專利名稱：用于造紙廢水生物處理的漆酶、編碼基因及其表達(dá)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及了一種用于造紙廢水生物處理的漆酶、編碼基因及其在造紙廢水生物處理中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國(guó)造紙エ業(yè)年廢水排放量大，處理難度高，加上《制漿造紙エ業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB3544-2008)的頒布和實(shí)施，造紙エ業(yè)廢水的處理難度加大，處理費(fèi)用大幅増加。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，法律法規(guī)的不斷健全及造紙廢水的排放指標(biāo)的不斷嚴(yán)格，造紙廢水的處理和達(dá)標(biāo)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前造紙廢水常用的處理方法主要有物理法和化學(xué)法，但無(wú)法徹底消除廢水中較難處理的物質(zhì),如纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和酚類化合物等。生物法是處理造紙廢水的一 種最有效、最安全和最徹底的方法。漆酶是ー種結(jié)合多個(gè)銅原子的蛋白質(zhì)，屬于銅藍(lán)氧化酶。漆酶作用底物相當(dāng)廣泛，能夠?qū)Χ喾N污染物如各種酚類染料、取代酚、氯酚、硫酚、雙酚、芳香胺等。在漆酶介體(HBT, ABTS等)存在下，漆酶還可以催化降解與木質(zhì)素相關(guān)的ニ苯基甲烷及ニ噁英等。漆酶是近年發(fā)現(xiàn)在造紙エ業(yè)中最具潛力的生物酶，具有催化氧化木素的能力。漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解，不會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，并且生產(chǎn)在常溫、常壓的溫和條件下進(jìn)行，節(jié)約設(shè)備和能耗。因此漆酶在造紙エ業(yè)廢水處理等方面有著非常巨大的應(yīng)用前景。從1983年起人們陸續(xù)在生脂固氮螺菌(Azospirillum Iipoferum)、交替單胞菌(Alteromonas sp. MMB-1)、大腸桿菌(Escherichia coli )、假單胞菌(Pseudomonas sp.KU03 )、黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、球形芽抱桿菌(Bacillus sphaericus)、極端耐堿芽孢桿菌(B. halodurans)和暗藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces cyaneus )、天藍(lán)色鏈霉菌(S. coelicolor)及沙鏈霉菌(S. psammoticus)等一些菌株中均發(fā)現(xiàn)有漆酶活性。(汪春蕾等，2011)
由于缺乏再現(xiàn)環(huán)境條件的方法和培養(yǎng)基質(zhì)，造成了絕大多數(shù)微生物難以被標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的方法復(fù)蘇和培養(yǎng)，稱為未培養(yǎng)微生物(uncultured microorganism)。使用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)培養(yǎng)技術(shù)對(duì)不同生境微生物可培養(yǎng)性的測(cè)定來(lái)看，海水中微生物可培養(yǎng)的約為O. 001%
O.1%，淡水約為O. 25%，土壤約為O. 3%，活性污泥為1% 15%左右。也就是說，目前絕大部分自然環(huán)境微生物很難或不能通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離方法得到其純培養(yǎng)。因此，利用構(gòu)建基因文庫(kù)的分子生物學(xué)方法來(lái)篩選新的高效漆酶基因，利用畢赤酵母組成型表達(dá)來(lái)提高漆酶的表達(dá)活力，對(duì)于促進(jìn)漆酶在造紙廢水生物處理中的應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從造紙污水處理廠的活性污泥中篩選出的新的漆酶基因，該基因能夠在酵母細(xì)胞中組成型表達(dá)。含有新的漆酶基因的酵母表達(dá)菌可在造紙廢水中繁殖并表達(dá)漆酶，從而對(duì)造紙廢水進(jìn)行生物增效處理。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決
一種用于處理造紙廢水的漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，共544個(gè)氨基酸。具體的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，全長(zhǎng)為1662bp，GC含量為40.07%。本發(fā)明涉及的漆酶基因，是ー種新的基因，與同類基因沒有同源性。其編碼的漆酶是ー種新的漆酶，與其他已報(bào)道的漆酶氨基酸序列相比，相似性小于40%。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本發(fā)明的漆酶基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行ー個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失所得到的功能類似物均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在已知本發(fā)明漆酶基因的情況下，本發(fā)明普通技術(shù)人員可按本領(lǐng)域常規(guī)方法構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化、表達(dá)，獲得所述漆酶。本發(fā)明還涉及含有所述漆酶基因的宿主菌。 本發(fā)明還涉及含有所述基因的重組載體，將含有所述基因的重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌(通常為酵母菌)中，進(jìn)行表達(dá)，即可獲得本發(fā)明漆酶。本發(fā)明還涉及所述基因在制備重組漆酶中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述的漆酶在造紙廢水生物處理中的應(yīng)用，本發(fā)明的漆酶的最適溫度是30-40°C，最適pH為5-6。將基因工程菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，按O. 05%的添加量添加到曝氣池中進(jìn)行處理。本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果
本發(fā)明提供了ー種新的漆酶基因，能夠在酵母菌中組成型高效表達(dá)，克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)及誘導(dǎo)表達(dá)的不足，可提高漆酶的表達(dá)活力，對(duì)于促進(jìn)漆酶在造紙廢水生物處理中的應(yīng)用具有重要意義。


圖I為漆酶的最適pH曲線；
圖2為漆酶的最適溫度曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖I至附圖2與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)描述
實(shí)施例I :活性污泥DNA文庫(kù)的構(gòu)建
I、活性污泥DNA的提取
從某造紙廢水污水處理廠采集污泥，經(jīng)過適當(dāng)稀釋作為樣品進(jìn)行DNA的提取。12000r · HiirT1離心5 min收集樣品，TE重懸洗滌一次后，加溶菌酶至終濃度為100 Ug-πιΓ1,37で水浴2小時(shí)。加5 M NaCl調(diào)整終濃度至O. 5 Μ，混勻后加入40 μ I蛋白酶K和20 %SDS (終濃度為O. 5 1 %)，37で過夜或者50で水浴3 h至溶液粘稠澄清。加1/3體積的飽和NaCl劇烈振蕩15 s后，12000 r · mirT1離心5 min,收集上清至一滅菌離心管中，カロ入O. 6 V異丙醇混勻后沉淀，12000 r .mirT1離心收集沉淀，用70 %こ醇洗滌，吹干后溶于400 μ I滅菌去離子水中。2、DNA文庫(kù)的構(gòu)建
(I)DNA的酶切
用Sau3A I部分酶切活性污泥總DNA，先用檢測(cè)型反應(yīng)體系進(jìn)行酶切，確定最適酶切濃度及時(shí)間，最終進(jìn)行制備型部分酶切。檢測(cè)型酶切反應(yīng)體系(10 μ L):總DNA 2 μ L, Sau3AI適量，緩沖液I μ L，加ddH20至終體積10 μし制備型酶切反應(yīng)體系(100 μ L):總DNA 20μ L，Sau3AI適量，緩沖液10 μ L，加ddH20至終體積100 μし其中所加Sau3AI酶量根據(jù)酶切濃度及時(shí)間進(jìn)行摸索，切膠回收2 4 kb條帶的DNA片段，作為外源片段。(2)脫磷載體的制備
提取puclS質(zhì)粒，用BamHI進(jìn)行單酶切，回收I. Skb大小的線性片段進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)。在微量離心管中建立以下的反應(yīng)體系線性化pucl8載體28ul，10X堿性磷酸酯酶緩沖液 5 μ , CIAP (16 U/μΙ TAKARA) O. 5ul，加 ddH20 至終體積 50 μ 。50 °C反應(yīng) 30 min,加1/10體積O. 5M的EDTA終止反應(yīng)；合并四管用ddH20補(bǔ)足至500ul ;加400ul酚/氯仿抽提I次，吸出上清；加1/10V的3M NaAc, 2V預(yù)冷的こ醇，在-20度沉淀60min ;離心收集沉淀，用200 μ 70 %こ醇洗滌后吹干，用20 μΙΤΕ溶解。電泳定量，5(Tl00ng/管分裝保存于終濃度為50%的滅菌甘油中，備用。 (3)轉(zhuǎn)化
將外源片段和載體按比例進(jìn)行過夜酶連。取萬(wàn).cWi DH5a高效感受態(tài)細(xì)胞(每管約200μ I)于冰浴中融化，每管加2 μ I酶連產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰浴中放置30 min，將離心管放入42で的循環(huán)水浴中，熱激90 S，不要搖動(dòng)離心管?？焖賹㈦x心管移到冰浴中使細(xì)胞冷卻f 2min后每管加800 μ I預(yù)熱至37で的LB培養(yǎng)基，混勻后在37で搖床中，150 !■ mirT1溫育45 min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。涂布復(fù)蘇后的轉(zhuǎn)化液到加氨芐青霉素(100 yg-mF1)的新鮮LB平板上，待菌液被完全吸收后，倒置平板于37で培養(yǎng)，12 16 h后出現(xiàn)菌落。(4)文庫(kù)的檢查與保存
挑取150個(gè)陽(yáng)性克隆接種于抗生素平板上，37で培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出后，隨機(jī)挑取部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取，檢查外源片段插入情況，并將培養(yǎng)好的平板于4で保存?zhèn)溆?。檢測(cè)后的平板用無(wú)菌水將菌落洗下后加甘油至終濃度15%，于-70°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2 :漆酶基因的篩選和序列分析
將DNA文庫(kù)中克隆子分別培養(yǎng)保存，進(jìn)行陽(yáng)性克隆子和高效產(chǎn)漆酶轉(zhuǎn)化子的篩選。初篩培養(yǎng)基
Bavendamm氏反應(yīng)培養(yǎng)基在PDA固體培養(yǎng)基中加入鞋酸使其終濃度為O. 4 mmo I/
L;
氧化帶測(cè)定培養(yǎng)基在PDA固體培養(yǎng)基中加入愈創(chuàng)木酚使其終濃度為O. 04%。復(fù)篩培養(yǎng)基
馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸ニ氫鉀3 g，七水硫酸鎂I. 5 g,酵母浸膏Ig，蒸餾水I 000 mL,煮沸過濾，冷卻后分裝至250 mL三角瓶，每瓶裝入50 mL培養(yǎng)基。產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基
葡萄糖30 g，硝酸鈉2 g,七水硫酸鎂O. 5 g，三水磷酸氫ニ鉀I g，七水硫酸亞鐵O. 01 g，氯化鉀O. 5 g，蒸懼水I 000 mL,自然pH。高產(chǎn)菌株的初篩
Bavendamm氏反應(yīng)培養(yǎng)基常規(guī)滅菌倒平板，取培養(yǎng)好的直徑12 mm、7 d菌齡待測(cè)菌塞2片接種于初篩平板，28°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，挑選菌絲生長(zhǎng)良好，使鞣酸、愈創(chuàng)木酚二者變色能力強(qiáng)、變色速度快的平板，并接種于PDA斜面，ー并于4 V保存。高產(chǎn)菌株的復(fù)篩
在無(wú)菌條件下，用打孔器于初篩所得菌的平板上打孔，制成直徑12 _菌塞，接入裝有50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，每瓶接種2片，3個(gè)平行，28で、120 r/ min振蕩培養(yǎng)，每天取樣測(cè)定漆酶活性，持續(xù)10 d，選擇漆酶活力高的菌株。漆酶活力用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，一個(gè)酶活単位定義為在25°C條件下每分鐘使
Iμ mo I的底物轉(zhuǎn)化所需的酶量。選取漆酶活力最高的的克隆子，提取質(zhì)粒對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序。漆酶基因命名為L(zhǎng)acN,載體命名為puc-LacN。 測(cè)序結(jié)果在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有發(fā)現(xiàn)和該基因序列同源的序列，其應(yīng)為一新序列。經(jīng)過對(duì)漆酶基因LacN的分析，預(yù)測(cè)了該酶可能的編碼序列，去除信號(hào)肽后，包括起始密碼及終止密碼在內(nèi)，共1662個(gè)核苷酸(SEQ IDNO:2)，編碼 544 個(gè)氨基酸(SEQ ID NO: I)。實(shí)施例3 :漆酶基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)
I、表達(dá)載體的構(gòu)建
將puc-LacN用EcoR I /Not I雙酶切，回收外源片段，以正確的閱讀框插入到同樣雙酶切的畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPZaA (美國(guó)invitrogen公司)連接,轉(zhuǎn)化E. coliDH5 α，獲得重組質(zhì)粒pGAPZaA- LacN0該重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I /Not I雙酶切驗(yàn)證。2、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
在含5 ml YPD的50 ml離心管中，培養(yǎng)酵母細(xì)胞，30度過夜；取30 50 ul過夜培養(yǎng)物，接種含50 ml新鮮培養(yǎng)基的250 ml搖瓶，過夜生長(zhǎng)至0D600 = I. 3 I. 5;在4度，1500 g離心5 min收集細(xì)胞，用50 ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；如上離心，用25 ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；如上離心，用2 ml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞；如上離心，用100 ul預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞。3、電轉(zhuǎn)化
將pGAPZaA- LacN用Bgl II酶切線性化，將5 IOug線性化DNA與80 uL電轉(zhuǎn)化細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)移到O. I cm電轉(zhuǎn)化杯，冰浴5 min。電轉(zhuǎn)化參數(shù)0. 75kV，25uF，200 Ω。電擊后立即加入ImL預(yù)冷的IM山梨醇。復(fù)蘇Ih后取150ul涂布含有Zeocin抗性的YPD平板上培養(yǎng)。在30度孵育平板至克隆產(chǎn)生。4、產(chǎn)漆酶轉(zhuǎn)化子的篩選
將轉(zhuǎn)化子平板上的單菌落分別培養(yǎng)保存，進(jìn)行陽(yáng)性克隆子和高效產(chǎn)漆酶轉(zhuǎn)化子的篩選。篩選方法同實(shí)施例2。實(shí)施例4 :漆酶的特性研究
I、pH值對(duì)漆酶活性的影響
將漆酶加入不同PH值的緩沖液體系中測(cè)定酶活力，pH設(shè)置從2. O到10. 0，每隔O. 5取點(diǎn)測(cè)定。酶活性測(cè)定反應(yīng)在25°C進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為15 min。結(jié)果如圖I所示，漆酶的最適pH值為5 6，在pH4. 0-6. 5范圍內(nèi)，漆酶活能保持在50%以上。2、溫度對(duì)漆酶活性的影響漆酶的最適反應(yīng)溫度測(cè)定在最適pH值下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為15 min，溫度設(shè)置從150C到75°C，每隔5で取點(diǎn)測(cè)定。結(jié)果如圖2示，漆酶的最適溫度為30 40°C，20^50で時(shí)的酶活能保持60%以上。實(shí)施例5 :漆酶基因工程菌在造紙廢水處理中的應(yīng)用
由于基因工程菌中漆酶為組成型表達(dá)，因此可將基因工程菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，按O. 05%的添加量添加到某造紙廢水處理廠SBRエ藝(序列間歇式活性污泥法)曝氣池中進(jìn)行處理。與對(duì)照組相比，漆酶基因工程菌可將造紙廢水處理效率提高15%左右，在未來(lái)的造紙廢水處理中有重要的應(yīng)用意義。總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種漆酶基因，其特征在干其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.含有如權(quán)利要求I所述基因編碼的漆酶，其特征在干其氨基酸序列如SEQIDNO: I所示。
3.含有如權(quán)利要求I所述漆酶基因的重組表達(dá)載體。
4.含有如權(quán)利要求I所述的漆酶基因的宿主菌。
5.含有如權(quán)利要求I所述的漆酶基因在制備重組漆酶中的應(yīng)用。
6.含有如權(quán)利要求I或2所述漆酶基因的工程菌在造紙廢水處理中的應(yīng)用，其特征在于所述漆酶的最適溫度是30-40°C,最適pH為5-6。
7.含有如權(quán)利要求I或2所述漆酶基因的工程菌在造紙廢水處理中的應(yīng)用，其特征在于將基因工程菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，按O. 05%的添加量添加到曝氣池中進(jìn)行處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于造紙廢水生物處理的漆酶、編碼基因及其在造紙廢水生物處理中的應(yīng)用。該漆酶基因核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；含有該基因編碼的漆酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。能夠在酵母菌中組成型高效表達(dá)，克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)及誘導(dǎo)表達(dá)的不足，本發(fā)明漆酶基因可提高漆酶的表達(dá)活力，對(duì)于促進(jìn)漆酶在造紙廢水生物處理中的應(yīng)用具有重要意義。
文檔編號(hào)C02F3/00GK102676550SQ20121015301
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者徐甦, 楊瑾, 鄭展望 申請(qǐng)人:浙江商達(dá)環(huán)保有限公司