一株鮑曼不動(dòng)桿菌及其篩選方法和在降解偶氮染料剛果紅方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株鮑曼不動(dòng)桿菌及其篩選方法和在降解偶氮染料剛果紅方面的應(yīng)用。所述菌株命名為鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacterbaumannii）YNWH226，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.7922。本發(fā)明提供了一株新的鮑曼不動(dòng)桿菌并將其應(yīng)用于染料降解，該菌株尤其可對(duì)偶氮染料剛果紅進(jìn)行有效降解，對(duì)剛果紅廢水具有很好的脫色、礦化效果，實(shí)現(xiàn)了簡單的好氧條件下就可以將剛果紅徹底礦化，對(duì)染料污染的治理及好氧降解偶氮染料的研究具有重大意義。
【專利說明】一株鮑曼不動(dòng)桿菌及其篩選方法和在降解偶氮染料剛果紅方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程、環(huán)境工程【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一株鮑曼不動(dòng)桿菌及其篩選方法和在降解偶氮染料剛果紅方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]偶氮染料是一類含有I個(gè)或多個(gè)-N=N-功能團(tuán)的芳香類化合物，約占有機(jī)染料產(chǎn)品總量的80%。根據(jù)染料發(fā)色團(tuán)說，其發(fā)色基是偶氮雙鍵(-N =N-)，助色基是氨基、羥基、甲基和磺酸基等，當(dāng)光線射入后發(fā)生選擇性吸收而產(chǎn)生視覺所感受到的各種顏色。剛果紅是第一個(gè)人工合成的偶氮染料，從它的結(jié)構(gòu)式上可以看出，剛果紅是含有兩個(gè)偶氮雙鍵的活性染料，其水溶性好，但染色的過程中有大量的染料未附著在染色物上而以廢水形式排出，造成水體污染。
[0003]目前發(fā)現(xiàn)能降解偶氮染料的微生物主要有真菌、細(xì)菌和藻類三種。但研究與工程應(yīng)用的大量實(shí)踐表明，染料廢水的特殊性導(dǎo)致一般微生物無法或很難在這類廢水中生長繁殖和發(fā)揮降解作用。同時(shí)，目前發(fā)現(xiàn)的偶氮染料降解菌一般為厭氧降解菌，而國內(nèi)外學(xué)者的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明:厭氧微生物通過還原作用對(duì)染料廢水具有一定的脫色、降解效果，但處理出水中含有大量高毒性、強(qiáng)致癌性的中間產(chǎn)物，如芳香胺化合物等。而對(duì)于單一的好氧降解，目前報(bào)道的很少，同時(shí)從已報(bào)道的文獻(xiàn)可知，它們所產(chǎn)生的偶氮還原酶在結(jié)構(gòu)上差異較大。
[0004]同時(shí)目前尚無利用鮑曼不動(dòng)桿菌降解染料的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是填補(bǔ)現(xiàn)有染料降解微生物技術(shù)的空白，提供一株偶氮染料好氧降解菌。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述偶氮染料剛果紅好氧降解菌的篩選方法。
[0007]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述偶氮染料剛果紅好氧降解菌的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供一株偶氮染料好氧降解菌，命名為鮑曼不動(dòng)桿菌iAcinetobacterbaumannii) YWW 226，于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7922。
[0009]所述鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226鑒定特征如下:
細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征為球桿狀，無芽孢、無鞭毛，單個(gè)細(xì)胞大小為(fl.5i!m) X(1.5~2.5 ym)，菌落光滑，不透明，在含剛果紅的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上呈紅色；
生理生化特性為:革蘭氏陰性，西蒙氏檸檬酸鹽利用陽性，明膠液化陰性，葡萄糖利用陽性。能在以剛果紅為唯一碳源和能源，且好氧條件下生長。
[0010]本發(fā)明還提供了鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226的16S rRNA基因序列，如SEQ ID N0.1所不。該序列與鮑曼不動(dòng)桿菌baumannii)DSM 30007的16S rRNA基因序列高度同源，同源性為99%。
[0011]本發(fā)明同時(shí)提供該鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226的篩選方法，包括如下步驟:
51.取印染廢水處理廠好氧池的廢水置于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到初培養(yǎng)液；
52.取SI所述的初培養(yǎng)液置于含lg/L剛果紅的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)得培養(yǎng)液；
53.取S2所述的培養(yǎng)液置于含lg/L剛果紅的新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)得終培養(yǎng)液；
54.取S3所述的終培養(yǎng)液稀釋后均勻涂布于含lg/L剛果紅的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)；
55.從S4所述固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上挑取菌落分離純化即得單菌落。
[0012]所述的LB培養(yǎng)基配方為:
S2、S3所述的所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為:1.6g/L的K2HPO4,0.2g/L的KH2PO4 ()，
1.0g/L 的(NH4)2SO4j0.01g/L 的 FeSO4 ? 7H20 ,0.lg/L 的 NaCl ,0.02g/L 的 CaCl2 ? 6H20，
0.lg/L 的 MgSO4, pH7.0。
[0013]S4所述的固體無機(jī) 鹽培養(yǎng)基平板的組成配方為S3所述的所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基加A 16~20g/L的瓊脂。
[0014]本發(fā)明還提供了所述偶氮染料好氧降解菌在降解偶氮染料剛果紅方面的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選地，所述偶氮染料好氧降解菌應(yīng)用于含偶氮染料剛果紅廢水脫色、凈化處理方面。
[0016]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供了一株新的鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226，所述菌株可以很好地填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)偶氮染料降解生物技術(shù)的不足，是一株具有較高活力，對(duì)染料脫色能力極強(qiáng)的菌株。
[0017]本發(fā)明提供的鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226可以在23~37°C、pH5~9、好氧條件下，利用偶氮染料剛果紅作為唯一的碳源和能源生長繁殖，降解偶氮染料剛果紅，而且是以去除苯環(huán)脫毒的方式對(duì)其進(jìn)行降解，在純培養(yǎng)的條件下，2天內(nèi)能將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中100mg/L剛果紅幾乎完全脫色，且在寬PH和溫度范圍均能較好地降解染料，并且將降解后續(xù)產(chǎn)生的芳香胺類化合物礦化，TOC(總有機(jī)碳)去除率為93.72%，能夠進(jìn)一步徹底減少污染。同時(shí)對(duì)于500mg/L的剛果紅也有很好的耐受和去除效果。
[0018]本發(fā)明所述菌株的篩選培養(yǎng)方法簡單，生長速度快，不易變異，可應(yīng)用于作為研究鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)染料脫色的模式菌株，更重要的是，它真正實(shí)現(xiàn)了能在單一簡單的好氧條件下實(shí)現(xiàn)徹底礦化染料，大大簡化了染料脫色工藝，并豐富了染料脫色機(jī)制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1本發(fā)明的鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226對(duì)不同濃度剛果紅的降解情況圖。
[0020]圖2本發(fā)明的鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226在不同條件下對(duì)剛果紅的降解情況圖。
[0021]圖3鮑曼不動(dòng)桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，除非特別說明，本發(fā)明實(shí)施例采用的試劑為常規(guī)市購試劑，采用的設(shè)備和試驗(yàn)方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的設(shè)備和試驗(yàn)方法。
[0023]實(shí)施例1 鮑曼不動(dòng)桿菌 iAcinetobacter baumannii ) YNWH 226 的篩選
51.取IOmL東莞市某印染廢水處理廠好氧池的廢水于IOOmL的LB培養(yǎng)基中，在30°C，150rpm條件下培養(yǎng)16h，得到初培養(yǎng)液；
52.取出IOmL的SI所述的初培養(yǎng)液于IOOmL含lg/L剛果紅的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在300C，150rpm條件下培養(yǎng)兩天，得培養(yǎng)液；
53.再取出IOmL的S2所述的培養(yǎng)液于含lg/L剛果紅的新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C，150rpm下培養(yǎng)兩天，S63重復(fù)3次，得終培養(yǎng)液；
54.取IOmL的S3所述的終培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后均勻涂布于含lg/L剛果紅的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)；
55.從S4所述平板上挑取長勢最好的菌落，進(jìn)行分離純化，最終得到的單菌落。后續(xù)進(jìn)行經(jīng)菌體形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA鑒定分析。
[0024]該菌株最適生存條件為pH值7~9，生長溫度為23~37°C。
[0025]所述鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226鑒定特征如下:
細(xì)菌學(xué)形態(tài)特征為球桿狀，無芽孢、無鞭毛，單個(gè)細(xì)胞大小為(fl.5i!m) X(1.5~2.5 ym)，菌落光滑，不透明，在含剛果紅的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上呈紅色；
生理生化特性為:革蘭氏陰`性，西蒙氏檸檬酸鹽利用陽性，明膠液化陰性，葡萄糖利用陽性。能在以剛果紅為唯一碳源和能源，且好氧條件下生長。
[0026]本發(fā)明所述鮑曼不動(dòng)桿菌YNWH 226的16S rRNA基因序列，如SEQ ID N0.1所示。該序列與鮑曼不動(dòng)桿菌ter baumannii)DSM 30007的16S rRNA基因序列高度同源，同源性為99%。見附圖3所示鮑曼不動(dòng)桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0027]實(shí)施例2鮑曼不動(dòng)桿菌(oAacter baumannii ) YNWH 226在降解剛果紅中的應(yīng)用
1.將菌株YNWH 226在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)(對(duì)數(shù)生長后期)，取5mL接種至含偶氮染料剛果紅濃度分別為0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L的200mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30°C，150rpm，pH7.0下培養(yǎng)5天。期間每隔24h取5mL培養(yǎng)液于700g離心力作用下離心2min,取上清液。
[0028]2.將步驟I得到的上清液采用紫外可見分光光度計(jì)(普析TU-1901)在490nm處測定吸光度，并以不加菌的染料培養(yǎng)液為對(duì)照，計(jì)算染料的降解率。
[0029]結(jié)果如附圖1所示:菌株YNWH 226對(duì)100mg/L剛果紅的降解率為90.37%，濃度為20(T400mg/L剛果紅的去除率也能到達(dá)70%~80%，對(duì)于濃度為500mg/L的剛果紅去除率達(dá)到了 63.16%。
[0030]同時(shí)，若在37°C，180rpm，pH7.0的條件下，2天內(nèi)能完全脫色，TOC去除率為93.72%。
[0031]實(shí)施例3鮑曼不動(dòng)桿菌baumannii )YNWH 226在降解剛果紅中的應(yīng)用
將菌株YNWH 226在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)(對(duì)數(shù)生長后期)，取IOmL冰浴30min，在4°C,4000rpm的條件下離心5分鐘，棄去上清液，菌體用無菌水沖洗兩次，再分別接種到含偶氮染料剛果紅濃度為0.lg/L的200mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別按表1條件培養(yǎng)5天。期間每隔12h取5mL培養(yǎng)液于700g離心力作用下離心2min，取上清液。得到的上清液采用紫外可見分光光度計(jì)(普析TU-1901)在490nm處測定吸光度，并以不加菌及染料的培養(yǎng)液為對(duì)照，計(jì)算染料的降解率。結(jié)果如圖2所示。5天后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1:
【權(quán)利要求】
1.一株偶氮染料剛果紅好氧降解菌，為鮑曼不動(dòng)桿菌baumannii)YNWH 226，于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.7922。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述偶氮染料剛果紅好氧降解菌，其特征在于，所述鮑曼不動(dòng)桿菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述偶氮染料剛果紅好氧降解菌的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.取印染廢水處理廠好氧池的廢水置于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到初培養(yǎng)液； 52.取SI所述的初培養(yǎng)液置于含lg/L剛果紅的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)得培養(yǎng)液； 53.取S2所述的培養(yǎng)液置于含lg/L剛果紅的新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)得終培養(yǎng)液； 54.取S3所述的終培養(yǎng)液稀釋后均勻涂布于含lg/L剛果紅的固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)； 55.從S4所述固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上挑取菌落分離純化即得單菌落。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述篩選方法，其特征在于，所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為:1.6g/L的K2HPO4,0.2g/L 的 KH2PO4 ()，1.0g/L 的(NH4) 2S04，0.01g/L 的 FeSO4 *7H20，0.lg/L 的 NaCl,0.02g/L 的 CaCl2 ? 6H20 ,0.lg/L 的 MgSO4, pH7.0。
5.權(quán)利要求1所述偶氮染料剛果紅好氧降解菌在降解偶氮染料剛果紅方面的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于，所述偶氮染料好氧降解菌應(yīng)用于含偶氮染料剛果紅廢水脫色、凈化處理方面。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用條件為溫度23°C ^37 °C、?11值5~9、好氧條件。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述的溫度為30°C~37°C，pH值為7~9。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述的溫度為37°C，pH值為7。
【文檔編號(hào)】C02F101/38GK103756925SQ201310498166
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】寧尋安, 陽重陽, 王玉潔, 梁昕, 王靖宇, 陳國鑫, 林美卿, 李銳敬, 陳泓, 劉敬勇, 楊佐毅 申請(qǐng)人:廣東工業(yè)大學(xué)