專利名稱：一種用降解性細(xì)菌修復(fù)除草劑阿特拉津污染土壤的方法
一種用降解性細(xì)菌修復(fù)除草劑阿特拉津污染土壤的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于污染土壤修復(fù)領(lǐng)域，涉及兩個(gè)降解除草劑阿特拉津的細(xì)菌菌株的分離 和鑒定，以及用這兩株細(xì)菌對(duì)阿特拉津污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)的方法。
背景技術(shù)：
阿特拉津是一種三嗪類除草劑，商品名莠去津，主要用于玉米、高粱和甘蔗地的雜 草防除。我國(guó)自20世紀(jì)80年代初開始生產(chǎn)和使用阿特拉津，目前每年的產(chǎn)量約為2萬(wàn)噸， 這種除草劑的大量生產(chǎn)和使用造成對(duì)土壤、地下水和地表水的污染。研究表明，阿特拉津是 一種內(nèi)分泌干擾劑，它能干擾激素的調(diào)節(jié)功能，引起人和兩棲動(dòng)物的生殖缺陷，誘發(fā)腫瘤 和癌癥。阿特拉津在土壤中的殘留過(guò)高時(shí)，會(huì)影響輪作作物的生長(zhǎng)，并對(duì)糧食和食品安全構(gòu) 成威脅。在地表水中達(dá)到一定濃度后，會(huì)使水體動(dòng)植物群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，還會(huì)威脅飲用 水的安全。由于阿特拉津的用量大，遷移性強(qiáng)，污染潛力大，所以有關(guān)這種除草劑的生物降 解機(jī)理和污染土壤生物修復(fù)的研究引起高度重視。
近年來(lái)，用阿特拉津降解菌對(duì)污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)的研究取得重要進(jìn)展。1999 年Newcombe等為了解決接入土壤中的細(xì)菌不容易存活因而降解能力逐漸下降的問(wèn)題，采 用了連續(xù)接種的方法，他們用假單胞菌(Pseudomonas sp. ) ADP菌株修復(fù)阿特拉津濃度為 100mg/kg的污染土壤時(shí)，每3天接種一次，35天后阿特拉津去除率達(dá)到90% (Newcombe DAj et al Bioremediation of atrazine-contaminated soil by repeated applications of atrazine-degrading bacteria.Appl Microbiol BiotechnoI，1999，51:877-882)。 2004年Silva等把生物強(qiáng)化與生物剌激方法結(jié)合起來(lái)，在接入ADP菌株的同時(shí)，向阿特拉 津濃度為337. 4mg/kg的土壤中加入一定量的檸檬酸鈉和琥珀酸鹽作為細(xì)菌生長(zhǎng)的碳源， 13 天以后阿特拉津的降解率達(dá)到 79. 9% (Silva Ej et al. Combined bioaugmentation and biostimulation to cleanup soil contaminated with high concentrations of atrazine. Environ Sci Technol, 2004，38:632-6379)。2009 年 Lima 等將連續(xù)接種 ADP 菌株(每周3次)與生物刺激(加入檸檬酸鈉至2. 4mg/g)結(jié)合起來(lái)，對(duì)阿特拉津濃度為 60mg/kg的污染土壤進(jìn)行為期I周的生物修復(fù)，阿特拉津去除率達(dá)到98% (Lima D, et al Evaluating a bioremediation tool for atrazine contaminated soils in open soil microcosms: The effectiveness of bioaugmentation and biostimulation approaches. Chemosphere, 2009, 74:187 - 192)。2005 年胡江等分別用節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. )AG 和 微小桿菌(Exiguobacterium sp. )BTAH1菌株接種阿特拉津濃度為50mg/kg的污染土壤,經(jīng) 8天處理后阿特拉津降解率分別為96. 9%和96. 4% (胡江等.兩株降解菌對(duì)阿特拉津污染 土壤的修復(fù)效果研究。土壤學(xué)報(bào)，2005，42:323-327)。
上述用于阿特拉津污染土壤生物修復(fù)的細(xì)菌都是單一菌株，使用起來(lái)有一定局限 性，有的存活期較短，有的降解能力不是很高，需要處理較長(zhǎng)時(shí)間，而且操作過(guò)程較為復(fù)雜， 需要多次接種。大規(guī)模土壤生物修復(fù)工程需要降解能力強(qiáng)而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單的菌種，利用 具有不同性質(zhì)的細(xì)菌菌株，把它們組合起來(lái)進(jìn)行污染土壤的修復(fù)，是解決上述問(wèn)題的良好策略。
國(guó)外于1996年授權(quán)一項(xiàng)用于阿特拉津污染土壤生物修復(fù)的專利，所用的細(xì)菌菌株是 Pseudomonas sp. ADP (U. S. patent5508193, Pseudomonas strain for degradation of s-triazines in soil and water.1ssuedAprill6, 1996);目前，國(guó)內(nèi)尚未見用細(xì)菌對(duì)阿特拉津污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)的專利。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于分離具有不同性質(zhì)的降解除草劑阿特拉津的細(xì)菌菌株，然后將它們組合起來(lái)用于阿特拉津污染土壤的生物修復(fù)。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下
本發(fā)明所使用的兩個(gè)細(xì)菌菌株為節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. ) AD32和假單胞菌 (Pseudomonas sp.)AD35。Pseudomonas sp. AD35 菌株于 2012 年 9 月 11 日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)”，保藏號(hào)為CGMCC No. 6552。Arthrobacter sp. AD32菌株于2012年9 月11日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)”，保藏號(hào)為CGMCC No. 6553。
本發(fā)明的實(shí)施步驟如下第一步，從農(nóng)藥廠工業(yè)廢水和污泥的混合物中分離降解除草劑阿特拉津的細(xì)菌菌株，對(duì)菌株的分類地位和降解性能進(jìn)行鑒定，然后選擇降解能力強(qiáng)且分類地位和生理性質(zhì)不同的2個(gè)菌株Arthrobacter sp. AD32和Pseudomonas sp. AD35 進(jìn)行組合；第二步，利用人工組合菌，在添加適量碳源(lg 3g/L蔗糖)和磷源(0. 2g/ LNa2HPO4 ·12Η20，0. lg/L KH2PO4)的情況下，對(duì)阿特拉津濃度為200mg/kg的污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)，經(jīng)過(guò)2天修復(fù)，阿特拉津去除率達(dá)到100%。
本發(fā)明的具體方法如下
1.阿特拉津降解菌株的分離和鑒定從生產(chǎn)阿特拉津的農(nóng)藥廠中采集廢水和污泥樣品，混勻后取5g接種到45mL阿特拉津無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(每升含KH2PO4 0. 9g, Na2HPO4 · 12H20 6. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，蔗糖 Ig 3g，阿特拉津 200mg 500mg，微量元素溶液 ImL)中，30°C震蕩培養(yǎng)3天，然后取5mL接種到新的阿特拉津無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，如此重復(fù)3 次。將最后一次培養(yǎng)物稀釋后涂阿特拉津平板(阿特拉津無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基加2%瓊脂粉)，30°C 溫箱中培養(yǎng)3飛天，長(zhǎng)出的單菌落在阿特拉津瓊脂平板上劃線純化2次，得到純培養(yǎng)的阿特拉津降解菌株。從多個(gè)分離菌株中篩選出2個(gè)降解能力最高的菌株，分別命名為AD32和 AD35。
按常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增AD32和AD35菌株的16S rRNA基因，然后測(cè)序并與 GenBank中的類似序列進(jìn)行比對(duì)，確定其分類地位，鑒定到屬。經(jīng)16S rRNA基因鑒定， AD32和AD35分別屬于節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)。鑒定結(jié)果見表1，基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹見

圖1和圖2。PCR擴(kuò)增引物是 27F (AGAGTTT GATCMTGGCTCAG)和 1492R(CGGYTACCTTGTTACGACTT)。PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性I分鐘，55°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 分鐘。
表I阿特拉津降解菌株AD32和AD35基于16S rDNA的分類鑒定
權(quán)利要求
1.一種用降解性細(xì)菌修復(fù)除草劑阿特拉津污染土壤的方法，其特征在于，該方法使用的菌種為降解除草劑阿特拉津的Pseudomonas sp. AD35菌株和Arthrobacter sp. AD32 菌株，這2個(gè)菌株已保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)分別為 CGMCC No. 6552 和 CGMCC No. 6553，其 16S rRNA 基因序列如下Pseudomonas sp. AD35 的 16S rRNA 基因序列(1498 bp)catggctcag aitgaacgci ggcggcaggc ctaacacalg caaglcgagc agcttgcttc ctgatttagc ggcggacggg tgagtaatgc etaggaatct gggggalaac gt lccgaaag gaacgctaal adcgoataeg tcctacggga gaccttcggg ccttgcgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt iggcicacca aggcgacgal ccgiaaclgg tctgagagga tgateagtca gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca gcclgalcca gccalgccgc gtglglgaag aaggtcttcg gattgtaaag tgggaggaag ggcattaacc taatacgtta gtgttttgae gttaccgaca cggctaacli cgtgccagca gccgcgglaa iacgaagggt gcaagcgtta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcgt laagttggat gtgaaagece ctgggaactg calccaaaac lggcgagcta gagtacggta gagggtggtg glgtagcggt gaaalgcgta gaiataggaa ggaacaecag tgegaagega tgalac Igac ac lgaggigc gaaagcglgg ggagcaaaea ggattaaata gcacgccgia aacgatgtca actagccgtl gggttcettg agaaettagt acgcattaag ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa gggggcccgc acaagcggig gagca Lgtgg tttaattcga ageaacgcga clggecttga catgcigaga actliccaga gatggattgg tgectteggg caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg Lcgtgagatg ttgggttaag agcgeaaecc ltgtccttag ltaccagcac gtaatggtgg gcactctaag gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg icaagteate atggeeetta iacacacglg ctacaalggl egglacaaag ggttgeeaag ecgcgaggtg cataaaaccg atcgtagicc ggatcgcagi ctgeaaetcg actgcgtgaa cIaglaaLcg lgaalcagaa tgtcaeggtg aatacgttec egggecttgt cgtcacacca tgggagtggg tigetecaga agtagctagt etaaecttcg laccacggag igalAcaiga ctggggtgga gtegtaaeaa ggtageeg.AD32 的 16S rRNA 基因序列(1483 bp)catggctcag gaigaaagci ggcggcgigc iiaacacatg caagtcgaac gctigctggg ggaUagtgg cgaacgggig aglaacacgt gagtaaectg Lgggataagc cigggaaact gggLcLaala ccggatacga ecattceacg iggtggaaag cititgiggt ttiggaigga cicgeggcct ateagcttgt atggcciacc 過(guò)aggcgacga cgggiagceg gcctgagagg gtgaccggec tgagiicacgg cccagacicc LacgggHggc agcagtgggg aatattgcac agccigatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa tagggaagaa· gcgtaagiga cggiaccigc agaggasgeg eeggetsset agccgcggta atacglaggg cgcaagcglt aLceggsstt attgggcgta aggeggtttg tcgcgtctgc tgtgaaagac cggggctcaa ctccggttctIagagitigat61ggatgaaggg121gccIggiagt181gaaagcaggg241ggtgaggLaa301cactggaact361aigggcgaaa421cactttaagt481gaataagcac541aicggaatta601eggge Ixaac661gaaaittcct721ccacctggac781ccclggtagt841ggcgcagcla901atgaaligac961agaaccitac1021aactcagaca1081LcccgUmcg1141gagactgccg1201cggccagggc126!gageiaatcc1321gicggaalcg1381acacaccgcc1441gggggacggtArthrobacter sp,IagagtUgat81ipi Lgatccca121ccctigaclc181caigiggigg241tggiggggta301acactgggac361aaigggcgca421cctcttlcag481acglgccagc541aagagctcgt
2.一種用降解性細(xì)菌修復(fù)除草劑阿特拉津污染土壤的方法，其特征在于，用 Pseudomonas sp. AD35和Arthrobacter sp. AD32的等量混合菌菌液對(duì)阿特拉津濃度為200 mg/kg的污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)，混合菌液的濃度為IO4IO8細(xì)胞/mL，并含有適量蔗糖(I g/L^3 8/1)和磷酸鹽(0.3 g/L)，在30°C條件下進(jìn)行為期2天的生物修復(fù)以后，阿特拉津去除率為100%。
全文摘要
本發(fā)明屬于污染土壤修復(fù)領(lǐng)域，涉及兩個(gè)降解除草劑阿特拉津的細(xì)菌菌株的分離和鑒定，以及用這兩個(gè)菌株的混合菌對(duì)阿特拉津濃度為200mg/kg的污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)的方法。所用菌株分別是節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)AD32和假單胞菌(Pseudomonas sp.)AD35，在進(jìn)行土壤修復(fù)時(shí)向菌懸液中加入適量蔗糖(1g/L~3g/L)和磷酸鹽(0.3g/L)，30℃處理2天后阿特拉津去除率為100％。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102989761SQ201210396660
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者牛淑敏, 郭巧云, 蔡寶立 申請(qǐng)人:南開大學(xué)