一種華癸庫(kù)特氏菌及微生物菌劑和它們的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種同溫層芽胞桿菌，其保藏編號(hào)為CCTCC?NO.?M?2013508。本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，所述菌體包括保藏編號(hào)為CCTCC?NO.?M?2013508的同溫層芽胞桿菌，且所述菌體還包括枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌。本發(fā)明還提供了如上所述的同溫層芽胞桿菌和如上所述的微生物菌劑在鹽堿地改良中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了如上所述的同溫層芽胞桿菌和如上所述的微生物菌劑在增加植物耐旱性中的應(yīng)用。通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明可以更加有效地去除鹽堿，例如可以將土壤脫鹽率提高至55%以上。
【專利說(shuō)明】一種華癸庫(kù)特氏菌及微生物菌劑和它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種華癸庫(kù)特氏菌、一種微生物菌劑和它們的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]孔雀石綠(Malachite Green, MG, CAS號(hào)569-64-2)又稱堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠，常作為染料被用于制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)和細(xì)胞染色。由于具有抗菌殺蟲(chóng)作用，自1933年起孔雀石綠又被作為驅(qū)蟲(chóng)劑、殺菌劑、防腐劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。但近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠在魚(yú)體內(nèi)和環(huán)境中殘留時(shí)間長(zhǎng)，其化學(xué)官能團(tuán)一三苯甲烷被確證具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用。因此，孔雀石綠已經(jīng)在美國(guó)、日本、歐盟等許多國(guó)家和組織被明令禁止用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，但由于其價(jià)格低廉，抗菌殺菌效果顯著，在實(shí)際生產(chǎn)中仍被違規(guī)使用。對(duì)英國(guó)、荷蘭和中國(guó)市場(chǎng)上的水產(chǎn)品隨機(jī)抽樣，發(fā)現(xiàn)孔雀石綠仍舊存在殘留超標(biāo)的現(xiàn)象。目前，關(guān)于如何消除水源中的孔雀石綠污染已成為環(huán)境科學(xué)和公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。
[0003]孔雀石綠廢水處理的方法主要有吸附法、生物法和光催化法。其中以微生物降解為基礎(chǔ)的生物法是一種環(huán)境友好型處理方式，該方法關(guān)鍵在于獲得具有孔雀石綠降解功能的微生物菌株，但是，現(xiàn)有的微生物菌株降解孔雀石綠的效果仍然較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有的微生物菌株降解孔雀石綠的效果較差的缺陷，本發(fā)明提供了一種華癸庫(kù)特氏菌，該華癸庫(kù)特氏菌(Kurthia huakuii)的保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504。
[0005]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，所述菌體包括保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504的華癸庫(kù)特氏菌，且所述菌體還包括枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacillcus Iincheniformis)和解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0006]本發(fā)明還提供了如上所述的華癸庫(kù)特氏菌和如上所述的微生物菌劑在降解孔雀石綠中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，如上所述的華癸庫(kù)特氏菌還對(duì)磺隆類農(nóng)藥具有較強(qiáng)的降解作用，因此，本發(fā)明還提供了如上所述的華癸庫(kù)特氏菌和如上所述的微生物菌劑在降解磺隆類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0008]通過(guò)上述技術(shù)方案，本發(fā)明可以更加有效地降解孔雀石綠和磺隆類農(nóng)藥。
[0009]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
[0010]生物材料保藏
[0011]本發(fā)明的華癸庫(kù)特氏菌(Kurthia huakuii)是本發(fā)明的發(fā)明人從河北張家口土壤中分離的純培養(yǎng)物，其保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504，保藏日期為2013年10月24，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，分類命名為華癸庫(kù)特氏菌(Kurthia huakuii)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明提供了一種華癸庫(kù)特氏菌,該華癸庫(kù)特氏菌(Kurthia huakuii)的保藏編號(hào)為 CCTCC N0.M2013504。
[0014]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，所述菌體包括保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504的華癸庫(kù)特氏菌，且所述菌體還包括枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacillcus Iincheniformis)和解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0015]其中，所述微生物菌劑中含有的菌體的量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，每克所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)可以為2-20X 107CFU。
[0016]優(yōu)選地，以活菌體的數(shù)目計(jì)，相對(duì)于每份所述華癸庫(kù)特氏菌，所述枯草芽胞桿菌的含量為0.05-0.2份，所述地衣芽胞桿菌的含量為0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞桿菌的含量為0.01-0.05份。在該優(yōu)選情況下，所述微生物菌劑具有更加優(yōu)良的降解孔雀石綠的能力。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基的種類可以在很大范圍內(nèi)改變，可以為各種能夠用于培養(yǎng)華癸庫(kù)特氏菌、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌的培養(yǎng)基，例如，可以為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，用于菌種的保存；而發(fā)酵的培養(yǎng)基一般用于生產(chǎn)，這些培養(yǎng)基的種類也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。上述培養(yǎng)基能夠商購(gòu)得到或者根據(jù)“微生物培養(yǎng)基手冊(cè)”(Microbiology Culture MediaManual)的記載制備得到。例如，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3g,蛋白胨IOg,氯化鈉5g,瓊脂15-20g，蒸餾水1000mL，pH值7.0-7.2，121°C滅菌20min ;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15g，淀粉lg，豆餅粉25g，硫酸錳lg，磷酸二氫鉀1.5g，硫酸鎂0.5g，酵母膏0.2g,氯化鐵0.1g,碳酸鈣 0.lg, pH 值 7.0-7.2，115°C滅菌 15min。
[0018]其中，所述微生物菌劑的制備方法可以包括:將華癸庫(kù)特氏菌、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌分別接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中，可以在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中分別培養(yǎng)華癸庫(kù)特氏菌、枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌，并將分別培養(yǎng)得到的微生物按照比例混合。優(yōu)選情況下，通過(guò)在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)及培養(yǎng)后的混合，使得到的每克微生物菌劑的總活菌數(shù)為2-10X 107CFU。
[0019]根據(jù)本發(fā)明，所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的培養(yǎng)方法沒(méi)有特別的限制為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以先將枯草芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至菌密度0D_ 值為0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的生產(chǎn)培養(yǎng)基(葡萄糖5g，豆柏30g，蛋白胨2g，蒸餾水1000ml, ρΗ7.0-7.2)中接種2-5重量份的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的菌液，37°C培養(yǎng),直至枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的活菌數(shù)為2-20 X IO7個(gè)/克的培養(yǎng)基。
[0020]所述地衣芽孢桿菌(Bacillcus Iincheniformis)的培養(yǎng)方法沒(méi)有特別的限制為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，可以先將地衣芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的培養(yǎng)基(玉米漿0.45g，蛋白胨1.50g，豆餅粉浸汁為1:15，葡萄糖1.50g，pH值7.5)中接種2_5重量份的地衣芽抱桿菌(Bacillcus Iincheniformis)的菌液，37 °C培養(yǎng)，直至地衣芽抱桿菌(BacillcusIincheniformis)的活菌數(shù)為2-20X IO7個(gè)/克的培養(yǎng)基。
[0021]所述解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的培養(yǎng)方法沒(méi)有特別的限制，例如，可以先將解淀粉芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為
0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培養(yǎng)基(豆餅粉50g，蔗糖20g，硫酸銨5g，檸檬酸三鈉2.5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.05g，pH7.0-7.2)中接種2_5重量份的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌液,37°C培養(yǎng),直至解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的活菌數(shù)為 2-20X IO7 個(gè) / 克的培養(yǎng)基。
[0022]所述華癸庫(kù)特氏菌的培養(yǎng)方法沒(méi)有特別的限制，例如，可以先將華癸庫(kù)特氏菌在種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中培養(yǎng)至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培養(yǎng)基(葡萄糖15g，淀粉lg，豆餅粉25g，硫酸錳lg，磷酸二氫鉀1.5g，硫酸鎂0.5g，酵母膏0.2g，氯化鐵0.lg，碳酸鈣0.lg，pH7.0-7.2)中接種2_5重量份的華癸庫(kù)特氏菌的菌液，37°C培養(yǎng)，直至華癸庫(kù)特氏菌的活菌數(shù)為2-20X IO7個(gè)/克的培養(yǎng)基。
[0023]通過(guò)在各自獨(dú)立的培養(yǎng)體系中的培養(yǎng)及培養(yǎng)后按照比例的混合，所述混合的條件沒(méi)有特別的限制，優(yōu)選能夠使得到的微生物菌劑滿足以下條件:以活菌體的數(shù)目計(jì)，相對(duì)于每份所述華癸庫(kù)特氏菌，所述枯草芽胞桿菌的含量為0.05-0.2份，所述地衣芽胞桿菌的含量為0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞桿菌的含量為0.01-0.05份。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，所述枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacillcuslincheniformis)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌種可以通過(guò)商購(gòu)得到。例如，所述枯草芽胞桿菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC03221，所述地衣芽胞桿菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC02698，所述解淀粉芽胞桿菌購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物 菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC10166。
[0025]本發(fā)明還提供了如上所述的華癸庫(kù)特氏菌和如上所述的微生物菌劑在降解孔雀石綠中的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明還提供了如上所述的華癸庫(kù)特氏菌和如上所述的微生物菌劑在降解磺隆類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0027]其中，磺隆類農(nóng)藥包括唑批嘧磺隆Imazosulfuron、胺苯磺隆Ethametsulfuron-methyl、苯石黃隆 Tribenuron methyl、批P定石黃隆 Pyrazosulfuron-ethyl>批嘧橫隆Pyrazosulfuron-ethyl、節(jié)嘧橫隆、Bensulfuron-methyl、丙苯橫隆Propoxycarbazone-sodium、卩定嘧橫隆 Flazasulfuron、諷嘧橫隆 Rimsulfuron、氟胺橫隆Trif lusulfuron-methyl、三氟丙橫隆Prosulfuron、氟嘧橫隆Plifenate、氟酮橫隆Flucarbazone-sodium、環(huán)丙嘧橫隆Cyclosulfamuron、甲橫胺橫隆Mesosulfuron-methy1、甲橫隆 Metsulfuron methyl> 甲基碘橫隆 1dosulfuron-methyl-sodium、甲嘧橫隆Sulfometuron methyl、氯吡嘧石黃隆 Ha 1su I furon-methy 1、氯磺隆 Ch I or sulfur on、氯11密橫隆 Chlorimuron ethyl、咪唑橫隆 Imazosulfuron、醚苯橫隆 Triasulfuron、醚橫隆Cinosulfuron、噻橫隆噻吩橫隆 Thifensu I furon-methy 1、四唑嘧橫隆 Azimsulfuron、三氟唳橫隆 Trifloxysulfuron sodium、三氟甲橫隆 Tritosulfuron、酸胺橫隆 Foramsulfuron、酸11密橫隆Amidosulfuron、煙嘧橫隆Nicosulfuron、橫酸橫隆Sulfosulfuron、乙氧嘧橫隆Ethoxysulfuron、環(huán)氧嘧橫隆 Oxasulfuron 和氟唳嘧橫隆 Flupyrsulfuron-methyl sodium中的至少一種。
[0028]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明:
[0029]實(shí)施例1
[0030]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的華癸庫(kù)特氏菌及其性能。
[0031]將保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504的華癸庫(kù)特氏菌(Kurthia huakuii)接種到LB培養(yǎng)基(含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L)中，培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到菌液。
[0032]在LB培養(yǎng)基中加入孔雀石綠(購(gòu)自SIGMA公司)，加入量使得孔雀石綠的濃度為100mg/L，得到孔雀石綠清除測(cè)試培養(yǎng)基。
[0033]將3mL上述菌液加入150mL的孔雀石綠清除測(cè)試培養(yǎng)基中，于30°C，180轉(zhuǎn)每分下振蕩培養(yǎng)，每隔4h取樣按照《GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法》的規(guī)定測(cè)定發(fā)酵液中孔雀石綠的濃度。結(jié)果顯示，發(fā)酵液第0、4、8、
12、16、20、24 小時(shí)的孔雀石綠的濃度分別為 83mg/L、62mg/L、39mg/L、16mg/L、3mg/L、lmg/L。由此說(shuō)明，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504的華癸庫(kù)特氏菌能夠有效地降解孔雀石綠。
[0034]在LB培養(yǎng)基中加入芐嘧磺隆(購(gòu)自SIGMA公司)，加入量使得芐嘧磺隆的濃度為100mg/L,得到芐嘧磺隆清除測(cè)試培養(yǎng)基。。 [0035]將3mL上述菌液加入150mL的芐嘧磺隆清除測(cè)試培養(yǎng)基中，于30°C，180轉(zhuǎn)每分下振蕩培養(yǎng)，每隔4h取樣按照《DB21T1544-2007 土壤中芐嘧磺隆殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》的規(guī)定測(cè)定發(fā)酵液中芐嘧磺隆的濃度。結(jié)果顯示，發(fā)酵液第0、4、8、12、16、20、24小時(shí)的節(jié)P密磺隆的濃度分別為80mg/L、57mg/L、34mg/L、12mg/L、2mg/L、0.5mg/L。由此說(shuō)明，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504的華癸庫(kù)特氏菌能夠有效地降解芐嘧磺隆。
[0036]對(duì)比例I
[0037]將購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC06121 (另一編號(hào)為L(zhǎng)AM0618)的華癸庫(kù)特氏菌(Kurthia huakuii)接種到LB培養(yǎng)基(含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaC110g/L)中，培養(yǎng)至菌密度OD6c?值為0.6-0.8，得到菌液。
[0038]在LB培養(yǎng)基中加入孔雀石綠(購(gòu)自SIGMA公司)，加入量使得孔雀石綠的濃度為100mg/L，得到孔雀石綠清除測(cè)試培養(yǎng)基。
[0039]將3mL上述菌液加入150mL的孔雀石綠清除測(cè)試培養(yǎng)基中，于30°C，180轉(zhuǎn)每分下振蕩培養(yǎng)，每隔4h取樣按照《GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法》的規(guī)定測(cè)定發(fā)酵液中孔雀石綠的濃度。結(jié)果顯示，發(fā)酵液第O、
4、8、12、16、20、24 小時(shí)的孔雀石綠的濃度分別為 98mg/L、95mg/L、96mg/L、95mg/L、94mg/L、95mg/L。由此說(shuō)明，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC06121的華癸庫(kù)特氏菌無(wú)法有效地降解孔雀石綠。
[0040]在LB培養(yǎng)基中加入芐嘧磺隆(購(gòu)自SIGMA公司)，加入量使得芐嘧磺隆的濃度為100mg/L,得到芐嘧磺隆清除測(cè)試培養(yǎng)基。。
[0041]將3mL上述菌液加入150mL的芐嘧磺隆清除測(cè)試培養(yǎng)基中，于30°C，180轉(zhuǎn)每分下振蕩培養(yǎng)，每隔4h取樣按照《DB21T1544-2007 土壤中芐嘧磺隆殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》的規(guī)定測(cè)定發(fā)酵液中芐嘧磺隆的濃度。結(jié)果顯示，發(fā)酵液第0、4、8、12、16、20、24小時(shí)的節(jié)H密磺隆的濃度分別為99mg/L、98mg/L、98mg/L、97mg/L、98mg/L、97mg/L。由此說(shuō)明，購(gòu)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC06121的華癸庫(kù)特氏菌無(wú)法有效地降解芐嘧磺隆。
[0042]實(shí)施例2
[0043]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的微生物菌劑及其性能。
[0044](I)在100重量份的培養(yǎng)基(葡萄糖5g，豆柏30g，蛋白胨2g，蒸餾水1000ml，pH7.0-7.2)中接種5重量份的枯草芽胞桿菌菌液(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC03221，在如上相同LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到菌液)，37°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至枯草芽胞桿菌的活菌數(shù)為2 X IO7CFU/克的培養(yǎng)基。
[0045](2)在100重量份的培養(yǎng)基(玉米漿0.45g，蛋白胨1.50g，豆餅粉浸汁為1:15，葡萄糖1.50g, pH值7.5)中接種5重量份的地衣芽胞桿菌菌液(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC02698，在如上相同LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到菌液)，37°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至地衣芽胞桿菌的活菌數(shù)為2X IO7CFU/克的培養(yǎng)基。
[0046](3)在100重量份的培養(yǎng)基(豆餅粉50g，蔗糖20g，硫酸銨5g，檸檬酸三鈉2.5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.5g，硫酸亞鐵0.05g,pH7.0-7.2)接種4重量份的解淀粉芽胞桿菌菌液(購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC10166，在如上相同LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到菌液)，37°C培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至解淀粉芽胞桿菌的活菌數(shù)為2 X IO7CFU/克的培養(yǎng)基。
[0047](4)在100重量份的培養(yǎng)基(葡萄糖15g，淀粉lg，豆餅粉25g，硫酸錳lg，磷酸二氫鉀1.5g，硫酸鎂0.5g，酵母膏0.2g，氯化鐵0.lg，碳酸鈣0.lg，pH7.0-7.2)中接種5重量份的華癸庫(kù)特氏菌菌液(保藏編號(hào)為CCTCCN0.M2013504，在如上相同LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌密度0D_值為0.6-0.8，得到菌液)，37°C培`養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行取樣并通過(guò)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行觀察，直至華癸庫(kù)特氏菌的活菌數(shù)為2X IO7CFU/克的培養(yǎng)基。
[0048](5)將步驟(1)至(4)中分別得到的枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、華癸庫(kù)特氏菌按照比例進(jìn)行混合，混合比例使得到的微生物菌劑中，以活菌體的數(shù)目計(jì)，相對(duì)于每份所述華癸庫(kù)特氏菌，所述枯草芽胞桿菌的含量為0.1份，所述地衣芽胞桿菌的含量為0.1份，所述解淀粉芽胞桿菌的含量為0.03份，得到本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0049]實(shí)施例3
[0050]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的微生物菌劑及其性能。
[0051]按照實(shí)施例2的方法，將步驟(1)至(4)中分別得到的枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、華癸庫(kù)特氏菌按照比例進(jìn)行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌劑中，以活菌體的數(shù)目計(jì)，相對(duì)于每份所述華癸庫(kù)特氏菌，所述枯草芽胞桿菌的含量為0.2份，所述地衣芽胞桿菌的含量為0.5份，所述解淀粉芽胞桿菌的含量為0.05份，得到本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0052]實(shí)施例4
[0053]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的微生物菌劑及其性能。
[0054]按照實(shí)施例2的方法，將步驟(1)至(4)中分別得到的枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、華癸庫(kù)特氏菌按照比例進(jìn)行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌劑中，以活菌體的數(shù)目計(jì)，相對(duì)于每份所述華癸庫(kù)特氏菌，所述枯草芽胞桿菌的含量為0.2份,所述地衣芽胞桿菌的含量為0.05份,所述解淀粉芽胞桿菌的含量為0.01份,得到本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0055]實(shí)施例5
[0056]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的微生物菌劑及其性能。
[0057]按照實(shí)施例2的方法，將步驟(1)至(4)中分別得到的枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、華癸庫(kù)特氏菌按照比例進(jìn)行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌劑中，以活菌體的數(shù)目計(jì)，相對(duì)于每份所述華癸庫(kù)特氏菌，所述枯草芽胞桿菌的含量為2份,所述地衣芽胞桿菌的含量為5份,所述解淀粉芽胞桿菌的含量為1份，得到本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0058]實(shí)施例6
[0059]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的微生物菌劑及其性能。
[0060]按照實(shí)施例2的方法制備微生物菌劑，不同的是，將步驟(2)至(4)中分別得到的地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、華癸庫(kù)特氏菌按照比例進(jìn)行混合，但不加入枯草芽胞桿菌，得到本實(shí)施例的微生物菌劑。
[0061]對(duì)比例2
[0062]按照實(shí)施例2的方法制備微生物菌劑，不同的是，所用的華癸庫(kù)特氏菌為購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心且編號(hào)為ACCC06121的華癸庫(kù)特氏菌。
[0063]測(cè)試實(shí)施例1 [0064]本測(cè)試實(shí)施例通過(guò)土壤培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定實(shí)施例2-6和對(duì)比例2的微生物菌劑在降解孔雀石綠中的效果。
[0065]土壤培養(yǎng)使用的基質(zhì)土壤購(gòu)自北京花卉市場(chǎng)的花卉土，土壤有機(jī)質(zhì)含量10.24g/kg、全氮 0.561g/kg、全磷 1.14g/kg、全鉀 14.98g/kg、速效氮 39.19mg/kg、速效磷 16.26mg/kg、速效鉀160.07mg/kg、pH6.5。并且，在基質(zhì)土壤中添加孔雀石綠，使得孔雀石綠的含量為100mg/kg,得到實(shí)驗(yàn)土壤。土壤培養(yǎng)盆的試驗(yàn)盆高21cm、上直徑20cm、下直徑13cm,每盆加土 3.8kg，分別加入實(shí)施例2-6和對(duì)比例2的微生物菌劑0.05kg。
[0066]將土壤培養(yǎng)盆在20°C下培養(yǎng)，每隔7天取樣按照《GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法》的規(guī)定測(cè)定土壤中孔雀石綠的濃度結(jié)果如表1所示。
[0067]表1
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種華癸庫(kù)特氏菌，其特征在于:該華癸庫(kù)特氏菌(Kurthia huakuii)的保藏編號(hào)為 CCTCC N0.M2013504。
2.一種微生物菌劑，該微生物菌劑包含培養(yǎng)基和菌體，其特征在于:所述菌體包括保藏編號(hào)為CCTCC N0.M2013504的華癸庫(kù)特氏菌，且所述菌體還包括枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacillcus Iincheniformis)和解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于:每克所述微生物菌劑所含的總活菌數(shù)為 2-20X 107CFU。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:以活菌體的數(shù)目計(jì)，相對(duì)于每份所述華癸庫(kù)特氏菌，所述枯草芽胞桿菌的含量為0.05-0.2份，所述地衣芽胞桿菌的含量為0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞桿菌的含量為0.01-0.05份。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的至少一種。
6.權(quán)利要求1所述的華癸庫(kù)特氏菌和權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在降解孔雀石綠中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的華癸庫(kù)特氏菌和權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的微生物菌劑在降解磺隆類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:磺隆類農(nóng)藥包括唑吡嘧磺隆、胺苯磺隆、苯磺隆、吡啶磺隆、吡嘧磺隆、芐嘧磺隆、丙苯磺隆、啶嘧磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、三氟丙磺隆、氟嘧磺隆、氟酮磺隆、環(huán)丙嘧磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、甲基碘磺隆、甲嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、氯磺隆、氯嘧磺隆、咪唑磺隆、醚苯磺隆、醚磺隆、噻磺隆噻吩磺隆、四唑嘧磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、酰·胺磺隆、酰嘧磺隆、煙嘧磺隆、磺?；锹?、乙氧嘧磺隆、環(huán)氧嘧磺隆和氟啶嘧磺隆中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C02F101/38GK103820355SQ201310632005
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】阮志勇, 趙斌, 王彥偉, 宋金龍, 趙秉強(qiáng), 李燕婷, 孔德龍, 劉艷偉, 王慧敏, 陳小蓉, 劉小飛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所