專利名稱：一種海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株hmgs18及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國的海水養(yǎng)殖產(chǎn)量一直位居世界第一，是僅次于肉類的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源，在保證國家海洋食物產(chǎn)出的安全方面也具有至關(guān)重要的作用。多年來，我國的海水養(yǎng)殖雖然保持了穩(wěn)步發(fā)展，但養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的有機和無機廢物量大，隨著養(yǎng)殖“自身污染”效應(yīng)的長期積累，養(yǎng)殖環(huán)境惡化問題日益凸現(xiàn)出來，不但對鄰近海域生態(tài)環(huán)境造成了嚴重負面影響，反過來又制約了海水養(yǎng)殖生產(chǎn)本身。硫化物是養(yǎng)殖環(huán)境的最主要的污染物之一，且對養(yǎng)殖生物有毒害作用，因此，有效去除環(huán)境中的硫化物，改善海水養(yǎng)殖環(huán)境，不但有利養(yǎng)殖生產(chǎn)，而且對保護海洋環(huán)境也有重要意義。硫氧化菌(Sulfur Oxidizing Bacteria簡稱SOB)是能氧化元素硫、硫化物、硫代硫酸鹽和亞硫酸鹽等產(chǎn)生代謝產(chǎn)物硫酸的一類菌。該微生物在工業(yè)和環(huán)保上具有重要價值，國內(nèi)外目前主要集中在生物冶金，處理污泥和廢水中的重金屬，煤炭脫硫，刻蝕以銅及銅合金為材料的基片等方面都有不同程度的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，硫氧化菌能將有機質(zhì)碳源硫化物沉淀轉(zhuǎn)化為硫酸鹽，抑制硫酸鹽還原菌的代謝減少硫化物污染，改善海水養(yǎng)殖環(huán)境，但目前很少有人將硫氧化細菌有效利用于海水養(yǎng)殖中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18，該菌株能快速有效的去除污染海水中的硫化物，成本低且環(huán)保。本發(fā)明的第二個目的在于提供上述海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株在處理受硫化物污染海水中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種可降解海水中硫化物的菌劑，該菌劑含有上述海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18，能有效去除污染海水中的硫化物。本發(fā)明的最后一個目的在于提供上述菌劑在去除受硫化物污染的海水中的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18，該菌株的保藏名稱為鹽硫桿菌HMGS18，分類命名為HalothicAacillus sp. HMGS18，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏日期為2010年11月2日，保藏號為CCTCC NO :M2010290o其中上述海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18的篩選分離鑒定過程為取海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場區(qū)的沉積物，在實驗室利用富集基和選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)后，并分離純化菌株，根據(jù)菌株對硫化物去除能力的強弱，篩選出對硫化物去除能力強的菌株，并最終篩選出一株對硫化物有較強降解能力的菌株，編號為HMGS18，然后根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征，及其16SrDNA基因序列經(jīng)與Genbank中已登陸的基因序列進行對比分析發(fā)現(xiàn)，菌株HMGS18經(jīng)鑒定為鹽硫桿菌屬，命名為鹽硫桿菌(HalothicAacillus sp. )HMGS18。本發(fā)明的第二個目的在于提供上述海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18在去除受硫化物污染海水中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的是通過如下技術(shù)手段來實現(xiàn)的一種可降解海水中硫化物的菌劑，含有上述海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18。該菌劑可以為取經(jīng)上述分離純化的鹽硫桿菌(HalothicAacillus sp.)HMGS18單菌落，于活化培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)40-4 得到。上述活化擴大培養(yǎng)中培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為=MgSO4 · 7H20 0. lg, Na2S2O3 · 5H205g， K2HPO4 2. 0g, (NH4)2SO4 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 02g,陳海水 IOOOmL, PH7. 6-8. 2，121°C 滅菌 20min。本發(fā)明的最后一個目的是通過如下技術(shù)手段來實現(xiàn)的上述菌劑在去除受硫化物污染的海水中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明從海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積物中篩選得到海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株 HMGS18，其具有良好的去除受硫化物污染的海水中硫化物的能力，能在l-7d內(nèi)有效去除海水中的硫化物(去除率68.8% )，并且該新菌株對海水養(yǎng)殖生物斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)蝦苗和黑鯛(Sparus macrocephalus)仔魚等海洋常見魚類沒有毒害致病作用；(2)本發(fā)明利用硫氧化細菌將海水中的硫化物轉(zhuǎn)化為硫酸鹽是去除硫化物污染的一種經(jīng)濟有效的方法，其能對海水養(yǎng)殖環(huán)境中的硫化物污染物進行快速、高效的去除，所以，可用于對海洋環(huán)境中硫化物污染的有效治理。


圖1是實施例2中篩選得到的海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；圖2是實施例3中篩選得到的海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18的電鏡圖片；圖3是實施例5中的海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18在高濃度硫化物廢水中pH 的變化圖； 圖4是實施例5中的海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18在高濃度硫化物廢水中硫酸鹽的變化圖；圖5是實施例5中的海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18在高濃度硫化物廢水中硫化物的降解效率圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例1海洋好氧反硝化菌株的篩選方法一、材料準備1、菌源和實驗廢水(1)菌源有20多年養(yǎng)殖歷史的深圳市大鵬澳海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場區(qū)的沉積物；(2)實驗廢水(高濃度硫化物海水)=Naj2O3 · 5H20 (硫化物)5g，MgSO4 · 7H20
40. lg, K2HPO4 2. 0g, (NH4)2SO4 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, FeSO4 · 7Η200· 02g,陳海水 IOOOmL, PH7. 6 8. 2，121°C 滅菌 20min。2、培養(yǎng)基(1)選擇培養(yǎng)基=Na2S · 5H20 2g，高純水 1L，121°C 滅菌 20min ；(2)分離及斜面培養(yǎng)基=MgSO4 · 7H20 0. lg, Na2S2O3 · 5H20 5g，K2HPO4 2. 0g, (NH4)2SO4 0. lg，CaCl2 ·2Η20 0. lg，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0. 02g，瓊脂 20g，陳海水 1000mL，PH7. 6-8. 2， 121°C 滅菌 20min ；(3)活化擴大培養(yǎng)基=MgSO4 · 7H20 0. lg, Na2S2O3 · 5H20 5g，K2HPO4 2. Og, (NH4)2SO4 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 02g,陳海水 IOOOmL, PH7. 6-8. 2，121°C滅菌 20min。3、實驗儀器和設(shè)備廣東海利電磁式空氣壓縮機AC0-009E ；蘇州安泰超凈工作臺SW-CJ-IBU ；上海精宏生化培養(yǎng)箱SHP-150 ；蘇州歐倍振蕩培養(yǎng)箱0BS-2F ；德國HYDRO-BIOS-KIEL 采泥器；日本HIRAYAMA高壓滅菌器HVN-85 ；日立H-7650透射電子顯微鏡；
上海雷磁酸度計PHS-3C ；加熱板及滴定儀；PC818 型 PCR 儀；電泳儀及電泳槽；凝膠紫外觀測儀等。二、菌株的分離與篩選1、菌株的富集取大鵬澳海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖場沉積物表層以下5cm處的沉積物放入采樣袋，再放入0°C冰盒中帶回實驗室，取250g沉積物加到2L的富集瓶中，每2天加入ImL選擇培養(yǎng)基， 并加入適量的纖維棉，在室溫條件下間歇曝氣富集培養(yǎng)2個月，中間據(jù)情況不定期添加滅菌海水。2、菌株的分離純化挑選并直接沖洗細菌附著量較大的纖維棉，得到富集菌液，適當稀釋，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上，2548°C培養(yǎng)2-3d，待菌落長出后，挑取形態(tài)各異的單菌落，在分離培養(yǎng)基平板上進行劃線分離，直至得到純的單菌落。將分離純化的細菌接種至斜面培養(yǎng)基中并于冰箱4°C保存。3、硫氧化細菌的篩選通過用pH、硫酸鹽及硫化物值來衡量菌株對硫化物的降解能力，以硫化物濃度變化表示細菌利用硫化物的降解能力。取分離純化得到的菌株于活化擴大培養(yǎng)基中2548°C振蕩培養(yǎng)40-4 ，按海水于菌液體積比40-60 1，接種到含高濃度硫化物的海水中，取不接種菌液的硫化物海水作為空白對照，25-28 V振蕩培養(yǎng)，反應(yīng)時間l-8d。
經(jīng)過篩選獲得一株編號為HMGS18的菌株，即海洋硫氧化菌株HMGS18。實施例2海洋硫氧化菌株HMGS18的鑒定1、對海洋硫氧化菌株HMGS18的鑒定對海洋硫氧化菌株HMGS18進行了生理生化的鑒定以及16S rDNA分子的鑒定，從分子水平，并結(jié)合細菌形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性分析確定菌株的種屬。16S rDNA序列分析主要按照以下步驟(1)細菌核DNA的提取1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于擴大培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)過夜，取1.5mL菌液于 Eppendorf管內(nèi)，8000rpm室溫離心5min，徹底除去上清； 2)加STE (Sodium-Tris-EDTA)緩沖液1. 5mL洗滌一次，離心棄上清，再加入 0. 6mLTE (Tris-EDTA)緩溶液，重懸細菌；3)力口 30 μ L 10mg/ml 的溶菌酶，37°C水浴 45min ；4);^65yL 10 % 的 SDS (十二烷基磺酸鈉)，20mg/mL 的蛋白酶 K3 μ L，50°C 水浴池，至溶液變清；5)加入等體積酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白質(zhì)為止；6)在上清液中加入1/10體積的3M的NaAc (ρΗ5· 2)；7)加入等體積的異丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒纏繞挑出DNA細絲，再用體積百分含量為70%的乙醇洗滌一次，自然晾干，并將DNA溶于100 μ L TE溶液中；8)加入終濃度為 50 μ g/mL 的 foiase (RNA 酶)，37°C，30min，去除 RNA，_20°C保存(2) 16S rDNA 基因的 PCR 擴增Pl (上游引物)27F(5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')P2(下游引物)1522R(5' -AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA_3') 在50 μ L的反應(yīng)體積中，加入1 μ L模板DNA (0. 1 μ g)，0. 5 μ L Pl和Ρ2 (終濃度為 0. 5 μ Μ), 1 μ L dNTP(每種 NTPO. 2mM)，0· 5 μ L Taq 聚合酶 QU)禾口 5 μ L 10XPCR 緩沖液。 PCR擴增條件為94°C預(yù)變性5min，在94°C變性30s，61-65°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán) 30次；最后72°C終延伸IOmin0(3) PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠(質(zhì)量百分比)進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中加2倍體積TE，65°C水浴IOmin后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍體積的 10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用體積百分含量為70%的乙醇洗沉淀一次，風干后溶于適量滅菌雙蒸水。(4) 16S rDNA的部分序列測定和分析P-f :CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；P-r :GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。力口入1 μ L 模板 DNA ( < 0. 1 μ g)，PCR 擴增 30 個循環(huán)(94 "C lmin, 55 "C 30s, 72 °C 2min) 0采用ABIPRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem373 ADNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。2、16S rDNA 序列測定本發(fā)明采用對16S rDNA序列測定和分析的方法對細菌進行分子水平的鑒定。以細菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度為1458bp的擴增帶用瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序列。GGGACAGGGGGGGCTGCCTTMCCATGCMGTCGMCGGTMCAGGAGAGAGCTTGCTCT60
CTTGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTMTACATGGGMTCTGCCCTGAGGTGGGGGAT120
MCCTGGGGAMCTCAGGCTMTACCGCATGATCTCTACGGAGCAMGTGGGGGACCTTC180
GGGCCTCACGCCTTGGGATGAGCCCATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTMGAGCCTA240
CCMGGCGACGATCAGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGGACGGCCACACTGGGACTGAGACAC300
GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGMTATTGGACMTGGGGGCMCCCTGAT360
CCAGCMTGCCGCGTGTGTGMGMGGCCTGCGGGTTGTAMGCACTTTTATCGGGGMG420
MTAGGTTGTCGCTMTACCGGCMCACTTGACATTACCC GTTGMTMGCACCGGCTM480
CTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTMTACGGAGGGTGCGAGCGTTMTCGGMTTACTGGGCG540
TAMGCGTGCGTAGGCGGMGCTTMGTCTGATGTGAMGCCCCGGGCTTMCCTGGGM600
TGGCATTGGAMCTGGGTTTCTAGAGTGTGGTAGAGGATAGTGGMTTTCCAGTGTAGCG660
GTGAMTGCGTAGATATTGGAMGMCACCGATGGCGMGGCAGCTATCTGGGCCMCAC720
TGACGCTGAGGTACGAMGCGTGGGGAGCAMCAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC780
CCTAMCGATGTCGACTTGTCGTTGGGGGAGTTTAGTCCTTCAGTGACGGAGCTMCGCG840
TTMGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCMGGTTGAMCTCAMGGMTTGACGGGGG900
CCCGCACMGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGATGCMCGCGMGMCCTTACCTGGC960
CTTGACATCCTCGGMCTTGGCAGAGATGCCTTGGTGCCTTCGGGMCCGAGTGACAGGT1020
GCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCMCGAGCGC1080
MCCCTTATTCCTAGTTGCCAGCACTTCGGGTGGGMCTCTAGGGAGACTGCCGGTGACA1140
MCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCMGTCATCATGGCCCTTATGGCCAGGGCTACACA1200
CGTGCTACMTGGTCGGTCCAATGGGTAGCTMGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCTCAAA1260
GCCGATCTTAGTCCGGATTGCAGTCTGCMCTCGACTGCATGMGTCGGAATCGCTAGTA1320
ATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA1380
CACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGMGTGGCTAGTCTMCCTTCGGGAGGACGGTCACCA1440
CGGTGGATTCCCGTTTG C
1458實施例3海洋硫氧化菌株HMGS18菌落形態(tài)、生理和生化特征海洋硫氧化菌株HMGS18菌落形態(tài)、生理和生化特征見表1_1 ；細胞形態(tài)見圖2。表1-1海洋硫氧化菌株HMGS18的菌落形態(tài)特征以及主要的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一種海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18，其特征是該菌株的保藏名稱為鹽硫桿菌 HMGS18，分類命名為HalothicAacillus sp. HMGS18，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏日期為2010年11月2日，保藏號為CCTCC NO :M2010290o
2.權(quán)利要求1所述的海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18在處理受硫化物污染的海水中的應(yīng)用。
3.—種可降解海水中硫化物的菌劑，其特征是含有權(quán)利要求1中所述海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18。
4.權(quán)利要求3所述菌劑在處理受硫化物污染的海水中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋硫氧化鹽硫桿菌菌株HMGS18，該菌株的保藏名稱為鹽硫桿菌HMGS18，分類命名為Halothiobacillus sp.HMGS18，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2010年11月2日，保藏號為CCTCC NOM2010290。該菌株具有高效硫化物降解能力，能快速有效的去除受硫化物污染海水中的硫化物，并且對海水養(yǎng)殖生物沒有毒害致病作用；本發(fā)明對去除海水養(yǎng)殖環(huán)境和海洋環(huán)境中硫化物污染具有安全、環(huán)保、高效的特點。
文檔編號C02F1/58GK102399721SQ201110335439
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者古小莉, 孟霞, 廖秀麗, 黃洪輝 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所