一種不動桿菌及其菌劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種不動桿菌及其菌劑的制備方法。其技術(shù)方案是：所提供的不動桿菌（Acinetobactersp.）Y3于2013年9月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2013445。本發(fā)明提供的不動桿菌（Acinetobactersp.）Y3為異養(yǎng)硝化菌，是將不動桿菌（Acinetobactersp.）Y3接種到硝化培養(yǎng)基中發(fā)酵，通過發(fā)酵擴大培養(yǎng)得到，菌劑制備方法簡單，易于規(guī)模化生產(chǎn)。該菌能在較高濃度含酚工業(yè)廢水環(huán)境中順利進行硝化反應(yīng)，并以苯酚為碳源進行同時硝化和反硝化，將氨氮和有機氮轉(zhuǎn)化為氮氣，無亞硝酸鹽氮積累，實現(xiàn)廢水中的氨氮和苯酚的同時高效降解，在含酚工業(yè)廢水的生物脫氮處理中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種不動桿菌及其菌劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物脫氮【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種不動桿菌及其菌劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，為了提高廢水生物系統(tǒng)的處理能力，通過向系統(tǒng)中投加高效優(yōu)勢菌種或通過基因工程產(chǎn)生的工程菌，即所謂的高效菌技術(shù)(生物強化技術(shù))得到了迅速的發(fā)展，成為該領(lǐng)域的研究熱點。
[0003]在國外特別是發(fā)達國家，環(huán)境微生物菌劑更是受到人們的普遍關(guān)注和重視，已成為一種新的發(fā)展趨勢。丹麥的諾維信、美國Bioform公司所售的硝化菌均為復(fù)合菌劑，菌劑中含有大量的自養(yǎng)硝化菌，同時還含有一定數(shù)量的異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌。硝化菌劑目前已經(jīng)形成一定規(guī)模的產(chǎn)業(yè)，并已在發(fā)展中國家得到應(yīng)用。與自養(yǎng)硝化菌相比，異養(yǎng)硝化細菌對培養(yǎng)條件的要求比較寬松，許多異養(yǎng)硝化細菌在低溫以及高C/Ν條件下仍能夠較好地進行硝化作用，適用的溶解氧和PH值范圍也更為寬泛。異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌可以在同一反應(yīng)器中，同時進行硝化和反硝化，有效降低廢水的總氮。含有異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌的硝化菌劑，不僅可以提高富含有機成分廢水的硝化能力，同時還有較好的總氮脫除能力，從而為滿足更高環(huán)保要求的廢水排放標準提供菌劑保證。
[0004]目前文獻已報道了幾產(chǎn)喊菌(Alcaligenes /aecaJis)、假單胞菌{Pseudomonassiwizeri)、泛養(yǎng)硫球菌{Jhiosph3er3 pantotropha)具有較好的好氧反硝化能力，但對含酚廢水中氨氮的降解效率較低，致使難以在焦化、焦油加工等實際廢水處理中得到應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在解決普通異養(yǎng)硝化菌對含酚工業(yè)廢水中氨氮降解效率低的問題，目的是提供一種不動桿菌及其菌劑的制備方法，為焦化和焦油加工等實際廢水生物脫氮處理提供菌劑。
[0006]本發(fā)明所提供的不動桿菌sp.)Y3源于武鋼焦化公司廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥。該菌是以氨氮為氮源，以苯酚和丁二酸鈉為碳源和能源進行生長繁殖，利用硝化培養(yǎng)基進行馴化培養(yǎng)，并通過平板劃線分離純化得到。
[0007]其中，硝化培養(yǎng)基的成分是:丁二酸鈉為9.8g/L，磷酸氫二鈉為7.85g/L，磷酸二氫鉀為1.45g/L，硫酸鎂為0.2g/L，硫酸銨為1.0g/L，硫酸亞鐵為0.01g/L ;硝化培養(yǎng)基的pH值用lmol/L的氫氧化鈉調(diào)至9.0。培養(yǎng)基滅菌條件是:溫度為12廣126°C，時間為25min。
[0008]該菌為革蘭氏陰性，經(jīng)16S rDNA鑒定為不動桿菌Ucifle?ο如cter sp.)，編號為Y3。該菌于2013年9月25日保藏于中國典型微生物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCCN0:M2013445。該菌菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊。具有同時硝化和反硝化能力，能以苯酚作為碳源和能源進行生長繁殖。
[0009]該菌較優(yōu)的培養(yǎng)條件是:溫度為30°C，初始pH值為9.0，接種量為3 vol%,搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，碳氮質(zhì)量比(C: N)為12: I。
[0010]本發(fā)明還涉及所述不動桿菌(Acinetobacter sp.) Y3菌劑的制備方法:先向發(fā)酵罐裝入3/4體積的硝化培養(yǎng)基,用蒸汽在線滅菌；再將不動桿菌(Acinetobacter sp.) Y3接種到硝化培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵條件為:溫度為30°C，pH值為9.0，接種量為3vol%，轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量為0.5 (V/V.min)，發(fā)酵時間為24h，發(fā)酵過程中加入0.05 vol%的陶氏消泡劑。
[0011]由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下積極效果:
本發(fā)明提供的不動桿菌菌劑不但制備方法簡單，易于規(guī)?；a(chǎn)，而且降解效率高，環(huán)境適應(yīng)能力強。所提供的不動桿菌sp.) Y3為異養(yǎng)硝化菌,能在大量有機物存在的條件下順利進行硝化反應(yīng)，并能將硝化的產(chǎn)物同時進行反硝化，將氨氮和有機氮轉(zhuǎn)化為氮氣，無亞硝酸鹽氮積累。特別突出的優(yōu)勢是，該菌能耐受酚濃度高達1000mg/L的工業(yè)廢水環(huán)境，并以苯酚作為碳源進行同時硝化和反硝化，實現(xiàn)廢水中的氨氮和苯酚的同時高效降解，在含酚工業(yè)廢水的生物脫氮處理中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明的不動桿菌difleioAacier sp.) Y3的菌落圖；
圖2為本發(fā)明的不動桿菌sp.) Y3的革蘭氏染色效果圖；
圖3為本發(fā)明的不動桿菌(Acinetobacter sp.) Y3的生長特性曲線圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步描述，并非對其保護范圍的限制。
[0014]實施例1、菌株的分離純化
(I)菌株來源
菌源采自武鋼焦化公司廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥。
[0015](2)菌株的分離純化
將采集到的活性污泥混勻，取2mL接種于IOOmL已滅菌的LB培養(yǎng)基中，所述LB培養(yǎng)基的成分是:蛋白胨為lwt%，氯化鈉為I wt%，酵母提取物為0.5 wt% ;再置于溫度為30°C和150r/min的恒溫搖床培養(yǎng)15h ;然后取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至已滅菌的硝化培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)接4次，轉(zhuǎn)接過程中逐漸增大硫酸銨的濃度，濃度依次為:300mg/L，600mg/L，900mg/L，1200mg/L0馴化期間，同時向硝化培養(yǎng)基中加入苯酚使得其最終濃度為500mg/L。馴化結(jié)束后，將菌液做梯度稀釋(10_卜10_8)，涂布于固體的硝化培養(yǎng)基上，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，然后挑取單菌落，平板劃線(重復(fù)2~3次)，得到純化后的菌株，將每株菌試管斜面保存。最后進行硝化性能、反硝化性能及苯酚降解性能的測定，挑選綜合性能最優(yōu)的菌株Y3斜面保種，并保藏于中國典型微生物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC NO:M2013445。
[0016]實施例2、菌株的鑒定 (O菌株的形態(tài)學(xué)觀察
將菌株Y3培養(yǎng)液梯度稀釋后，均勻涂布于固體硝化培養(yǎng)基上面，置于30°c恒溫箱培養(yǎng)22h，進行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，該菌菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊。挑取菌落少許，經(jīng)革蘭氏染色之后，在光學(xué)顯微鏡的油鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示，能夠清楚看到保藏編號為CCTCC NO:M2013445的菌株單個菌為短桿狀，呈紅色，為革蘭氏陰性菌。
[0017](2)菌株的 16S rDNA 鑒定
用DNA提取試劑盒提取菌株Y3的基因組DNA，然后進行16S rDNA基因克隆、測序，其16SrDNA序列見序列表。之后在GenBank中進行Blast比對，結(jié)果顯示，與其序列相似度達到99%的均為JcifleioAacier sp。結(jié)合菌株Y3的特性，將其歸屬為不動桿菌sp)。
[0018]實施例3、不動桿菌difleioAacier sp.) Y3菌劑的制備
配制3L的硝化培養(yǎng)基，加入到5L的發(fā)酵罐中，并加入1.5mL的陶氏消泡劑，然后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121°C下濕熱滅菌25min，待滅菌的培養(yǎng)基冷卻后，將不動桿菌
{Acinetobacter sp.) Y3 以 3vol% 的量接種到硝化培養(yǎng)基，在 30°C > 150r/min 和 0.5(V/V.min)通氣量的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，24h后停止發(fā)酵，并加入25vol%的甘油作為保護劑后，進行低溫保藏。
[0019]實施例4、不動桿菌sp.) Y3的生長及其對氨氮和苯酹的降解 將不動桿菌{Acinetobacter sp.) Y3菌株接種于無菌、含氨氮為212mg/L和苯酹
為200mg/L的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，在30°C和150r/min的條件下培養(yǎng)，測定菌體的菌密度(0D_)、氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮和苯酚的濃度，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明:初始濃度為212mg/L的氨氮經(jīng)過24h被完全降解，期間并未檢測到亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，菌體的生長與氨氮的降解趨勢基本同步，苯酚經(jīng)過20h被完全降解，該菌株對氨氮和苯酚具有很好的降解效果，并展現(xiàn)出良好的同時硝化和反硝化能力。
[0020]上述【具體實施方式】為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的。
【權(quán)利要求】
1.一種不動桿菌，其特征在于該不動桿菌sp.)的編號為Y3,保藏于中國典型微生物保藏中心，保藏日期為2013年9月25日，保藏編號為CCTCC N0:M2013445。
2.如權(quán)利I所述不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于將所述不動桿菌{Acinetobacter sp.)Y3接種到硝化培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵條件是:溫度為30°C，pH值為9.0，接種量為3vol%，轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量為0.5 (V/V.π?η)，發(fā)酵時間為24h，發(fā)酵過程中加入0.05 vol%的陶氏消泡劑。
3.如權(quán)利2所述不動桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的硝化培養(yǎng)基的成分是:丁二酸鈉為9.8g/L,磷酸氫二鈉為7.85g/L,磷酸二氫鉀為1.45g/L,硫酸鎂為0.2g/L,硫酸銨為1.0 g/L，硫酸亞鐵為0.01g/L ;硝化培養(yǎng)基的pH值用lmol/L的氫氧化鈉調(diào)至9.0。
【文檔編號】C02F101/38GK103756947SQ201410052917
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】顏家保, 許龍龍, 楊洋, 余永登, 張 浩, 武文麗, 陳佩, 陳冬冬 申請人:武漢科技大學(xué)