專(zhuān)利名稱(chēng)：一株耐冷假單胞菌Den-05及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程、環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域。涉及菌株P(guān)seudomonas psychrophiliaDen-05 (耐冷假單胞菌Den-05)及其篩選方法和在低溫條件下城市污水處理中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水體中適量的氮是合成藻類(lèi)等微生物的基本元素，是形成水生生態(tài)環(huán)境重要的物質(zhì)條件，也是水環(huán)境良性循環(huán)的基礎(chǔ)。但目前我國(guó)一些水體中氮的總量已超過(guò)水體容量，過(guò)量的氮元素導(dǎo)致水體藻類(lèi)等生物異常增殖，引起水質(zhì)惡化。同時(shí)，氨氮和亞硝酸鹽氮對(duì)魚(yú)類(lèi)等生物有毒害。由于水體中氮素的各存在方式在一定條件下會(huì)循環(huán)轉(zhuǎn)化，如何控制水體中氮的污染，就成為目前和整個(gè)“十二五”減排過(guò)程都必須面對(duì)的話(huà)題。我國(guó)已開(kāi)始執(zhí)行《城市污水處理廠(chǎng)污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002) —級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)(氨氮<5mg/L，TN<15mg/ U，城市污水處理的重點(diǎn)目標(biāo)已經(jīng)轉(zhuǎn)向氮磷等有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的去除。因此，開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的生物脫氮方法和技術(shù)已成為水污染控制領(lǐng)域熱點(diǎn)之一。一般認(rèn)為，進(jìn)行硝酸鹽呼吸的反硝化細(xì)菌都是兼性厭氧微生物，因?yàn)橹挥性跓o(wú)氧條件下，才能誘導(dǎo)出反硝化作用需要的硝酸鹽還原酶A和亞硝酸鹽還原酶。然而人們近幾年不斷發(fā)現(xiàn)好氧條件下總氮的損失，目前對(duì)好氧反硝化現(xiàn)象形成原因尚無(wú)定論，但由于好氧反硝化較傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)存在著明顯的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)好氧反硝化技術(shù)成為了國(guó)內(nèi)外廢水生物脫氮新的發(fā)展方向。好氧反硝化應(yīng)用的主體是好氧反硝化菌群，目前已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化菌主要集中在假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)和芽孢桿菌屬(Bacillus),菌種應(yīng)用最多,其次為機(jī)理研究,好氧反硝化菌劑利用的的報(bào)道則較少。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)冬季污水處理總N不易達(dá)標(biāo)，處理周期長(zhǎng)、費(fèi)用高的問(wèn)題，本專(zhuān)利從自然界篩選出低溫好氧條件下可顯著提高生物脫氮效率的菌株P(guān)seudomonas psychrophiliaDen-05，并將其制成生物菌制劑，對(duì)低溫條件下城市污水達(dá)標(biāo)排放提供新的實(shí)現(xiàn)思路，對(duì)提高污水廠(chǎng)運(yùn)行效率、降低成本有著明顯的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供的菌株為Pseudomonas psychrophilia Den-05,于 2012 年 03 月 27 日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCC NO. 5942。菌株耐冷假單胞菌Den-05 (Pseudomonas psychrophilia Den-05)是從哈爾濱市信義溝城市污水廠(chǎng)好氧池活性污泥中分離得到，好氧反硝化菌群的馴化過(guò)程均在10 V條件下進(jìn)行。首先取15mL活性污泥和若干玻璃珠至已滅菌好的好氧反硝化液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)4 5d。滅菌條件為121 °C，高壓蒸汽滅菌20分鐘。第一個(gè)培養(yǎng)周期結(jié)束后，將獲得的馴化菌液按15%的接種量加入到新鮮的好氧反硝化液體培養(yǎng)基中繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)4飛山重復(fù)上述操作3 4次。將此混合菌液涂布在好氧反硝化固體培養(yǎng)基上，反復(fù)進(jìn)行平板劃線(xiàn)，固體、液體交替培養(yǎng)，分離出一株高效低溫下進(jìn)行好氧反硝化的菌株psychrophilia Den_05o具體篩選步驟如下
(1)取15mL哈爾濱市信義溝城市污水廠(chǎng)里的新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培養(yǎng)基三角瓶中，置于溫度為10°C，轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床中培養(yǎng)4飛山獲得富集菌液；
(2)取15mL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培養(yǎng)基三角瓶中，重復(fù)步驟(I)的培養(yǎng)條件:T4次，獲得馴化菌液；
(3)梯度稀釋馴化菌液，稀釋梯度分別為10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分別取100 u L馴化菌液加入固體好氧反硝化培養(yǎng)基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為10°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng):T4d，獲得單菌落；
(4)利用之字劃線(xiàn)、三區(qū)劃線(xiàn)繼續(xù)純化所獲得單菌落，好氧反硝化培養(yǎng)基(液體)、固體 好氧反硝化培養(yǎng)基交替培養(yǎng)馴化，加速篩菌過(guò)程，重復(fù)多次操作獲得純菌落；
其中好氧反硝化培養(yǎng)基的組成是7.9 g Na2HPO4 *7H20,0. 3 g NH4Cl,4. 7 g檸檬酸鈉、1.5 g KH2P04、0. I g MgSO4 7H20、1. 5 g KNO3UmL 微量元素液溶于 1000 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7. 2 ;固體好氧反硝化培養(yǎng)基在好氧反硝化培養(yǎng)基中另加有18g瓊脂；
微量元素的組成是:0. I g CuSO4 5H20、0. 3 g MnSO4 4H20、0. 2 g ZnSO4 7H20、
2.0 g NaHCO3 IOH2O, 0. 5 g CoCl2 6H20、0. 05g CaCl2 2H20、0. 5g FeSO4 7H20、0. 02g(NH4)6Mo7O2 4H20 溶于 IOOOmL 的蒸餾水中。本發(fā)明篩選方法的步驟(2)中獲得的馴化菌液OD66tl為I. 0，培養(yǎng)基均在121°C下滅菌20 min后使用。菌株P(guān)seudomonas psychrophilia Den-05在低溫條件下對(duì)硝酸鹽的降解能力極強(qiáng)，應(yīng)用在冬季低溫、好氧條件下的城市污水處理中。本發(fā)明采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)從自然生境中篩選出低溫、好氧反硝化菌Pseudomonas psychrophilia Den_05,實(shí)現(xiàn)了生物脫氮菌劑的制備,為生物強(qiáng)化體系提供了高效脫氮菌種，并通過(guò)縮短厭氧周期進(jìn)而縮短曝氣周期的調(diào)控方式，提高城市污水廠(chǎng)冬季脫氮效果，實(shí)現(xiàn)好氧條件下硝酸鹽氮的去除，達(dá)到出水水質(zhì)要求。


圖I是本發(fā)明的好氧反硝化菌108小時(shí)的菌體生長(zhǎng)情況及污染物降解率變化，其中■表示好氧反硝化菌在96小時(shí)生長(zhǎng)周期中的菌濁。圖2是本發(fā)明的好氧反硝化菌低溫反硝化過(guò)程中不同硝態(tài)氮濃度的去除率趨勢(shì)，其中 表示好氧反硝化菌在硝酸鹽初始濃度120mg/L時(shí)的降解轉(zhuǎn)化率，其中▲表示好氧反硝化菌在硝酸鹽初始濃度60mg/L時(shí)的降解轉(zhuǎn)化率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
具體實(shí)施方式
一
(1)取15mL哈爾濱市信義溝城市污水廠(chǎng)里的新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培養(yǎng)基三角瓶中，置于溫度為10°C，轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床中培養(yǎng)4飛山獲得富集菌液；
(2)取15mL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培養(yǎng)基三角瓶中，重復(fù)步驟(I)的培養(yǎng)條件3 4次，獲得馴化菌液，并進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制；
(3)梯度稀釋馴化菌液，稀釋梯度分別為10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分別取100 u L馴化菌液加入固體好氧反硝化培養(yǎng)基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為10°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng):T4d，獲得單菌落；
(4)利用之字劃線(xiàn)、三區(qū)劃線(xiàn)繼續(xù)純化所獲得單菌落，好氧反硝化培養(yǎng)基(液體)、固體好氧反硝化培養(yǎng)基交替培養(yǎng)馴化，加速篩菌過(guò)程，重復(fù)多次操作獲得純菌落；
其中好氧反硝化培養(yǎng)基的組成是7.9 g Na2HPO4 *7H20,0. 3 g NH4Cl,4. 7 g檸檬酸鈉、
1.5g KH2P04、0. I g MgSO4 7H20、1. 5 g KNO3UmL 微量元素液溶于 1000 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7. 2 ;固體好氧反硝化培養(yǎng)基在好氧反硝化培養(yǎng)基中另加有18g瓊脂；
微量元素的組成是:0. I g CuSO4 5H20、0. 3 g MnSO4 4H20、0. 2 g ZnSO4 7H20、 2.0 g NaHCO3 IOH2O, 0. 5 g CoCl2 6H20、0. 05g CaCl2 2H20、0. 5g FeSO4 7H20、0. 02g(NH4)6Mo7O2 4H20 溶于 IOOOmL 的蒸餾水中。步驟(2)中獲得的馴化菌液每12h取菌液測(cè)定OD66tl，培養(yǎng)120h后繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖I所不。60h處菌株吸光度OD66tl可達(dá)到最大值I. 0左右，此后進(jìn)入裳亡期。
具體實(shí)施方式
二將菌種擴(kuò)大培養(yǎng)后加入SBR反應(yīng)器中。方法為10 °C，3000Xg條件下菌液離心5分鐘，菌體加入反應(yīng)器中，每周期加入菌體量為200mL0D66(ll. 0的菌液離心所得菌體，連續(xù)加入菌體4個(gè)周期，測(cè)定反應(yīng)器中N03_含量。SBR反應(yīng)器容積12L，周期為8h，沉淀時(shí)間2h，曝氣時(shí)間、攪拌時(shí)間分別為4h、2h，運(yùn)行方式為曝氣2h后接攪拌lh。配水成分每 20L 配水中含有 25. 58g 乙酸鈉、IOg NH4Cl、2g MgSO4 7H20、2g CaCl2 2H20、2gKH2PO4,2g K2HPO40加入一定量KNO3,測(cè)得連續(xù)20天N03_濃度，數(shù)據(jù)如圖2。硝態(tài)氮濃度在前4天明顯升高，這和加入菌體時(shí)間一致，應(yīng)為菌體中殘留培養(yǎng)基，此后N<V濃度開(kāi)始降低，初始濃度120mg/L下降速度略慢于初始濃度60mg/L,但至第7天后兩反應(yīng)器中硝態(tài)氮濃度均達(dá)到了 10mg/L左右，并穩(wěn)定運(yùn)行13天，表明所篩選好氧反硝化菌有促進(jìn)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的作用，并能長(zhǎng)期存在于反應(yīng)器中活性污泥中，縮短了厭氧時(shí)間進(jìn)而縮短了周期，在實(shí)際應(yīng)用中能夠?qū)崿F(xiàn)很好的脫氮效果。
權(quán)利要求
1.一株耐冷假單胞菌Den-05,其特征在于菌株為Pseudomonas psychrophiliaDen-05，于2012年03月27日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào) CGMCC NO. 5942。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述低溫好氧反硝化細(xì)菌的篩選方法，其特征在于篩選步驟為 (1)取15mL哈爾濱市信義溝城市污水廠(chǎng)里的新鮮活性污泥加入IOOmL好氧反硝化培養(yǎng)基三角瓶中，置于溫度為10°C，轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床中培養(yǎng)4飛山獲得富集菌液； (2)取15mL富集菌液加入IOOmL好氧反硝化培養(yǎng)基三角瓶中，重復(fù)步驟(I)的培養(yǎng)條件:T4次，獲得馴化菌液； (3)梯度稀釋馴化菌液，稀釋梯度分別為10'10_2、10' 10' 10_5、10_6，分別取100 u L馴化菌液加入固體好氧反硝化培養(yǎng)基平板中，涂布法涂勻，置于溫度為10°C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng):T4d，獲得單菌落； (4)利用之字劃線(xiàn)、三區(qū)劃線(xiàn)繼續(xù)純化所獲得單菌落，好氧反硝化培養(yǎng)基(液體)、固體好氧反硝化培養(yǎng)基交替培養(yǎng)馴化，加速篩菌過(guò)程，重復(fù)多次操作獲得純菌落； 其中好氧反硝化培養(yǎng)基的組成是7.9 g Na2HPO4 *7H20,0. 3 g NH4Cl,4. 7 g檸檬酸鈉、1.5g KH2P04、0. I g MgSO4 7H20、1. 5 g KNO3UmL 微量元素液溶于 1000 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 7. 2 ;固體好氧反硝化培養(yǎng)基在好氧反硝化培養(yǎng)基中另加有18g瓊脂； 微量元素的組成是:0. I g CuSO4 5H20、0. 3 g MnSO4 4H20、0. 2 g ZnSO4 7H20、2. 0 g NaHCO3 IOH2O, 0. 5 g CoCl2 6H20、0. 05g CaCl2 2H20、0. 5g FeSO4 7H20、0. 02g(NH4)6Mo7O2 4H20 溶于 IOOOmL 的蒸餾水中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于步驟(2)中獲得的馴化菌液OD66tl為I.O。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于培養(yǎng)基均在121°C下滅菌20min后使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的低溫好氧反硝化細(xì)菌，其特征在于菌株P(guān)seudomonaspsychrophilia Den-05在低溫條件下對(duì)硝酸鹽具有降解能力，應(yīng)用在冬季低溫、好氧條件下的城市污水處理中。
全文摘要
一株耐冷假單胞菌Den-05，屬于生物工程、環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，菌株為PseudomonaspsychrophiliaDen-05，于2012年03月27日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，其保藏號(hào)CGMCCNO.5942，采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)從自然生境中篩選出低溫、好氧反硝化菌PseudomonaspsychrophiliaDen-05，實(shí)現(xiàn)了生物脫氮菌劑的制備，為生物強(qiáng)化體系提供了高效脫氮菌種，并通過(guò)縮短厭氧周期進(jìn)而縮短曝氣周期的調(diào)控方式，提高城市污水廠(chǎng)冬季脫氮效果，實(shí)現(xiàn)好氧條件下硝酸鹽氮的去除，達(dá)到出水水質(zhì)要求。
文檔編號(hào)C02F3/02GK102776140SQ20121015292
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者孔祥震, 崔迪, 龐長(zhǎng)瀧, 李昂, 蔡蕊, 邱天, 馬放 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)宜興環(huán)保研究院