一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途。本發(fā)明二氯喹啉酸高效降解菌代號(hào)為MC-05，經(jīng)鑒定為假單胞菌Pseudomonassp.，于2013年11月19日在中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為：CGMCCNo.8486；該菌可用于二氯喹啉酸污染土壤及水域的治理，有良好的降解效果。該菌在二氯喹啉酸污染的土壤和水域中有良好的定植能力，能充分的降解土壤和水中殘留的二氯喹啉酸，而且不會(huì)產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)原有生態(tài)環(huán)境中的微生物無(wú)不良影響。
【專利說(shuō)明】一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株假單胞菌(Pseudomonas sp.)MC_05,及其在微生物降解二氯喹啉酸農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]二氯喹啉酸是德國(guó)巴斯夫公司1984年開(kāi)始推廣的一種激素型喹啉酸類除草劑，ISO通用名稱=Quincloracjv^s =CltlH5C12NO2，化學(xué)名稱:3，7-二氯喹琳-8-羧酸，其常見(jiàn)的商品名有:神鋤(I代、2代)、快殺稗、殺稗靈、稗草凈、克稗星和稗草王等。二氯喹琳酸對(duì)光、溫等外界條件穩(wěn)定，土壤中二氯喹啉酸的消失與土壤濕度呈線性關(guān)系。在田間自然狀態(tài)下二氯喹啉降解緩慢，主要依靠土壤中的微生物和有關(guān)的降解酶類，李晶新等人的研究表明稻田按推薦施用量下，偏酸性土壤，經(jīng)過(guò)269d后才對(duì)煙草葉寬的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，經(jīng)過(guò)342d后，才消除到對(duì)煙草根生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響的范圍。由于南方很多都是稻-煙輪作田塊，許多稻田施用二氯喹啉酸防治稗草等多種雜草，下茬又緊接著種植煙草，由于其半衰期較長(zhǎng)，其在土壤中的殘留給煙草的生長(zhǎng)帶來(lái)嚴(yán)重影響。但目前對(duì)于二氯喹啉酸土壤污染問(wèn)題，并沒(méi)有很有效的治理和解決措施，只能通過(guò)活性炭等具有吸附活性的物質(zhì)來(lái)吸附土壤中殘留的二氯喹啉酸；或者在出現(xiàn)藥害后使用蕓苔素內(nèi)酯等一些生物調(diào)節(jié)劑來(lái)緩解煙株的受害癥狀；這些方法都不能從根本上解決二氯喹啉酸的污染為題，而且還容易造成二次污染。所以探尋二氯喹啉酸污染新的高效治理方法顯得十分迫切和重要。
[0003]微生物降解技術(shù)具有去除效率高、處理費(fèi)用低、能從根本上解決二氯喹啉酸污染問(wèn)題，且不會(huì)產(chǎn)生二次污染問(wèn)題。但采用微生物降解技術(shù)的關(guān)鍵之一便是獲得二氯喹啉酸的高效降解菌株。目前， 國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)二氯喹啉酸微生物降解進(jìn)行了大量的研究，但是由于二氯喹啉酸含有喹啉環(huán)，較穩(wěn)定不易降解，且在土壤中含量較低，迄今為止分離到的降解菌還比較有限，主要包括蒼白桿菌屬(認(rèn)AroAacir應(yīng)sp.)、Burkholderia cepecia.、Alcaligenes sp., Bordetella sp., Pantoea sp., Bordetella sp.等，這些分離到的菌株對(duì)低濃度下的二氯喹啉酸降解效果還有待于進(jìn)一步提高。大量的研究表明從環(huán)境中分離篩選高效二氯喹啉酸降解菌，是從根本上解決二氯喹啉酸污染的重要舉措。且目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有關(guān)煙草節(jié)桿菌屬降解二氯喹啉酸的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是提供一株高效、定植能力強(qiáng)的具有二氯喹啉酸降解能力的假單胞菌及其用途。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一株二氯喹啉酸降解菌假單胞菌(Pseudomonas sp.) MC-05,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:中國(guó)，北京，朝陽(yáng)區(qū)北辰路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào):CGMCC N0.8486，保藏日期:2013 年 11 月 19 日。
[0006]所述二氯喹啉酸降解菌MC-05菌落特征如下:菌落呈淡黃色，圓形，凸起，邊緣不整齊，表面光滑；透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為桿狀，兩端均生有數(shù)根極鞭毛；革蘭氏染色陰性，氧化酶甲基紅試驗(yàn)均呈陰性，淀粉水解和吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，能利用葡萄糖和乳糖。
[0007]本發(fā)明的一個(gè)方面，二氯喹啉酸降解菌假單胞菌菌MC-05在降解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)方面，二氯喹啉酸降解菌假單胞菌菌MC-05在治理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)方面，一種包含二氯喹啉酸降解菌假單胞菌MC-05的菌劑，所述菌劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知任何技術(shù)手段制備任何形式的菌劑，例如通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行凍干獲得的干菌劑，也可以是液體形式的濃縮液態(tài)菌劑。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)方面，所述包含二氯喹啉酸降解菌假單胞菌MC-05菌劑在降解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的一個(gè)方面，所述包含二氯喹啉酸降解菌假單胞菌MC-05菌劑在治理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。
[0012]所述降解在25_35°C、pH 6-8下進(jìn)行。
[0013]優(yōu)選的，所述降解在33 °C、pH=7下進(jìn)行。
[0014]本發(fā)明中的假單胞菌菌MC-05是一種常見(jiàn)的假單胞菌，經(jīng)檢索專利和其他相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)能夠降解二氯喹啉酸的假單胞菌屬菌種，且該菌種能夠在低濃度下對(duì)二氯喹啉酸進(jìn)行降解，并在 土壤中有良好的定植能力。
[0015]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1為本發(fā)明中假單胞菌MC-05的透射電鏡照片。
[0016]圖2為CK測(cè)定結(jié)果圖。
[0017]圖3為本發(fā)明中假單胞菌MC-05的二氯喹啉酸降解效果對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0019]實(shí)施例1:假單胞菌菌MC-05的分離、純化及保存。
[0020]所述降解菌經(jīng)馴化培養(yǎng)和篩選純化分離得來(lái)，具體步驟如下:
馴化培養(yǎng):將常年施用二氯喹啉酸的稻田土樣5g加入到100mg/L的二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于28°C、150r/min搖床上振蕩培養(yǎng)7d ;然后以5%的接種量，轉(zhuǎn)接到新的二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，二氯喹啉酸的濃度按100mg/L的梯度增加，轉(zhuǎn)接4次至二氯喹啉酸濃度達(dá)到500mg/L。
[0021]所述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為:每升無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含硝酸銨4g，磷酸二氫鉀1.5g，磷酸氫二鉀0.5g，三氯化鐵0.01g,氯化鈣0.01g,微量元素母液(EDTA- 二鈉0.01g/L,氯化錳39mg/L,硫酸鋅 43mg/L,鑰酸鈉 36mg/L) 10mL。
[0022]將最后一次的馴化培養(yǎng)液按濃度梯度稀釋至10_9，分別于100mg/L的二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上涂板，于34°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3d，挑取長(zhǎng)勢(shì)旺盛的菌落于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大、純化培養(yǎng)。
[0023]將純化得到的菌體一份接種于LB斜面培養(yǎng)基中，4°C保存；同時(shí)于甘油中保存于-20°C下。
[0024]實(shí)施例2:假單胞菌菌MC-05的鑒定。
[0025]通過(guò)16S rDNA序列分析和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，確定菌株MC-05為假單胞菌。具體步驟如下:
采用DNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司)提取和純化菌株的DNA，4°C保存。選用細(xì)菌的16s通用引物由華大基因公司合成:
上游引物為 5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ ；
下游引物為 5’ -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0026]擴(kuò)增反應(yīng)體系:IOXBuffer(Mg2+) 2 μ L, dNTPs2 μ L,引物各 I μ L，菌體 DNA I μ L,Taq DNA聚合酶0.5 μ L，加去離子水至20 μ L。
[0027]PCR反應(yīng)程序設(shè)定為:94° C預(yù)變性4min ;然后94° C變性lmin，55° C退火Imin, 72° C延伸1.5min，循環(huán)35個(gè)周期；然后72° C延伸IOmin ;最后4° C保持lOmin。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(華大基因公司)。
[0028]測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其屬于Aewt/offlmas 577.。圖1為MC-05菌的電鏡照片。
[0029]基于測(cè)序結(jié)果和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，確定MC-05屬于sp.。因此,將該菌命名為sp.MC-05,保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101)，保藏日期為2013年11月19日，保藏編號(hào)為CGMCCN0.8486。
[0030]實(shí)施例3:降解菌MC-05的降解效果鑒定。
[0031]將MC-05菌接種于液體LB中于35°C、180r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。將5ml培養(yǎng)液于10000r/min離心2min,棄去上清液后用等體積的0.01PBS緩沖液重懸菌體后接種于50mg/L 二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C、150r/min，培養(yǎng)7d后用液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)菌體的降解率。降解試驗(yàn)設(shè)對(duì)照，三個(gè)重復(fù)。
[0032]液相色譜檢測(cè)條件:色譜柱:WatersSun FireTM_C18, 5.0 μ m, 4.6 mm X 250 mm。流動(dòng)相:甲醇/0.01%磷酸水溶液(3:1，V/V)，流速0.6 mL/min進(jìn)樣量10 yL，柱溫30 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。
[0033]相對(duì)降解率=(CK含量-降解菌降解后含量)/CK含量*100%
由上述公式計(jì)算出二氯喹啉酸降解菌MC-05的降解率為91.38%。
[0034]實(shí)施例4:外界環(huán)境因素對(duì)降解菌降解效果的影響。
[0035]二氯喹啉酸初始濃度對(duì)降解菌MC-05降解率的影響:分別配制10ppm、20ppm、40ppm、50ppm的二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基各100ml于三角瓶中滅菌待用。分別向上述二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽中接種5%的活化好的MC-05菌懸液，于30°C、150r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)7d后，測(cè)定各處理的降解效率。
[0036]培養(yǎng)溫度對(duì)降解菌MC-05降解率的影響:向滅好菌的50ppm 二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種5%活化好的MC-05PBS菌懸液，分別于20°C、25°C、30°C、35°C、4(rC下培養(yǎng)7d，測(cè)定各處理的降解率。
[0037]培養(yǎng)基pH對(duì)降解菌MC-05降解率的影響:分別配置ρΗ=6、6.5、7、7.5、8的50ppm二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，接種5%的MC-05的PBS菌懸液，于30°C、150r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)7d，測(cè)定各處理的降解效果。
[0038]培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解菌MC-05降解效果的影響:向50ppm、pH=7的二氯喹啉酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種5%的MC-05PBS菌懸液，于30°C、150r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)7d，每個(gè)24小時(shí)
取一次樣，測(cè)定二氯喹啉酸含量。
[0039]結(jié)果顯示，二氯喹啉酸降解菌MC-05的最佳降解條件為:33° C、pH值7。二氯喹啉酸初始質(zhì)量濃度在10ppm-50ppm都有較好的降解效果，降解率可達(dá)90%以上。培養(yǎng)到第6天時(shí)，降解菌對(duì)二氯喹啉磷酸的降解已較充分。
[0040]實(shí)施例5:二氯喹啉酸降解菌MC-05在土壤中的定植效果及對(duì)二氯喹啉酸污染土壤的修復(fù)能力評(píng)估。
[0041]以噴霧的方式配置25mg/kg的二氯喹啉酸毒土，將降解菌MC-05培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取5ml菌液離心后去掉LB，以20mlPBS緩沖液重懸菌體，接種到配置好的二氯喹啉酸毒土中，于35°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，測(cè)定土壤中二氯喹啉酸的含量。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)和對(duì)照。
[0042]土壤樣品中二氯喹啉酸含量測(cè)定方法:準(zhǔn)確稱取20.0 g 土壤樣品，置于磨口三角瓶中，加60 mL甲醇/0.01%磷酸水溶液(3:1，V/V)，回旋式振蕩器提取I h后，將提取液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4000 r/min離心5 min,濾紙過(guò)濾,取上清液30 mL,過(guò)0.22μπι濾膜，用于測(cè)定。測(cè)定條件同實(shí)施例3。
[0043]降解菌MC-05在30°C下7d的降解效果可達(dá)79.6%，在土壤中有較好的定植效果。
[0044]雖然，上文 中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.二氯喹啉酸高效降解菌MC-05，其特征在于:經(jīng)鑒定為假單胞菌，能夠高效的降解土壤和水中殘留的二氯喹啉酸，菌種保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8486，2013年11月19日在中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏。
2.如權(quán)利要求1所述的二氯喹啉酸高效降解菌MC-05，其特征在于:所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-05菌落特征如下:在LB培養(yǎng)基上呈淡黃色，圓形，凸起，邊緣不整齊，表面光滑；透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為桿狀，兩端均生有數(shù)根極鞭毛；革蘭氏染色陰性，氧化酶甲基紅試驗(yàn)均呈陰性，淀粉水解和吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，能利用葡萄糖和乳糖。
3.如權(quán)利要求1所述的降解菌在降解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的降解菌在治理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求3或4所述降解菌MC-05，其特征在于:在低濃度下也能充分降解土壤或水體中殘留的二氯喹啉酸，降解菌的降解作用在25-35°C、pH 6-8下進(jìn)行。
6.一種包含權(quán)利要求1所述降解菌的菌劑。
7.如權(quán)利要求6所述降解菌劑在降解二氯喹啉酸中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求6所述降解菌劑在治理二氯喹啉酸污染土壤中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求7或8所述降解菌劑，其特征在于:易于保存和運(yùn)輸，能夠有效地降解土壤和水體中殘留的二氯 喹啉酸，降解菌劑的降解作用在25-35°C、pH 6-8下進(jìn)行，最佳降解條件為 33°C、pH=7。
【文檔編號(hào)】C02F3/34GK103820372SQ201410095929
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】陳德鑫, 張順, 雷強(qiáng), 曹君正, 戰(zhàn)徊旭, 侯婉瑩 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所, 中國(guó)煙草總公司四川省公司