專利名稱：一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑、其制備方法及應(yīng)用，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羅非魚原產(chǎn)于非洲，為內(nèi)陸熱帶性魚類，隸屬鱸形目、鱺魚科、羅非魚屬。由于羅非魚具有生長快、雜食性、病害少、抗病力強、適應(yīng)性廣等特點，使羅非魚成為國際上被引種養(yǎng)殖最廣泛的魚種。中國于上世紀(jì)70年代引進羅非魚后，羅非魚產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展。2008年我國羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量達120萬噸，占世界60%，成為我國主要創(chuàng)匯的出口魚類品種之一。 隨著我國羅非魚養(yǎng)殖密度的增大，養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量的下降，羅非魚病害不斷發(fā)生，且發(fā)病情況日趨嚴(yán)重。鏈球菌病是羅非魚易患的主要細(xì)菌性疾病之一，其主要致病菌為海豚鏈球菌和無乳鏈球菌。國內(nèi)研究者從患病羅非魚中分離到的鏈球菌多被鑒定為海豚鏈球菌，近幾年來所引發(fā)羅非魚病害發(fā)生率不斷增高，發(fā)病范圍也逐漸擴大。尤其在2009年，我國華南地區(qū)大規(guī)模暴發(fā)的羅非魚鏈球菌病，給我國造成了巨大的經(jīng)濟損失，也給我國羅非魚產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的影響。因而，羅非魚鏈球菌病已成為制約羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。目前防治水產(chǎn)動物疾病的主要方法有化學(xué)防治、免疫防治和生態(tài)防治(微生態(tài)制劑)等。在防治水產(chǎn)動物病害的發(fā)生過程中，抗生素和化學(xué)藥物的應(yīng)用起到了一定的積極作用。但長期使用也帶來一系列副作用，許多病原微生物通過突變和質(zhì)粒的基因調(diào)節(jié)對抗生素產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致抗生素用量的增加，引起內(nèi)源性感染和二重感染；同時破壞和干擾了機體正常菌群和養(yǎng)殖生態(tài)平衡，使水產(chǎn)動物產(chǎn)生免疫抑制作用，許多化學(xué)藥物在水產(chǎn)動物體內(nèi)積累造成藥物殘留，這不僅影響了產(chǎn)品質(zhì)量和我國水產(chǎn)品的貿(mào)易出口，而且直接危害人類健康。漁用疫苗雖然具有安全、高效、無污染、無殘留及不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，但在發(fā)展過程中仍面臨著許多困難，疫苗其作用范圍小、針對性強、成本較高、工作量大等問題在一定程度上制約了漁用疫苗的應(yīng)用和發(fā)展。近年來，隨著人們對食品安全、環(huán)境安全認(rèn)識的深入，水產(chǎn)養(yǎng)殖必須向著環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的方向發(fā)展，這就需要尋找一條既能改善生態(tài)環(huán)境又能減少藥物風(fēng)險的新防治途徑，而微生態(tài)制劑本身不僅具有優(yōu)化水域環(huán)境、 提高養(yǎng)殖生物機體的免疫力和抑制病原菌生長的功能，而且安全性高、無殘留、不污染環(huán)境等優(yōu)點，因此在眾多防治方法中，微生態(tài)制劑作為綜合防治水產(chǎn)病害的措施之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)得到愈來愈多的關(guān)注。但目前的微生物制劑多以改良水質(zhì)和增強機體消化為主，專門化的抑菌防病的微生物制劑尚不多見，因此開發(fā)一種集凈化水質(zhì)、抑制病原、提高免疫、安全有效的專門化的防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑、其制備方法及應(yīng)用，其利用兩種特異性微生物菌種經(jīng)合理組配，混合培養(yǎng)后，形成微生態(tài)制劑，具有降低羅非魚養(yǎng)殖水體水質(zhì)中的氨氮和亞硝酸氮的含量，拮抗羅非魚鏈球菌病病原，減少養(yǎng)殖中后期有害物質(zhì)的積累，提高羅非魚機體的免疫力，達到生物防治羅非魚鏈球菌病的目的，減輕病害所造成的經(jīng)濟損失，保證羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑，其特征在于所述微生物制劑的活性成分為紅色諾卡氏菌ATCC11653和珊瑚色諾卡氏菌 ACCC40100。一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑的制備方法，其特征在于由紅色諾卡氏菌ATCCl 1653和珊瑚色諾卡氏菌ACCC40100組成混合菌，采用氮源、碳源及無機鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)完成后，加工成固體粉劑，制得具有降低養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸氮的含量，拮抗羅非魚鏈球菌病病原，提高羅非魚機體的免疫力，防治羅非魚鏈球菌病作用的固體粉劑型微生物制劑。作為本發(fā)明的進一步改進，所述的制備方法具體包括以下步驟
(1)微生物菌種
菌種A :紅色諾卡氏菌ATCC 11653 ；
菌種B :珊瑚色諾卡氏菌ACCC 40100 ；
混合菌將菌種A和菌種B混合，以細(xì)菌細(xì)胞干重計配比比例，菌種A :菌種B為I :
O.5 2 ;
(2)培養(yǎng)基:
獲得大的生物量的通用培養(yǎng)基以無機氮源和有機碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)；通用培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉25g/L，硫酸銨5g/L，磷酸氫二鉀O. 85g/L ； 具體配制方法為先將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g切成小塊，加水煮爛(煮沸20 30分鐘，能被玻璃棒戳破即可)，用四層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖和可溶性淀粉，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補加其它成分，并補足水分至1000毫升，調(diào)pH7. 5 ；
檢測菌種用的固體培養(yǎng)基是在上述通用培養(yǎng)基中加入2%重量百分比的的瓊脂；無指明情況下均是采用通用培養(yǎng)基培養(yǎng)；
3)菌種發(fā)酵制備
a)搖床培養(yǎng)將斜面保存的菌種A和菌種B接入裝有通用培養(yǎng)基的500mL或IOOOmL三角瓶中，通用培養(yǎng)基量為三角瓶容量的1/3，菌種A和菌種B的混合量按混合菌的配比配置， 接種量以標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑滿為準(zhǔn)；搖床培養(yǎng)12 18h，控制培養(yǎng)溫度30 35 °C，pH 7. 5 8. 5，轉(zhuǎn)速 130 180rpm ；
b)種子發(fā)酵接種量6-20mL/L，從搖床培養(yǎng)的三角瓶中接種進50 200L種子發(fā)酵罐， 采用通用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，控制發(fā)酵溫度30 35°C，pH7. 5 8. 5，種子發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速 130 180rpm，發(fā)酵時間48 120小時，待活菌數(shù)在5 X IO9 8 X IO9個/mL時；發(fā)酵產(chǎn)物直接制備成制劑或作為種子進一步進行發(fā)酵罐發(fā)酵；
c)發(fā)酵罐發(fā)酵種子發(fā)酵產(chǎn)物作為種子接種入500-2000L發(fā)酵罐，進行發(fā)酵罐發(fā)酵，仍然采用通用培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同種子發(fā)酵罐發(fā)酵；
(4)固體粉劑的制備發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液通過干燥制備成一定粒度的固體粉劑。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(4)中，固體粉劑采用真空干燥方法制得，具體操作為發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液添加吸附載體，發(fā)酵液吸附載體重量比為I :2 5，吸附后進行干燥處理；根據(jù)干燥溫度、通風(fēng)情況和鋪陳厚度，干燥時間為8 30小時，得吸附粉；干燥后的吸附粉，根據(jù)對活菌數(shù)的要求添加同類型吸附載體進行稀釋處理，吸附粉吸附載體重量比為I :1 10，活菌含量在I X IO8 2X IO8個/g。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(4)中，固體粉劑采用低溫干燥方法制得，具體操作為發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液采用離心機在5000 8000rpm下離心10 15min,收集離心后的沉淀菌體，添加保護劑后進行低溫(-80°C)冷凍干燥處理，制備成凍干粉；冷凍干燥后的凍干粉，根據(jù)對活菌數(shù)的要求添加吸附載體進行稀釋處理，凍干粉吸附載體重量比為 I :1 1000，活菌含量在I X IO8 2X IO8個/g。作為本發(fā)明的進一步改進，所述吸附載體選用膨潤土、麥麩、次粉或淀粉。作為本發(fā)明的進一步改進，所述保護劑選用海藻糖、蔗糖、牛血清蛋白、牛奶中的一種或幾種。本發(fā)明的微生物制劑在防治羅非魚鏈球菌病方面的應(yīng)用，其用于羅非魚養(yǎng)殖池塘，用量為O. 5 I. OKg/畝·米水深。本發(fā)明中，在無指明情況下均是采用通用培養(yǎng)基培養(yǎng)。需要對本發(fā)明的產(chǎn)品進行檢測時，采用加入2%重量百分比瓊脂的通用培養(yǎng)基，即固體培養(yǎng)基。本發(fā)明中各組分的作用原理如下
I、紅色諾卡氏菌主要是凈化羅非魚養(yǎng)殖水質(zhì)，去除氨氮和亞硝酸鹽氮，提高羅非魚的免疫力。實驗室結(jié)果顯示水體中紅色諾卡氏菌達IO5個/mL時，作用15天后，水中氨氮、 亞硝酸鹽含量降低了 85. 51%和54. 38% ;羅非魚免疫力顯著提高，其堿性磷酸酶(AKP)、補體 C3活力提聞50%以上。2、珊瑚色諾卡氏菌主要是分泌拮抗羅非魚鏈球菌病病原的物質(zhì)，抑制病原微生物。實驗室結(jié)果顯示珊瑚色諾卡氏菌對海豚鏈球菌的拮抗主要來自其代謝產(chǎn)物，拮抗抑菌活力為8AU/ml。對珊瑚色諾卡氏菌抑菌物質(zhì)的理化特性、分離等進行了初步的研究，研究表明抑菌物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性，100°C處理30min后保持完全的活性；對酸堿穩(wěn)定，在pH 值為4-11范圍內(nèi)的抑菌活性變化不大，pH值為11時抑菌活性仍保持94. 08% ;對蛋白酶K 和胰蛋白酶敏感；對紫外光穩(wěn)定；水溶性好，微溶于乙酸乙酯、正丁醇、石油醚中，不溶于乙醚和氯仿；在紫外吸收光譜下具有蛋白質(zhì)的特征吸收。上述說明抑菌物質(zhì)可能是一種蛋白類物質(zhì)。珊瑚色諾卡氏菌的過濾除菌上清液經(jīng)40%飽和硫酸銨處理所得的沉淀物質(zhì)具有抑菌活性，處理后的上清液無抑菌活性，進一步說明抑菌物質(zhì)是一種大分子蛋白質(zhì)。3、本發(fā)明中的菌種A (紅色諾卡氏菌)和菌種B (珊瑚色諾卡氏菌)，配比比例(細(xì)菌細(xì)胞干重比例)為I :0. 5 2，形成復(fù)合微生物產(chǎn)品，有效去除氨氮、亞硝酸鹽氮，拮抗羅非魚鏈球菌病病原，提高羅非魚機體的免疫力。本發(fā)明與已有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點
本發(fā)明利用對水產(chǎn)養(yǎng)殖生物無害、對自然水生態(tài)環(huán)境有益無害的兩種諾卡氏放線菌， 通過復(fù)合配比發(fā)酵培養(yǎng)后，利用其對氨氮和亞硝酸氮的轉(zhuǎn)化作用，改善水體環(huán)境質(zhì)量，并利用其所分泌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物拮抗并抑制羅非魚鏈球菌病的病原，提高羅非魚機體的免疫力，減輕羅非魚鏈球菌病的發(fā)生和由此產(chǎn)生的經(jīng)濟損失。本發(fā)明的防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑使用方便，使用量小，每畝水面每米水深的最小用量僅為O. 5kg ;使用后效果穩(wěn)定，可顯著降低羅非魚養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮等有害物質(zhì)的含量，減少羅非魚鏈球菌病的病原微生物數(shù)量，增加水體溶氧，提高羅非魚機體的免疫力，改善羅非魚的生存條件，有效防止羅非魚鏈球菌病的發(fā)生和突發(fā)性死亡，提高羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例I
(1)將菌種A(紅色諾卡氏菌ATCC 11653)和菌種B (珊瑚色諾卡氏菌ACCC 40100)混合，以細(xì)菌細(xì)胞干重計配比比例，菌種A :菌種B為I :1 ；
(2)培養(yǎng)基:
獲得大的生物量的通用培養(yǎng)基以無機氮源和有機碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)；通用培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉25g/L，硫酸銨5g/L，磷酸氫二鉀O. 85g/L ； 具體配制方法為先將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g切成小塊，加水煮至能被玻璃棒戳破即可，用四層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖和可溶性淀粉，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補加其它成分，并補足水分至1000毫升，調(diào)PH7. 5 ；
3)菌種發(fā)酵制備
a)搖床培養(yǎng)將斜面保存的菌種A和菌種B接入裝有通用培養(yǎng)基的IOOOmL三角瓶中， 通用培養(yǎng)基量為三角瓶容量的1/3，菌種A和菌種B的混合量按混合菌的配比配置，接種量以標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑滿為準(zhǔn)；搖床培養(yǎng)12h，控制培養(yǎng)溫度35 °C, pH 8. 5，轉(zhuǎn)速180rpm ；
b)種子發(fā)酵接種量6mL/L，從搖床培養(yǎng)的三角瓶中接種進50L種子發(fā)酵罐，采用通用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，控制發(fā)酵溫度35°C，pH8. 5，種子發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，發(fā)酵時間72小時，待活菌數(shù)在5 X IO9個/mL左右時；發(fā)酵產(chǎn)物直接制備成制劑；
(4)固體粉劑的制備發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液通過真空干燥制備成一定粒度的固體粉劑，具體操作為發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液添加膨潤土作為吸附載體，發(fā)酵液膨潤土重量比為 I :2，吸附后進行干燥處理，干燥時間為30小時，得吸附粉；干燥后的吸附粉，根據(jù)對活菌數(shù)的要求添加同類型吸附載體進行稀釋處理，吸附粉膨潤土重量比為I :2，活菌含量在 I X IO8個/g左右。該微生物制劑的實際使用效果如下
在廣東茂名一羅非魚養(yǎng)殖池塘使用，面積15畝，水深I(lǐng). 5米，夏季高溫(6 8月)時池塘水質(zhì)過濃，水色不好，水質(zhì)中氨氮、亞硝酸氮分別達到2. 20mg/L、0. 45mg/L，超標(biāo)嚴(yán)重， 水體中海豚鏈球菌達5X IO5個/mL，影響羅非魚的生長。在一晴天上午10點左右將上述配方的防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑應(yīng)用于養(yǎng)殖池塘中，用量為O. 5Kg/畝·米水深。 用后3天水色好轉(zhuǎn)，由濃綠色轉(zhuǎn)為淺黃綠色，透明度增大；水體中氨氮、亞硝酸氮含量降至
O.50mg/L和O. 12mg/L ；5天后，海豚鏈球菌數(shù)量下降為8 X IO3個/mL，羅非魚攝食正常。實施例2
(1)將菌種A(紅色諾卡氏菌ATCC 11653)和菌種B (珊瑚色諾卡氏菌ACCC 40100)混合，以細(xì)菌細(xì)胞干重計配比比例，菌種A :菌種B為I :2 ；
(2)培養(yǎng)基:
獲得大的生物量的通用培養(yǎng)基以無機氮源和有機碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)；通用培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉25g/L，硫酸銨5g/L，磷酸氫二鉀O. 85g/L ； 具體配制方法為先將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g切成小塊，加水煮至能被玻璃棒戳破即可，用四層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖和可溶性淀粉，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補加其它成分，并補足水分至1000毫升，調(diào)PH7. 5 ；
3)菌種發(fā)酵制備
a)搖床培養(yǎng)將斜面保存的菌種A和菌種B接入裝有通用培養(yǎng)基的IOOOmL三角瓶中， 通用培養(yǎng)基量為三角瓶容量的1/3，菌種A和菌種B的混合量按混合菌的配比配置，接種量以標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑滿為準(zhǔn)；搖床培養(yǎng)15h，控制培養(yǎng)溫度32 °C, pH 8. 0，轉(zhuǎn)速155rpm ；
b)種子發(fā)酵接種量6mL/L，從搖床培養(yǎng)的三角瓶中接種進50L種子發(fā)酵罐，采用通用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，控制發(fā)酵溫度32°C，pH8. 0，種子發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速155rpm，發(fā)酵時間80小時，待活菌數(shù)在6 X IO9個/mL左右時；發(fā)酵產(chǎn)物直接制備成制劑；
(4)固體粉劑的制備發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液通過低溫冷凍干燥制備成一定粒度的固體粉劑，具體操作為發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液采用離心機在6000rpm下離心15min，收集離心后的沉淀菌體，添加海藻糖作為保護劑，然后進行低溫(_80°C )冷凍干燥處理，制備成凍干粉； 冷凍干燥后的凍干粉，根據(jù)對活菌數(shù)的要求添加次粉進行稀釋處理，凍干粉次粉重量比為 I :500，活菌含量在I. 5 X IO8個/g左右。該微生物制劑的實際使用效果如下
在廣東江門一羅非魚養(yǎng)殖池塘使用，面積20畝，水深I(lǐng). 5米，夏季高溫(6 8月)時池塘水質(zhì)過濃，水色不好，水質(zhì)中氨氮、亞硝酸氮分別達到2. 85mg/L、0. 52mg/L，超標(biāo)嚴(yán)重， 水體中海豚鏈球菌達2 X IO6個/mL，影響羅非魚的生長，羅非魚有20%左右的死亡率。在一晴天上午10點左右將上述配方的防治羅非魚鏈球菌病的微生物固體粉劑應(yīng)用于養(yǎng)殖池塘中，用量為I. OKg/畝·米水深，連用3天。用后5天水色好轉(zhuǎn)，由濃綠色轉(zhuǎn)為淺黃綠色，透明度增大；水體中氨氮、亞硝酸氮含量降至O. 42mg/L和O. 10mg/L ；5天后，海豚鏈球菌數(shù)量下降為3X IO4個/mL，羅非魚死亡率下降60%，羅非魚攝食恢復(fù)正常。實施例3
(1)將菌種A(紅色諾卡氏菌ATCC 11653)和菌種B (珊瑚色諾卡氏菌ACCC 40100)混合，以細(xì)菌細(xì)胞干重計配比比例，菌種A :菌種B為2 :1 ;
(2)培養(yǎng)基:
獲得大的生物量的通用培養(yǎng)基以無機氮源和有機碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)；通用培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉25g/L，硫酸銨5g/L，磷酸氫二鉀O. 85g/L ； 具體配制方法為先將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g切成小塊，加水煮至能被玻璃棒戳破即可，用四層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖和可溶性淀粉，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補加其它成分，并補足水分至1000毫升，調(diào)PH7. 5 ；
(3)菌種發(fā)酵制備
a)搖床培養(yǎng)將斜面保存的菌種A和菌種B接入裝有通用培養(yǎng)基的IOOOmL三角瓶中 (共接3瓶)，通用培養(yǎng)基量為三角瓶容量的1/3，菌種A和菌種B的混合量按混合菌的配比配置，接種量以標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑滿為準(zhǔn)；搖床培養(yǎng)18h，控制培養(yǎng)溫度30 °C, pH 7. 5，轉(zhuǎn)速 130rpm ；
b)種子發(fā)酵接種量10mL/L，從搖床培養(yǎng)的三角瓶中接種進100L種子發(fā)酵罐，釆用通用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，控制發(fā)酵溫度30°C，pH7. 5，種子發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速130rpm，發(fā)酵時間48 小時，待活菌數(shù)在8 X IO9個/mL左右時；發(fā)酵產(chǎn)物作為種子進一步進行發(fā)酵罐發(fā)酵；
c)發(fā)酵罐發(fā)酵種子發(fā)酵產(chǎn)物作為種子接種入2000L發(fā)酵罐，進行發(fā)酵罐發(fā)酵，仍然采用通用培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同種子發(fā)酵罐發(fā)酵；
(4)固體粉劑的制備發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液通過真空干燥制備成一定粒度的固體粉劑，具體操作為發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液添加膨潤土作為吸附載體，發(fā)酵液膨潤土重量比為 I :5，吸附后進行干燥處理，干燥時間為20小時，得吸附粉；干燥后的吸附粉，根據(jù)對活菌數(shù)的要求添加同類型吸附載體進行稀釋處理，吸附粉膨潤土重量比為I :5，活菌含量在 2X108個/g左右。該微生物制劑的實際使用效果如下
在海南一羅非魚養(yǎng)殖池塘使用，面積10畝,水深I(lǐng). 5米,夏季高溫(6 8月)時池塘水質(zhì)過濃，水色不好，水質(zhì)中氨氮、亞硝酸氮分別達到3. 18mg/L、0. 48mg/L，超標(biāo)嚴(yán)重，水體中海豚鏈球菌達I X IO6個/mL，影響羅非魚的生長，羅非魚有10%左右的死亡率。在一晴天上午10點左右將上述配方的防治羅非魚鏈球菌病的微生物固體粉劑應(yīng)用于養(yǎng)殖池塘中，用量為O. 8Kg/畝 米水深。用后2天水色好轉(zhuǎn)，由濃綠色轉(zhuǎn)為淺黃綠色，透明度增大；水體中氨氮、亞硝酸氮含量降至O. 62mg/L和O. 08mg/L ；5天后，海豚鏈球菌數(shù)量下降為I X IO4個 /mL,羅非魚死亡率下降50%，羅非魚攝食恢復(fù)正常。另外，上述實施例I 3中，菌種A和菌種B按比例混合發(fā)酵培養(yǎng)后，獲得復(fù)合細(xì)菌細(xì)胞。在實驗室條件下，細(xì)胞干重濃度為2. O 3. O g/L時，15天內(nèi)對初始濃度為5. Omg/ L的氨氮和O. 6mg/L的亞硝酸鹽氮的去除率達到62. 31% 85. 51%和21. 07% 54. 38% ;對初始濃度為IO6個/mL的海豚鏈球菌的拮抗率達25. 7% 65. 3% ;對由鏈球菌引發(fā)的羅非魚死亡率可降低37. 5% 48. 2%ο
權(quán)利要求
1.一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑，其特征在于所述微生物制劑的活性成分為紅色諾卡氏菌ATCCl 1653和珊瑚色諾卡氏菌ACCC40100。
2.一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑的制備方法，其特征在于由紅色諾卡氏菌ATCCl 1653和珊瑚色諾卡氏菌ACCC40100組成混合菌，采用氮源、碳源及無機鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)完成后，加工成固體粉劑，制得具有降低養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸氮的含量，拮抗羅非魚鏈球菌病病原，提高羅非魚機體的免疫力，防治羅非魚鏈球菌病作用的固體粉劑型微生物制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟(1)微生物菌種菌種A :紅色諾卡氏菌ATCC 11653 ；菌種B :珊瑚色諾卡氏菌ACCC 40100 ；混合菌將菌種A和菌種B混合，以細(xì)菌細(xì)胞干重計配比比例，菌種A :菌種B為I :0.5 2 ;(2)培養(yǎng)基:獲得大的生物量的通用培養(yǎng)基以無機氮源和有機碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)；通用培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉25g/L，硫酸銨5g/L，磷酸氫二鉀0. 85g/L， pH7. 5 ；檢測菌種用的固體培養(yǎng)基是在上述通用培養(yǎng)基中加入2%重量百分比的的瓊脂；無指明情況下均是采用通用培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)菌種發(fā)酵制備a)搖床培養(yǎng)將斜面保存的菌種A和菌種B接入裝有通用培養(yǎng)基的三角瓶中，通用培養(yǎng)基量為三角瓶容量的1/3，菌種A和菌種B的混合量按混合菌的配比配置，接種量以標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑滿為準(zhǔn)；搖床培養(yǎng)12 18h，控制培養(yǎng)溫度30 35 °C，pH 7. 5 8. 5，轉(zhuǎn)速130 180rpm ；b)種子發(fā)酵接種量6-20mL/L，從搖床培養(yǎng)的三角瓶中接種進50 200L種子發(fā)酵罐， 采用通用培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，控制發(fā)酵溫度30 35°C，pH7. 5 8. 5，種子發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速 130 180rpm，發(fā)酵時間48 120小時，待活菌數(shù)在5 X IO9 8 X IO9個/mL時；發(fā)酵產(chǎn)物直接制備成制劑或作為種子進一步進行發(fā)酵罐發(fā)酵；c)發(fā)酵罐發(fā)酵種子發(fā)酵產(chǎn)物作為種子接種入500-2000L發(fā)酵罐，進行發(fā)酵罐發(fā)酵，仍然采用通用培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同種子發(fā)酵罐發(fā)酵；(4)固體粉劑的制備發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液通過干燥制備成一定粒度的固體粉劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中，固體粉劑采用真空干燥方法制得，具體操作為發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液添加吸附載體，發(fā)酵液吸附載體重量比為I : 2 5，吸附后進行干燥處理；根據(jù)干燥溫度、通風(fēng)情況和鋪陳厚度，干燥時間為8 30小時，得吸附粉；干燥后的吸附粉，根據(jù)對活菌數(shù)的要求添加同類型吸附載體進行稀釋處理，吸附粉吸附載體重量比為I :1 10，活菌含量在I X IO8 2 X IO8個/g。
5.如權(quán)利要求3所述的用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中，固體粉劑采用低溫干燥方法制得，具體操作為發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液采用離心機在5000 8000rpm下離心10 15min,收集離心后的沉淀菌體,添加保護劑后進行低溫冷凍干燥處理，制備成凍干粉，所述低溫溫度為_80°C ;冷凍干燥后的凍干粉，根據(jù)對活菌數(shù)的要求添加吸附載體進行稀釋處理，凍干粉吸附載體重量比為I :1 1000，活菌含量在I X IO8 2 X IO8個/g。
6.如權(quán)利要求4或5所述的用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑的制備方法，其特征在于所述吸附載體選用膨潤土、麥麩、次粉或淀粉。
7.如權(quán)利要求5所述的用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑的制備方法，其特征在于所述保護劑選用海藻糖、蔗糖、牛血清蛋白、牛奶中的一種或幾種。
8.一種按權(quán)利要求I所述的微生物制劑在防治羅非魚鏈球菌病方面的應(yīng)用，其特征在于所述微生物制劑用于羅非魚養(yǎng)殖池塘，用量為0. 5 I. OKg/畝 米水深。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于防治羅非魚鏈球菌病的微生物制劑、其制備方法及應(yīng)用。其由紅色諾卡氏菌ATCC11653和珊瑚色諾卡氏菌ACCC40100組成混合菌，采用氮源、碳源及無機鹽組成發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)完成后，加工成固體粉劑。具有降低羅非魚養(yǎng)殖水體水質(zhì)中的氨氮和亞硝酸氮的含量，拮抗羅非魚鏈球菌病病原，減少養(yǎng)殖中后期有害物質(zhì)的積累，提高羅非魚機體的免疫力，達到生物防治羅非魚鏈球菌病的目的，減輕病害所造成的經(jīng)濟損失，保證羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量和質(zhì)量。本發(fā)明的微生物制劑使用方便，使用量小，使用后效果穩(wěn)定。
文檔編號C02F3/34GK102583777SQ20121004888
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者吳偉, 瞿建宏, 陳家長 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心