專利名稱：一株銅綠假單胞菌及其分離方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株銅綠假單胞菌(Α ^/ΟΜ^Μ aa/T^i/^m)，其在厭氧條件下具有高效腐殖質(zhì)還原和多環(huán)芳烴降解活性。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳經(jīng)(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指具有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)的一類有機(jī)化合物，包括萘、蒽、菲、芘等150余種化合物，有很強(qiáng)的致畸、致癌、致突變作用，具有水溶性差、穩(wěn)定性強(qiáng)、毒性大、降解困難等特點(diǎn)，是廣泛存在于環(huán)境中的一類持久性有機(jī)污染物。土壤作為環(huán)境中多環(huán)芳烴的主要?dú)w宿地和重要中轉(zhuǎn)站，通過(guò)各種物理化學(xué)作用不斷將多環(huán)芳烴化合物向周圍環(huán)境釋放。目前，多環(huán)芳烴污染土壤常規(guī)修復(fù)方法為物理化學(xué)方法，如光氧化法和化學(xué)氧化法，但都存在降解率低、耗時(shí)長(zhǎng)、投資大、應(yīng)用性差的缺陷。微生物修復(fù)是PAHs污染土壤修復(fù)的重要途徑，具有成本低、效率高、不易造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，一些好氧微生物能夠通過(guò)不同代謝機(jī)制將其降解、礦化，為生物修復(fù)PAHs污染土壤提供了可能。然而，土壤條件下PAHs污染的環(huán)境一般是無(wú)氧或者缺氧的，基于好氧微生物的原位生物修復(fù)技術(shù)具有明顯的缺陷。因此厭氧原位生物修復(fù)技術(shù)成為PAHs污染土壤修復(fù)的重要途徑。目前已有關(guān)于硫酸鹽還原菌(Rothermich et al. 2002)和硝酸鹽還原菌(Coates et al. 2001)在厭氧條件下降解PAHs的報(bào)道。腐殖質(zhì)呼吸是近年來(lái)倍受關(guān)注的新型微生物能量代謝方式，它是指微生物以腐殖質(zhì)為末端電子受體，通過(guò)氧化電子供體偶聯(lián)腐殖質(zhì)還原，并從這一過(guò)程中貯存生命活動(dòng)的能量。腐殖質(zhì)呼吸不僅與碳、氮、磷等元素的自然循環(huán)過(guò)程相偶聯(lián)，而且顯著影響有機(jī)污染物的厭氧降解行為。已有研究結(jié)果表明，腐殖質(zhì)還原菌在污染物(如有機(jī)氯代物)厭氧降解體系中發(fā)揮著重要作用。經(jīng)文獻(xiàn)和專利檢索，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于厭氧條件下以腐殖質(zhì)為電子受體，降解PAHs的銅綠假單胞菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種厭氧條件下進(jìn)行腐殖質(zhì)還原及多環(huán)芳烴降解的高效菌株——銅綠假單胞菌菌株。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述銅綠假單胞菌的分離純化方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述銅綠假單胞菌的在厭氧降解腐殖質(zhì)和多環(huán)芳烴中應(yīng)用。本發(fā)明所得的銅綠假單胞菌、Pseudomonas aeruginosa )PAH_1，于2011年4月21 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為=CGMCC No. 4773。本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌PAH-I具有如下形態(tài)和生理生化特性 1)菌體形態(tài)特性
菌株P(guān)AH-I呈革蘭氏陰性，直桿狀(長(zhǎng)1. 0 2. 0 μ m，寬0. 3 0. 5 μ m)，具有運(yùn)動(dòng)性。
2)菌落形態(tài)特性
在有氧LB瓊脂平板培養(yǎng)4 后，菌落濕潤(rùn)，光滑，呈淡黃色，不透明，邊緣整齊，并分泌綠色或者深褐色的稱為綠膿素的色素，菌落直徑2-3mm。3)生理生化特征
非發(fā)酵，兼性厭氧?？稍?1°C生長(zhǎng)，在4°C不生長(zhǎng)。3)分子生物學(xué)特征
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-異戊醇(體積比M :1)抽提，0. 6體積異丙醇沉淀的方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16SrRNA通用引物F27和R1492擴(kuò)增細(xì)菌的16SrRNA，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序。再將得到的堿基序列在GenBank等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行同源序列搜索(Blast search)，找出該菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC 或DSM等國(guó)際菌種保藏中心的菌株。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，該菌株與銅綠假單胞菌的16SrRNA序列具最高同源性。結(jié)合上述的生理生化特性、16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果，本發(fā)明菌株應(yīng)歸屬于銅綠假 1 (Pseudomonas aeruginosa ) 0本發(fā)明同時(shí)提供了所述銅綠假單胞菌的分離純化方法通過(guò)微生物燃料電池的陽(yáng)極生物膜進(jìn)行分離純化得到的。具體分離純化方法包括以下步驟
1)取微生物燃料電池的陽(yáng)極生物膜接種于液體分離培養(yǎng)基中；
2)排除已接種液體分離培養(yǎng)基中的氧氣，厭氧培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況；
3)當(dāng)培養(yǎng)液顏色從無(wú)色變橙黃色時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新鮮的液體分離培養(yǎng)基，繼續(xù)厭氧富集培養(yǎng)3次；
4)將富集培養(yǎng)的菌株進(jìn)行分離與純化。本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌在厭氧條件下能夠利用腐殖質(zhì)作為電子受體氧化降解多烴芳烴(菲)，葡萄糖或果糖與菲共代謝條件下可顯著提高菲的降解速率，可廣泛應(yīng)用于輕度多環(huán)芳香烴污染土壤原位生物修復(fù)。


圖1是菌株P(guān)AH-I 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
圖2是PAH-I利用不同電子供體還原腐殖質(zhì)模型物AQDS的效果； 圖3是菌株P(guān)AH-I以AQDS為電子受體時(shí)對(duì)菲的厭氧降解效果。
具體實(shí)施例方式菌株P(guān)AH-I的富集和分離
1)從PH為7的污泥微生物燃料電池中取5mL陽(yáng)極液接種于50mL液體分離培養(yǎng)基中， (污泥微生物燃料電池的構(gòu)型如CN200910041235. 4所述)，液體分離培養(yǎng)基的組成是每升液體分離培養(yǎng)基中含1. Og多環(huán)芳香烴(電子供體)、16g 2，6- 二磺酸鈉蒽醌(即AQDS，電子受體)、2.5g NaHC03、0.25g NH4C1、0. 678g NaH2PO4 · 2H20、0. Ig KC1、10. OmL 維生素溶液、 10. OmL微量元素溶液。其中，維生素溶液是每升去離子水中含2. Omg生物素、2. Omg葉酸、 B6 10. Omg維生素、5. Omg硫胺素、5. Omg核黃素、5. Omg煙酸、5. Omg泛酸鈣、0. Img維生素
4B12、5. Omg對(duì)氨基苯甲酸、5. Omg硫辛酸；微量元素溶液是每升去離子水中含1. 5g氨三乙酸、3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4 · H2OU. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoCl2 · 6Η20、 0. Ig CaCl2、0. Ig ZnSO4 · 7Η20、0· Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg AlK(SO4)2 · 12Η20、0· Olg H3BO3> 0. Olg Na2MoO4 · 2Η20 ；
2)往已接種污泥微生物燃料電池陽(yáng)極液的液體分離培養(yǎng)基中鼓沖氮?dú)獠簧儆?0分鐘，鼓氣完畢蓋橡膠蓋加鋁蓋密封，置于厭氧工作站(隊(duì)/0)2=80/20)，30°C靜置培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況；
3)當(dāng)培養(yǎng)液顏色從無(wú)色變?yōu)槟埸S色時(shí)，以10%的接種量將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新鮮的液體分離培養(yǎng)基，厭氧操作及厭氧培養(yǎng)條件同2 )，如此富集培養(yǎng)三次；
4)將第四代反應(yīng)后的培養(yǎng)液采用稀釋平板法進(jìn)行適當(dāng)稀釋，將稀釋后的培養(yǎng)液0.1 mL 均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站(^/C02=80/20)30°C培養(yǎng)48h，挑取單菌落進(jìn)行單菌落分離與純化，其中，所述LB固體培養(yǎng)基的組成是蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl 10 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH 為 7. 0。所得菌株即為銅綠假單胞菌G^ei/i/offloftas aerw^/flosa )PAH_1，于2011年4月21 日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 4773。WHPseudomonas aeruginosa ) PAH-I 的生理生化特征
根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定鑒定手冊(cè)》第九版所述的標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)試菌株的生理生化特征。菌株為非發(fā)酵型兼性厭氧菌，生長(zhǎng)溫度為4-41°C生長(zhǎng)，高于41°C、低于4°C不能生長(zhǎng)。菌株可利用葡萄糖、果糖或多環(huán)芳香烴如菲等作為碳源。其它生化特征見(jiàn)表1。
權(quán)利要求
1.銅綠假單胞菌菌株P(guān)AH-I，其保藏號(hào)為CGMCCNo. 4773。
2.權(quán)利要求1所述銅綠假單胞菌菌株P(guān)AH-I的篩選方法，包括如下步驟1)取微生物燃料電池的陽(yáng)極生物膜接種于液體分離培養(yǎng)基中；2)排除已接種液體分離培養(yǎng)基中的氧氣，厭氧培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)液的顏色變化情況；3)當(dāng)培養(yǎng)液顏色從無(wú)色變橙黃色時(shí)，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至另一新鮮的液體分離培養(yǎng)基， 繼續(xù)厭氧富集培養(yǎng)3次；4)將富集培養(yǎng)的菌株進(jìn)行分離與純化。
3.權(quán)利要求1所述銅綠假單胞菌菌株P(guān)AH-I在厭氧降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可降解PAHs的銅綠假單胞菌菌株P(guān)AH-1，其保藏號(hào)為CGMCC No.4773。本發(fā)明的銅綠假單胞菌在厭氧條件下能夠利用腐殖質(zhì)為電子受體，氧化降解多環(huán)芳烴，葡萄糖或果糖和菲共代謝條件下可顯著提高菲的降解速率，可廣泛應(yīng)用于輕度多環(huán)芳香烴污染土壤原位生物修復(fù)。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102296037SQ201110198819
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者周順桂, 王躍強(qiáng), 袁勇, 馬晨 申請(qǐng)人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所