)硝化細菌CGMCC NO. 4918可以利用亞硝酸鹽作為唯一的氮源進行生長繁殖，不但能處理低濃度亞硝酸鹽，而且對于高濃度的亞硝酸鹽去除效果也非常理想。而且異養(yǎng)硝化細菌相對于自養(yǎng)硝化細菌具有世代周期短，生長繁殖快，對環(huán)境適應(yīng)能力強的特點，在實際工程應(yīng)用中有較大的發(fā)展?jié)摿?。?細胞形態(tài)和理化試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種高效異養(yǎng)硝化細菌篩選方法，其特征在于，包括以下步驟(1)配制硝化細菌富集培養(yǎng)基，對菌種進行擴培和馴化所用富集培養(yǎng)基配方如下葡萄糖5g、K2HPO4O. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 05g、 FeSO4 · 7Η200· 02g、CaCl2O. Olg、NaNO2O. 1 2g、水 1L, ρΗ7· 2 ；將 IOml 含異養(yǎng)硝化細菌的活性污泥接種于90ml富集培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min的條件下恒溫震蕩培育，1 2d后，取上清液5ml加至IOOml新鮮的富集培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)，如此反復(fù)5次；每次逐漸提高培養(yǎng)液中NaNO2的濃度，其中NaNO2初始濃度為0. lg/L，然后提高至0. 5g/L、lg/L、l. 5g/L， 最終濃度為2g/L ；(2)將富集培養(yǎng)后的菌株轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)，分離純化，獲得降解率高的菌株。
2.一株高效異養(yǎng)硝化細菌，其特征在于，是一株蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，保藏編號為CGMCC NO. 4918。
3.一種水質(zhì)凈化微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于以權(quán)利要求2所述蠟狀芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)過搖床種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵進行制備。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述水質(zhì)凈化微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于采用LB培養(yǎng)基，300C，培養(yǎng)Mh，獲取新鮮斜面菌種用于種子培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述水質(zhì)凈化微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于所述搖床種子培養(yǎng)條件為PH 7. 2、溫度30°C，轉(zhuǎn)速180 200r/min，培養(yǎng)10 12h ；培養(yǎng)基的組成為葡萄糖 5g、K2HPO4 0. 5g、MgSO4. 7H20 0. 05g、FeSO4. 7H20 0. 02g、CaCl2O. Olg、 NaNO2O. 5g、H2O 1L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述水質(zhì)凈化微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于所述液體發(fā)酵條件為20L罐裝量為12L，攪拌速度200 220r/min，初始pH 7. 0 7. 2，通氣量1 0.9 1，接種量3%，沘 301溫度下發(fā)酵對 沘11;培養(yǎng)基組成為玉米粉 15g/L，豆粕粉 10g/L，酵母粉 6g/L，NaCl 5g/L，MgSO4. 7H20 lg/L, K2HP042g/L, MnSO4. H2O 0. 05g/L, CaCO3O. 01g/L，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效異養(yǎng)硝化細菌篩選方法、篩選的菌株及其菌劑的制備方法。本發(fā)明將選擇因子作為富集培養(yǎng)過程中選擇壓力，淘汰非目標菌群，建立了一種快速、高效獲得目標菌株的方法。利用該篩選方法從實驗樣品中篩選出了一株高效降解亞硝酸鹽的菌株，鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，保藏編號為CGMCC NO.4918。其可以利用亞硝酸鹽作為唯一的氮源進行生長繁殖，對環(huán)境有較強的適應(yīng)能力，在實際工程應(yīng)用中有較大的發(fā)展?jié)摿?。本發(fā)明還公開了以該菌株制備水質(zhì)凈化微生物制劑的生產(chǎn)方法，生產(chǎn)出的菌劑可用于污水處理、水產(chǎn)養(yǎng)殖、水族箱或流動水系等水治理工程。
文檔編號C02F3/34GK102277314SQ20111016695
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者吳迎奔, 尹紅梅, 張德元, 王震, 許麗娟, 賀月林, 陳薇 申請人:湖南省微生物研究所