專利名稱：耐輻射奇球菌r1對孔雀石綠廢水進(jìn)行降解與脫色的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用耐輻射奇球菌Rl降解與脫色三甲苯烷類染料孔雀石綠的方法。
背景技術(shù)：
孔雀石綠屬于三甲苯烷類染料，為藍(lán)綠色有金屬閃光的結(jié)晶，呈弱堿性，易溶于水，廣泛用于真絲、羊毛、皮革、麻制品、陶瓷制品、棉布等的染色，并因其對魚體寄生蟲和魚卵中霉菌等殺滅效果非常顯著而在水產(chǎn)養(yǎng)殖上已被廣泛應(yīng)用。但已有研究表明孔雀石綠具有高殘留、高生物毒性和致癌、致畸、致突變等的毒副作用，可在魚體內(nèi)長時間殘留，并且在較低濃度時對哺乳動物細(xì)胞都是高毒性的，會威脅人體健康，造成潛在的環(huán)境危害。鑒于其生物毒性和致癌性，孔雀石綠在2002年已被全世界禁止使用，但一些地區(qū)的環(huán)境中仍存在孔雀石綠。因此，對孔雀石綠等三苯基甲烷類染料進(jìn)行脫色降解研究，對于治理染料污染仍具有重要的理論意義和實用價值。目前，對染料脫色降解主要是利用化學(xué)脫色劑的化學(xué)混凝法和利用活性污泥的生物脫色法。與化學(xué)方法相比，微生物處理方法是環(huán)境友好型的染料廢水處理方法。上世紀(jì)80年代開始，利用微生物對染料廢水進(jìn)行降解已逐漸發(fā)展成為實用的水處理技術(shù)。許多研究表明，微生物具有極高的降解有機(jī)染料的能力，目前分離到的對孔雀石綠具有脫色作用的微生物主要為真菌和細(xì)菌。但從實用性考慮，目前有關(guān)脫色菌的研究報道還存在有效率不高、降解產(chǎn)物及降解途徑·不明確等的問題。張麗芳等從土壤中分離、純化獲得一株真菌毛霉，在孔雀石綠濃度為50mg/L時具有較好的脫色能力。(張麗芳，孫玉鳳.真菌M2對染料脫色的研究.沈陽理工大學(xué)學(xué)報.2006，25 (6):83-87.)李妮等分離到一株無色桿菌屬的菌株，孔雀石綠初始濃度小于50 mg/L時有最佳脫色率，在最適條件下脫色8 h，孔雀石綠脫色率達(dá)到90%以上?？兹甘G在脫色過程中被降解，生成了其他代謝產(chǎn)物。(李妮等.一株無色桿菌屬菌株對孔雀石綠的脫色降解.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報.2009，15(4):529-533.)專利號為200710030875.6的中國發(fā)明專利公開了“黃金短桿菌AN3及其降解孔雀石綠的染料的應(yīng)用”，黃金短桿菌AN3對濃度為50 mg/L的孔雀石綠8h的去除率為61.4%，16h內(nèi)的去除率為97.3%，主要以去苯環(huán)脫毒的方式降解孔雀石綠。耐福射奇球菌Deinococcus radiodurans (DR)是一種紅色的、非流動性、不產(chǎn)生孢子的球形細(xì)菌。DR是地球最耐輻射的生物之一，是目前研究DNA損傷與修復(fù)較為理想的模式生物，故對DR的研究大多集中在輻射的損傷和修復(fù)方面。本發(fā)明以耐輻射奇球菌Rl為降解菌株，研究了不同條件下對孔雀石綠的脫色率，并對降解產(chǎn)物進(jìn)行了分析，同時對脫色降解后產(chǎn)物的毒性效應(yīng)進(jìn)行分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對已有脫色菌研究所存在效率不高、降解產(chǎn)物及降解途徑不明確等的缺陷，提供一種對孔雀石綠染料廢水脫色降解途徑明確、脫色降解效率高、產(chǎn)物毒性較降解前明顯降低的方法。本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn):
耐輻射奇球菌Rl對孔雀石綠廢水進(jìn)行降解與脫色的方法，該方法按以下步驟進(jìn)行:
(1)種子液的培養(yǎng):用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保存的耐福射奇球菌(Deinococcusradiodurans) Rl菌種轉(zhuǎn)接到50mL的種子培養(yǎng)基中，在30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下，培養(yǎng)16h得種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基的組分為:酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10g/L, pH 自然，121°C滅菌 20 min,冷卻；
(2)發(fā)酵液的培養(yǎng):取種子培養(yǎng)液20-40mL接種到400mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基組分同種子培養(yǎng)基，于30°C、轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng)16-20 h至發(fā)酵液濕菌體量為7.8-8.5g/L 時止；
(3)染料廢水脫色:在上述培養(yǎng)結(jié)束的發(fā)酵菌液中加入染料，使染料終濃度為50-500mg/L成為模擬染料廢水，調(diào)節(jié)pH5_9，放入搖床，轉(zhuǎn)速180r/min，25-55 °C，脫色0.5-3h ;脫色結(jié)束后混合液離心lOmin，轉(zhuǎn)速10000r/min，上清液即為最終脫色液。本發(fā)明的有益效果是:
一、提供了耐輻射奇球菌Rl的一種新的應(yīng)用領(lǐng)域，且擴(kuò)寬了降解染料的菌種范圍。二、耐輻射奇球菌Rl對孔雀石綠染料廢水的脫色效率高，在染料濃度100mg/L時，0.5h的脫色率達(dá)到99%以上，在染料濃度500mg/L時，2h的脫色率達(dá)到95%(見實施例3)。三、本發(fā)明對脫色降解產(chǎn)物做了分析，明確了本發(fā)明對孔雀石綠染料廢水的降解途徑為脫苯環(huán)，生成氨基苯酚類和二苯甲酮類物質(zhì)(圖3);經(jīng)發(fā)光菌急性毒性實驗表明降解產(chǎn)物的毒性比降解前明顯 降低(見試驗例2)。


圖1孔雀石綠脫色降解產(chǎn)物的氣相譜圖 其中，a為孔雀石綠；b，c為降解產(chǎn)物
圖2孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的氣相譜圖 其中，a為孔雀石綠 圖3孔雀石綠的降解途徑示意圖 其中，a為孔雀石綠；b，c為降解產(chǎn)物
具體實施例方式通過以下實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
對實施例所涉材料與方法的說明:
耐輻射奇球菌Rl:由浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所華躍進(jìn)教授贈送，該菌種已于2010年在《生物工程學(xué)報》第26卷10期1451 1455頁發(fā)表，文章名稱為“耐輻射奇球菌類胡蘿卜素C3’，4’ -脫氫酶底物特異性”；該菌種現(xiàn)已在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所食用菌實驗室繁殖并保存，公眾可自本專利申請日起20年內(nèi)向浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所食用菌實驗室獲?。?br> 孔雀石綠:分析純，含量> 98%，天津博迪化工股份有限公司生產(chǎn)；脫色率的計算方法:孔雀石綠的特征性吸收波峰為617nm，脫色率就是通過紫外-可見光掃描式分光光度儀測試在最大吸收波峰處峰值的降低情況來進(jìn)行計算的。上清液在617nm處測吸光度。脫色率的計算公式為:
脫色率(％ ) = IOO(A-B)/A 其中A是未經(jīng)脫色的617nm吸光度，B為脫色后的617nm吸光度。降解產(chǎn)物的測定方法:采用Agilent 7890C/5973N GC/MS分析測定，色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30mX0.32mm X0.25 μ m)。質(zhì)譜檢測器(MSD)采用EI電離源(70eV)，離子源溫度為230°C。載氣(He)流量為1.0mL/min,進(jìn)樣量I μ L，進(jìn)樣口溫度為250°C，采用不分流模式。色譜柱采用升溫程序。升溫程序如下:50°C保持lmin，然后以10°C /min的速率升溫到270°C，然后保持7min。產(chǎn)物的鑒定采用GC/MS中配備的Nist_08標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，匹配度大于90%。發(fā)光菌急性毒性實驗:根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法BG/T 1544-1995，采用發(fā)光菌為指示生物，對脫色液進(jìn)行15min急性毒性實驗，采用DXY-2型發(fā)光監(jiān)細(xì)菌監(jiān)測儀測定發(fā)光度，由下式計算發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度的相對抑制率(I%):1 % = ( 1-樣品發(fā)光度/對照發(fā)光度)X 100%
實施例1:
(1)種子液的培養(yǎng):用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保存的耐福射奇球菌(Deinococcusradiodurans) Rl菌種轉(zhuǎn)接到50mL的種子培養(yǎng)基中，在30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下，培養(yǎng)16h得種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基的組分為:酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10g/L, pH 自然，121°C滅 菌 20 min,冷卻；
(2)發(fā)酵液的培養(yǎng):取種子培養(yǎng)液40mL接種到400mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分、制備工藝同種子培養(yǎng)基， 于30°C、轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng)20 h，按上述條件得到的發(fā)酵液濕菌體量為8.5g/L ；
(3)染料廢水脫色:在上述培養(yǎng)結(jié)束的發(fā)酵菌液中加入孔雀石綠染料，使染料終濃度為200mg/L成為模擬染料廢水，pH6.8 (自然)，放入搖床，轉(zhuǎn)速180r/min，25_55°C，脫色0.5h ；
(4)脫色率的測定:將脫色液分別離心lOmin，轉(zhuǎn)速10000r/min,收集上清液，測定脫色率，結(jié)果在25至55°C不同的脫色溫度，在同樣脫色0.5h工藝條件下，取得了 88.0%至97.2%的不同脫色率，其中以45°C的最高，達(dá)到97.2%的脫色率(見表I )。表I不同脫色溫度對脫色率的影響
權(quán)利要求
1.耐輻射奇球菌Rl對孔雀石綠廢水進(jìn)行降解與脫色的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行: (1)種子液的培養(yǎng):用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保存的耐輻射奇球菌Rl菌種轉(zhuǎn)接到50mL的種子培養(yǎng)基中，在30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下，培養(yǎng)16h得種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基的組分為:酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10g/L, pH自然，121°C滅菌20 min，冷卻； (2)發(fā)酵液的培養(yǎng):取種子培養(yǎng)液20-40mL接種到400mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基組分同種子培養(yǎng)基，于30°C、轉(zhuǎn)速180r/min條件下培養(yǎng)16-20 h至發(fā)酵液濕菌體量為·7.8-8.5g/L 時止； (3)染料廢水脫色:在上述培養(yǎng)結(jié)束的發(fā)酵菌液中加入染料，使染料終濃度為·50-500mg/L成為模擬染料廢水，調(diào)節(jié)pH5_9，放入搖床，轉(zhuǎn)速180r/min，25-55 °C，脫色·0.5-3h ;脫色結(jié)束后混 合液離心lOmin，轉(zhuǎn)速10000r/min，上清液即為最終脫色液。
全文摘要
本發(fā)明公開了耐輻射奇球菌R1對孔雀石綠廢水進(jìn)行降解與脫色的方法，屬微生物環(huán)境應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。方法包括(1)種子液的培養(yǎng)；(2)發(fā)酵液的培養(yǎng)；(3)染料廢水脫色等步驟工藝。本發(fā)明提供了耐輻射奇球菌R1的一種新的應(yīng)用領(lǐng)域，其對孔雀石綠染料廢水的脫色效率高，染料濃度100mg/L時，0.5h的脫色率達(dá)到99％以上，染料濃度500mg/L時，2h的脫色率達(dá)到95%；并對脫色降解產(chǎn)物進(jìn)行分析明確了降解途徑，經(jīng)發(fā)光菌急性毒性實驗表明該降解產(chǎn)物的毒性比降解前明顯降低。本發(fā)明可在相關(guān)染色企業(yè)及研究機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。
文檔編號C02F3/34GK103112955SQ201310076549
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者呂國英, 程建徽, 陳曉旸, 張作法, 范雷法, 潘慧娟 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院