固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，將固定化漆酶用于多環(huán)芳烴污染土壤進(jìn)行修復(fù)；土壤采用泥漿，水土比為3:1，溶液部分為HAc-NaAc緩沖液(pH=4)，污染物的初始濃度為100μg/ml；固定化漆酶投入土壤中的量1g/50ml，溫度為20~40℃，pH值為4~6，時(shí)間為72h。本發(fā)明可以在較寬的pH、溫度及鹽濃度范圍內(nèi)處理低濃度或較高濃度的污染物，使多環(huán)芳烴污染土壤得到了有效修復(fù)。
【專利說明】 固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及固定化漆酶對多環(huán)芳烴(PAHs)污染土壤的修復(fù)方法，具體的說是采用兩種方法對漆酶進(jìn)行固定化，在不同的溫度，不同的PH下，用于多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)，目的是對通過固定化漆酶對多環(huán)芳烴的降解，為有機(jī)污染土壤的修復(fù)開辟一條新的途徑。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(laccase，E.C.1.10.3.2)是一種發(fā)現(xiàn)較早的含銅的多酚氧化酶，早在1883年，日本人吉田從漆樹的分泌物中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)，它可使油漆迅速固化。漆酶能夠催化許多酚類化合物發(fā)生氧化反應(yīng)，并使用分子氧作為電子受體將其還原成水。漆酶作用的底物相當(dāng)廣泛，包括多酚、甲基替代單酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯，以及其它容易氧化的化合物[。由于具有相當(dāng)寬泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，漆酶在廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉(zhuǎn)化生物傳感器構(gòu)建等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
[0003]與直接利用微生物處理污染物相比:酶催化反應(yīng)具有以下優(yōu)點(diǎn):①分解效率高。②毒性小，易操作。微生物常常具有致病性，而酶對環(huán)境很友好。因?yàn)槊讣捌浞磻?yīng)產(chǎn)物在環(huán)境中極易進(jìn)一步被生物降解。③使用范圍寬。酶可以在較寬的pH、溫度及鹽濃度范圍內(nèi)處理低濃度或較高濃度的污染物，而微生物一般僅適用于處理較低濃度的污染物。酶的主要缺點(diǎn)是價(jià)格高，且易受各種因素(如鹽的濃度、PH及有機(jī)溶劑等)的干擾變性失活。但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，通過有效地分離、純化、基因表達(dá)與重組技術(shù)，生產(chǎn)大量的、便宜的酶已成為可能。通過使用新型的酶固定化技術(shù)，可明顯提高酶的使用穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，從而可進(jìn)一步降低其使用成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:
本發(fā)明涉及一種固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，其目的是利用固定化漆酶來降解土壤中的多環(huán)芳烴，通過兩種不同固定化漆酶的方法，探求在不同的溫度和不同的PH條件下，來考查污染物的降解效果。
[0005]技術(shù)方案:
一種固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:具體步驟如下:將固定化漆酶用于多環(huán)芳烴污染土壤進(jìn)行修復(fù)；土壤采用泥漿，水土比為3:1，溶液部分為HAc-NaAc緩沖液(pH=4)，污染物的初始濃度為100 μ g/ml ;固定化漆酶投入土壤中的量lg/50ml，溫度為2(T40°C，pH值為4?6，時(shí)間為72 h。
[0006]對漆酶進(jìn)行固定的方法如下:
以尼龍網(wǎng)為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，先交聯(lián)后吸附的固定化方法；具體操作是:將尼龍網(wǎng)剪成0.5cm X0.5cnTl.5cm X 1.5cm大小的方塊，用含質(zhì)量比15?20%CaCl2和質(zhì)量比為15?20 %水的甲醛溶液處理15?20min，洗凈后吸干，于5?8 mo I/L HCl中水解40?50 min，洗至pH中性，吸干；尼龍網(wǎng)在質(zhì)量濃度為5~8%的戊二醛溶液中交聯(lián)6~8h后，加入30U漆酶溶液固定8~10h，用緩沖液清洗，得到固定化漆酶，此時(shí)酶回收率為55.56%。
[0007]對漆酶進(jìn)行固定的方法如下:
以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行了漆酶的固定化；具體操作是:稱取一定量殼聚糖溶于體積比1~5 %冰醋酸，用2~5 mo I/L NaOH使殼聚糖沉淀，水洗至中性，抽濾脫水制成濕狀殼聚糖載體，然后稱取0.1~0.5g殼聚糖與15~20mL與體積濃度為5 %戊二醛交聯(lián)S^lOh后，加入30.0 U酶室溫吸附固定12~15 h，用緩沖液清洗，得到固定化漆酶，酶回收率為 52.24%。
[0008]優(yōu)點(diǎn)及效果:
本發(fā)明提出了一種固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，具有如下優(yōu)點(diǎn):
1.成本低:選擇殼聚糖作為固定化載體是基于它來源豐富、具有親水性、生物相容性以及抗微生物分解特性等。選用其作為漆酶固定化載體是基于它在自然界中資源豐富，價(jià)格低廉，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，與其它天然材料相比更抗拒微生物分解，具有良好的熱穩(wěn)定性和機(jī)械操作性等優(yōu)點(diǎn)。采用戊二醛作交聯(lián)劑，戊二醛分子兩端的兩個(gè)醛基可以分別與載體及配基上的氨基以五碳橋的形式交聯(lián)起來，這一反應(yīng)條件溫和，操作簡便，因而應(yīng)用廣泛。尼龍網(wǎng)是由酰胺鍵聯(lián)接起來的親水性載體，與肽鍵結(jié)構(gòu)非常相似，其價(jià)格低廉，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的可操作性。
[0009]2.效果好 :酶可以在較寬的pH、溫度及鹽濃度范圍內(nèi)處理低濃度或較高濃度的污染物，而微生物一般僅適用于處理較低濃度的污染物。
[0010]【具體實(shí)施方式】:
一種固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:具體方法如下:具體步驟如下:將固定化漆酶用于多環(huán)芳烴污染土壤進(jìn)行修復(fù)；土壤采用泥漿，水土比為3:1，溶液部分為HAc-NaAc緩沖液(pH=4)，污染物的初始濃度為100 μ g/ml ;固定化漆酶投入土壤中的量lg/50ml，溫度為20~40°C，pH值為4~6，時(shí)間為72 h。
[0011]同時(shí)以游離漆酶作為對照。考慮到固定化漆酶在環(huán)境中應(yīng)用時(shí)，可能會(huì)遇到的一些環(huán)境影響因子進(jìn)行研究。首先是不同的溫度，包括20°c (室溫)和40°C，此時(shí)pH為4;其次為不同的PH值，設(shè)定為4和6，溫度為40°C。實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行時(shí)間為72 h。
[0012]對上述漆酶進(jìn)行固定的第一種方法如下:
以尼龍網(wǎng)為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，先交聯(lián)后吸附的固定化方法；具體操作是:將尼龍網(wǎng)剪成0.5cm X0.5cnTl.5cm X 1.5cm大小的方塊，用含15~20%CaCl2和15~20 %水的甲醛溶液處理15~20min，洗凈后吸干，于5~8 mo I/L HCl中水解40~50 min，洗至pH中性，吸干；尼龍網(wǎng)在質(zhì)量比5~8%的戊二醛溶液中交聯(lián)6~8h后，加入30U漆酶溶液固定8~10h，用緩沖液清洗，得到固定化漆酶，此時(shí)酶回收率為55.56%。
[0013]對上述漆酶進(jìn)行固定的第二種方法如下:
以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行了漆酶的固定化；具體操作是:稱取一定量殼聚糖溶于體積比1~5 %冰醋酸，用2~5 mo I/L NaOH使殼聚糖沉淀，水洗至中性，抽濾脫水制成濕狀殼聚糖載體，然后稱取0.1~ 0.5 g殼聚糖與15~20mL體積濃度5 %戊二醛交聯(lián)S^lOh后，加入30.0 U酶室溫吸附固定12~15 h，用緩沖液清洗，得到固定化漆酶，酶回收率為52.24%下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例的限制。
[0014]實(shí)施例1，溫度對固定化漆酶降解效果的影響:
固定化漆酶經(jīng)過72h培養(yǎng)后，在兩種不同的溫度下對Pyr和BaP的降解效果都可達(dá)到80%和50%以上，自由漆酶的降解效果也比較理想，方法二的效果優(yōu)于方法一。同前面的固定化微生物的降解效果相比，都有了一定的提高，這初步說明，從降解率的角度來看，漆酶用于土壤的修復(fù)是可行的。
[0015]表1不同溫度下固定化漆酶的相關(guān)參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:具體步驟如下:將固定化漆酶用于多環(huán)芳烴污染土壤進(jìn)行修復(fù)；土壤采用泥漿，水土比為3:1，溶液部分為HAc-NaAc緩沖液(pH=4)，污染物的初始濃度為100 μ g/ml ;固定化漆酶投入土壤中的量lg/50ml，溫度為2(T40°C，pH值為4~6，時(shí)間為72 h。
2.按權(quán)利要求1所述的固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:對漆酶進(jìn)行固定的方法如下: 以尼龍網(wǎng)為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，先交聯(lián)后吸附的固定化方法；具體操作是:將尼龍網(wǎng)剪成0.5cm X0.5cnTl.5cm X 1.5cm大小的方塊，用含質(zhì)量比15~20%CaCl2和質(zhì)量比為15~20 %水的甲醛溶液處理15~20min，洗凈后吸干，于5~8 mo I/L HCl中水解40~50 min，洗至pH中性，吸干；尼龍網(wǎng)在質(zhì)量濃度為5~8%的戊二醛溶液中交聯(lián)6~8h后，加入30U漆酶溶液固定8~10h，用緩沖液清洗，得到固定化漆酶，此時(shí)酶回收率為55.56%。
3.按權(quán)利要求1所述的固定化漆酶對多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)方法，其特征在于:對漆酶進(jìn)行固定的方法如下: 以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行了漆酶的固定化；具體操作是:稱取一定量殼聚糖溶于體積比廣5 %冰醋酸，用2~5 mo I/L NaOH使殼聚糖沉淀，水洗至中性，抽濾脫水制成濕狀殼聚糖載體，然后稱取0.1-0.5g殼聚糖與15~20mL與體積濃度為5 %戊二醛交聯(lián)S^lOh后，加入30.0 U酶室溫吸附固定12~15 h，用緩沖液清洗，得到固定化漆酶，酶回收率為 52.24%。
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK103846276SQ201210495811
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月29日
【發(fā)明者】王新, 崔麗, 梁吉艷, 陸佳靚, 劉麗 申請人:沈陽工業(yè)大學(xué)