一種石油降解酶制劑的制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種石油降解酶制劑的制備方法與應用，制備步驟如下：將降解石油的微生物進行細胞破碎后制備粗酶液，然后粗酶液與載體混合吸附后，經(jīng)分離、干燥，制得石油降解酶制劑；所述的降解石油的微生物為醋酸鈣不動桿菌，菌種保藏號：CGMCC?No.3915，保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明還包括制得的石油降解酶制劑在石油降解中的應用。本發(fā)明通過將具有降解石油功能的微生物的酶體系通過吸附劑固定后，對受石油污染的土壤進行降解，降解效率顯著提高，較微生物降解速度提高30～50倍，穩(wěn)定性較粗酶液提高15～20倍。
【專利說明】一種石油降解酶制劑的制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種石油降解酶制劑的制備方法與應用，屬于環(huán)境生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]由于石油工業(yè)的迅速發(fā)展，石油泄漏造成的環(huán)境污染日益嚴重，其中對土壤的污染尤為嚴重，我國每年產(chǎn)生石油污染土壤近10萬噸，石油污染土地面積約500萬公頃。
[0003]目前石油污染土壤的修復方法主要有物化法、電化學法、生物法。物化及電化學法有成本高、修復后會改變土壤的營養(yǎng)結構而不再適宜農(nóng)作物種植的重大缺陷，而生物修復方法由于其操作簡單、費用低、效果好以及無二次污染等已經(jīng)成為石油污染治理經(jīng)濟有效的方法，也是現(xiàn)在石油污染土壤修復的主要方法。但生物修復法耗時長、修復速率較慢、而且用于污染修復的微生物受到溫度、鹽度、PH等環(huán)境因子的影響從而無法正常生長導致修復效果不佳。
[0004]酶制劑是指從生物中提取的具有酶特性的一類物質，最初應用與食品工業(yè)，主要作用是催化食品加工過程中各種化學反應，隨著酶制劑行業(yè)的發(fā)展，其應用領域遍及輕工、食品、化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及能源、環(huán)境保護等方面。但該技術往往只是單一酶催化某一底物的反應。雖然也有將復合酶提取后制成酶制劑來進行應用的技術，如在廢水處理、治理農(nóng)藥污染等方面的應用，但效果較應用微生物直接處理的效率并沒有顯著提高。如《撲草凈降解酶的固定化及其對受污染土壤的生物強化研究》，南開大學學報，2003年6月，第36卷第2期中所記載的，粗酶液及酶制劑在撲草凈降解效率方面與直接利用微生物進行降解的效率相比沒有顯著的提高，酶制劑的優(yōu)勢僅在于最佳降解條件的拓寬。
[0005]中國專利文獻CN101914470A (申請?zhí)枺?01010233473.8)公開了一株可降解石油的醋酸1丐不動桿菌（ Acinetobacter calcoaceticus) WG-6及其培養(yǎng)方法與應用，屬于微生物【技術領域】。該菌株2010年6月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC No. 3915。該發(fā)明還提供由該醋酸鈣不動桿菌及其他成分混合制備的高密度菌劑。但該菌劑降解石油時速率仍然較低，無法滿足石油污染快速處理的要求。
[0006]而石油降解酶制劑應用于石油污染的修復治理中的研究目前還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種利用醋酸鈣不動桿菌制備石油降解酶制劑的方法與應用，通過利用來源于微生物細胞內的特異性石油降解酶，提高對污染環(huán)境中石油的降解效率。
[0008]一種石油降解酶制劑的制備方法，步驟如下：將降解石油的微生物進行細胞破碎后制備粗酶液，然后粗酶液與載體混合吸附后，經(jīng)分離、干燥，制得石油降解酶制劑；
[0009]所述的降解石油的微生物為醋酸鈣不動桿菌，菌種保藏號：CGMCC No. 3915，保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0010]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的吸附劑為硅藻土。更優(yōu)的，所述的硅藻土為經(jīng)蒸餾水洗滌后烘干處理制得的硅藻土。
[0011]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述吸附劑與粗酶液混合的質量體積比為1:2~10，單位為：g/mL。
[0012]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，將降解石油的微生物進行細胞破碎后制備粗酶液的具體步驟為：降解石油的微生物發(fā)酵液離心，得菌體；用3~25倍體積的pH6. O的PBS緩沖液重懸菌體；然后進行超聲波破碎10~25min，超聲功率為200~500W ;然后在2~8°C條件下，經(jīng)6000~1000Orpm離心5~lOmin，取上清，制得粗酶液。經(jīng)檢測，粗酶液的蛋白濃度為2~20mg/ml。
[0013]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的吸附條件為在2~8°C條件下吸附5~12h。
[0014]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的干燥為真空冷凍干燥。
[0015]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的石油降解酶制劑中每克硅藻土固定的蛋白量為5~50mgo
[0016]上述石油降解酶制劑在石油降解中的應用。
[0017]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的應用步驟如下：
[0018](I)用pH8. OTris-HCl緩沖液配制NADH+NADPH混合溶液，NADH+NADPH的總質量濃度為1%，NADH與NADPH質量濃度之比為1:1;
[0019](2)向水體中添加石油凈含量質量分數(shù)為1/5~1/2的石油降解酶制劑，向水體中添加石油凈含量質量分數(shù)為1/200~1/1000的步驟（I)制得的NADH+NADPH混合溶液，震蕩或攪拌均勻，在15~40°C條件下降解2~5h，即可。
[0020]有益效果
[0021]I、本發(fā)明通過將具有降解石油功能的微生物的酶體系通過吸附劑固定后，對受石油污染的土壤進行降解，降解效率顯著提高，較微生物降解速度提高30~50倍，穩(wěn)定性較粗酶液提高15~20倍；
[0022]2、本發(fā)明共固定石油烴降解相關的多種酶，而且都能保持較高的活性，固定化后的酶制劑可以將石油徹底降解為CO2跟H2O,本發(fā)明將多種酶參與的酶系經(jīng)固定化后，可對污染物進行徹底、快速降解；
[0023]3、本發(fā)明制得的石油降解酶制劑可應用于被石油污染的水體、土壤修復過程中，具有成本低、效率高的特點，具有顯著的經(jīng)濟效益和社會效益。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
[0025]微生物來源
[0026]實施例I~5中的醋酸鈣不動桿菌(Actnetobacter calcoaceticus)的菌種保藏號=CGMCC No. 3915，保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所。
[0027]實施例I :粗酶液的制備
[0028]步驟如下：
[0029](I)將LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的醋酸鈣不動桿菌（Actnetobacter calcoaceticus)菌液1000Orpm冷凍離心lOmin，用濃度為O. IM的pH6. OPBS緩沖液沖洗3次，離心收集菌體；
[0030](2)用10倍體積的pH6. OPBS緩沖液重懸步驟（I)制得的菌體，震蕩攪勻，在超聲功率為500W、超聲\間隔時間為5s\5s條件下進行冰浴超聲破碎25min，然后在4°C、1000Orpm的條件下離心lOmin，棄沉淀，制得粗酶液；
[0031](3)上述所得的粗酶液用考馬斯亮藍法進行蛋白濃度測定，具體操作步驟為：準確吸取粗酶液O. ImL,然后加入5mL考馬斯亮藍G250試劑，充分震蕩混勻，放置5min后，于595nm測定吸光度(蒸餾水為空白對照，操作與樣品測定操作相同)。根據(jù)A595值，在標準曲線上查出相當于標準蛋白的量，求出樣品蛋白濃度。
[0032]經(jīng)檢測，制備的粗酶液蛋白濃度為4. 27mg/mL。
[0033]實施例2粗酶液的制備
[0034]如實施例I所述的步驟，不同之處在于，步驟（2)用20倍體積的pH6. O的PBS緩沖液重懸菌體，震蕩攪勻，在超聲功率為400W、超聲\間隔時間為5s\5s條件下進行冰浴超聲破碎25min,然后在4°C、1000Orpm的條件下離心20min,棄沉淀,制得粗酶液；
[0035]經(jīng)檢測，制備的粗酶液蛋白濃度為2. 25mg/mL。
[0036]實施例3石油降解酶制劑的制備及石油降解
[0037]步驟如下：
[0038](I)取市售硅藻土用蒸餾水洗3次，80°C烘干，自然冷卻至室溫，制得清洗后的硅藻土；
[0039](2)將制得的清洗后的硅藻土與實施例I中制備的粗酶液按1:10 (質量/體積，g/ml)的比例混合，4°C條件下間歇震蕩固定5h，離心，取沉淀，經(jīng)真空冷凍干燥制得石油降解酶制劑；在41：條件下保存?zhèn)溆茫?br> [0040](3)模擬石油降解酶制劑在水中降解石油實驗，操作步驟如下：
[0041]①于250mL錐形瓶中配制10g/L的石油溶液50mL,添加Ig石油降解酶制劑,攪勻，得酶混液；②用PH8. OTris-HCl緩沖液配制NADH+NADPH混合溶液，NADH+NADPH的總質量濃度為1%，NADH與NADPH質量濃度之比為1:1 ;③向酶混液中添加NADH-NADPH混合溶液10 μ L，于搖床中30°C、150rpm條件下反應5h 在室溫（25°C )條件下，錐形瓶中加入50mL二氯甲烷，震蕩萃取5min ;⑤取下層含石油的二氯甲烷溶液O. 5mL于50mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至50mL;⑥以二氯甲烷為空白對照，于230nm條件下測定樣品的吸收值，然后根據(jù)標準曲線計算出樣品中石油的含量。
[0042](4)經(jīng)檢測，石油降解酶制劑制備過程中酶活回收率為90%，制備的石油降解酶制劑對石油降解活性為：每克石油降解酶制劑每小時降解石油112mg。
[0043]實施例4石油降解酶制劑的制備及石油降解
[0044]如實施例3所述的步驟，不同之處在于，步驟（2)將制得的清洗后的硅藻土與實施例I中制備的粗酶液按1:20 (質量/體積，g/ml)的比例混合，置于4°C條件下間歇震蕩固定6h，離心，取沉淀，經(jīng)真空冷凍干燥制得石油降解酶制劑；
[0045]經(jīng)檢測，石油降解酶制劑制備過程中酶活回收率為41%，制備的石油降解酶制劑對石油降解活性為：每克石油降解酶制劑每小時降解石油166mg。
[0046]實施例5石油降解酶制劑的制備及石油降解[0047]如實施例3所述的步驟，不同之處在于，步驟（2)將制得的清洗后的硅藻土與實施例2中制備的粗酶液按1:20 (質量/體積）的比例混合，置于4°C條件下間歇震蕩固定6h，離心，取沉淀，經(jīng)真空冷凍干燥制得石油降解酶制劑；
[0048]經(jīng)檢測，石油降解酶制劑制備過程中酶活回收率為86%，制備的石油降解酶制劑對石油降解活性為：每克石油降解酶制劑每小時降解石油123mg。
[0049]對比例
[0050](I)醋酸鈣不動桿菌（Actnetobacter calcoaceticus) CGMCC No. 3915 菌液降解石油
[0051]向含40mL石油溶液(石油質量濃度為5g/L)的250mL錐形瓶中添加Iml醋酸鈣不動桿菌（Actnetobacter calcoaceticus)CGMCC No. 3915 菌液,菌液的菌體濃度 IO9 個/ml,30°C、150rpm條件下于搖床上進行石油降解。7d后按實施例3中所述方法測定剩余的石油含量。結果顯示，在此條件下石油降解率為24%，即降解速率為O. 284mg/h。
[0052](2)利用CGMCC No. 3915細胞制備的酶制劑降解石油
[0053]取醋酸鈣不動桿菌（Actnetobactercalcoaceticus)CGMCC No. 3915 菌液,菌液的菌體濃度IO9個/ml，按實施例2中所述方法制備粗酶液，然后按實施例3中所述方法制備石油降解酶制劑，根據(jù)粗酶液制備過程中菌體稀釋比例計算，取IO9個細胞制備的酶制劑，添加于含40mL石油溶液(石油質量濃度為10g/L)的250mL錐形瓶中，添加NADH-NADPH混合溶液?ο μ L,于搖床中3(TC、150rpm條件下反應5h。2h后按實施例3中所述方法測定剩余的石油含量。結果顯示，此條件下石油降解率為26%，即石油降解速率為26mg/h。
[0054]結果表明，與醋酸鈣不動桿菌（Actnetobactercalcoaceticus)CGMCC No. 3915 菌液直接降解石油相比， 石油降解酶制劑降解石油的速率提高了 91倍。
【權利要求】
1.一種石油降解酶制劑的制備方法，其特征在于，步驟如下：將降解石油的微生物進行細胞破碎后制備粗酶液，然后粗酶液與載體混合吸附后，經(jīng)分離、干燥，制得石油降解酶制劑； 所述的降解石油的微生物為醋酸鈣不動桿菌，菌種保藏號=CGMCC No. 3915，保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的吸附劑為硅藻土。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的硅藻土為經(jīng)蒸餾水洗滌后烘干處理制得的硅藻土。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述吸附劑與粗酶液混合的質量體積比為1:2~10,單位為：g/mL。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將降解石油的微生物進行細胞破碎后制備粗酶液的具體步驟為：降解石油的微生物發(fā)酵液離心，得菌體；用3~25倍體積的PH6. O的PBS緩沖液重懸菌體；然后進行超聲波破碎10~25min，超聲功率為200~500W ；然后在2~8°C條件下,經(jīng)6000~1000Orpm離心5~IOmin,取上清,制得粗酶液。
6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的吸附條件為在2~8°C條件下吸附5~12h。
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的干燥為真空冷凍干燥。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的石油降解酶制劑中每克硅藻土固定的蛋白量為5~50mg。
9.權利要求1制得的石油降解酶制劑在石油降解中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，步驟如下： (1)用pH8.OTris-HCl緩沖液配制NADH+NADPH混合溶液，NADH+NADPH的總質量濃度為1%，NADH與NADPH質量濃度之比為1:1; (2)向水體中添加石油凈含量質量分數(shù)為1/5~1/2的石油降解酶制劑，向水體中添加石油凈含量質量分數(shù)為1/200~1/1000的步驟（I)制得的NADH+NADPH混合溶液，震蕩或攪拌均勻，在15~40°C條件下降解2~5h，即可。
【文檔編號】C02F3/00GK103484447SQ201310456751
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權日:2013年9月29日
【發(fā)明者】王加寧, 張強, 高永超, 張聞, 郭書海, 陳貫虹 申請人:山東省科學院生物研究所