中間蒼白桿菌及微生物菌劑和它們的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種中間蒼白桿菌，其保藏編號為CGMCC?NO.8839。本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養(yǎng)基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC?NO.8839的中間蒼白桿菌。本發(fā)明還提供了如上所述的中間蒼白桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解煙堿類農(nóng)藥中的應(yīng)用。通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明可以更加有效地降低土壤中煙堿類農(nóng)藥的殘留量。
【專利說明】中間蒼白桿菌及微生物菌劑和它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種中間蒼白桿菌、一種微生物菌劑和它們的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙堿類殺蟲劑是乙酰膽堿酶受體抑制劑，作用于昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，高效、有選擇性、對哺乳動物安全，且與多數(shù)傳統(tǒng)的農(nóng)藥之間不存在交互抗性。其中，具有殺蟲活性的煙堿類化合物最早由殼牌公司發(fā)現(xiàn)，隨后對該結(jié)構(gòu)進行了不斷的優(yōu)化并得到了具有高殺蟲活性的噻蟲醛，其后該類化合物受到了廣泛的開發(fā)和研究。目前已經(jīng)商品化的煙堿類殺蟲劑包括吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺。
[0003]煙堿類農(nóng)藥的產(chǎn)量占到了全球農(nóng)藥產(chǎn)量的15-20%。煙堿類農(nóng)藥的大量使用，對土壤和地下水造成了一 定的污染。因此，降解煙堿類農(nóng)藥是急需實施的環(huán)保措施。
[0004]應(yīng)用微生物降解法來降解煙堿類農(nóng)藥，具有環(huán)境友好的優(yōu)勢，但是，目前，現(xiàn)有的微生物菌株降解煙堿類農(nóng)藥的效果仍然較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明人分離了一株中間蒼白桿菌，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)異的降解煙堿類農(nóng)藥的效果，由此得到了本發(fā)明。為了克服煙堿類農(nóng)藥降解能力較低的缺陷，本發(fā)明提供了一種中間蒼白桿菌，該中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)的保藏編號為CGMCC N0.8839。
[0006]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑,該微生物菌劑含有菌體和培養(yǎng)基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌。
[0007]本發(fā)明還提供了如上所述的中間蒼白桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解煙堿類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0008]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明可以更加高效地降解煙堿類農(nóng)藥，從而有助于有效地降低土壤和地下水中煙堿類農(nóng)藥的殘留。
[0009]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
[0010]生物材料保藏
[0011]本發(fā)明的中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)是本發(fā)明的發(fā)明人從山東煙臺采集的規(guī)?；託夤こ陶右簶悠分蟹蛛x的純培養(yǎng)物，其保藏編號為CGMCC N0.8839，保藏日期為2014年2月21日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)。
【具體實施方式】
[0012]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。[0013]本發(fā)明提供了一種中間蒼白桿菌，該中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)的保藏編號為CGMCC N0.8839。
[0014]本發(fā)明還提供了一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養(yǎng)基，所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌。
[0015]其中，所述微生物菌劑中含有的菌體的量可以在很大范圍內(nèi)改變，例如每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數(shù)可以為(5-200) X IO7CFU,優(yōu)選情況下，每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數(shù) 可以為(20-120) X 107CFU。
[0016]根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基的種類可以在很大范圍內(nèi)改變，可以將各種能夠用于培養(yǎng)中間蒼白桿菌的培養(yǎng)基，例如，可以為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，用于菌種的保存；而發(fā)酵的培養(yǎng)基一般用于生產(chǎn)，這些培養(yǎng)基的種類也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。上述培養(yǎng)基能夠商購得到或者根據(jù)“微生物培養(yǎng)基手冊”(Microbiology Culture Media Manual)的記載制備得到。例如，種子培養(yǎng)基可以為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其含有l(wèi)_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化鈉和15-20g/L的瓊脂。例如發(fā)酵培養(yǎng)基可以含有:40-150g/L的玉米粉、40_150g/L的淀粉、40-150g/L的蔗糖、10-100g/L的豆油、0.5_8g/L的氯化鈉、0.5_5g/L的碳酸鈣、2_10g/L的磷酸二氫鉀和l-10g/L的硫酸亞鐵。
[0017]其中，上述各種培養(yǎng)基可以按照常規(guī)的滅菌方法進行滅菌后備用，例如在115-125°C和1.5-2個標準大氣壓的條件下滅菌10_30分鐘。
[0018]其中，為了方便所述微生物菌劑的貯藏和使用，所述微生物菌劑可以制成固體顆粒劑，優(yōu)選地，所述微生物菌劑還含有惰性固體載體和粘結(jié)劑；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結(jié)劑包括麥芽糖和/或糊精。
[0019]其中，優(yōu)選地，所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量所述粘結(jié)劑的含量為5-20重量％。
[0020]其中，所述微生物菌劑的制備方法可以包括:將CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。優(yōu)選情況下，通過培養(yǎng)使得到的每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數(shù)可以為(5-200) X IO7CFU,更優(yōu)選為(20-120) X 107CFU。其中，培養(yǎng)的溫度可以為28-35°C，培養(yǎng)的時間可以為10-50小時。
[0021]優(yōu)選地，所述微生物菌劑的制備方法還可以包括:將在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)后得到的物料與惰性固體載體和粘結(jié)劑混合；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結(jié)劑包括麥芽糖和/或糊精。優(yōu)選地，惰性固體載體和粘結(jié)劑的用量使得所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量％ ;所述粘結(jié)劑的含量為5-20重量％。其中，混合后的物料可以進一步干燥制粒為顆粒劑。
[0022]本發(fā)明還提供了如上所述的中間蒼白桿菌和如上所述的微生物菌劑在降解煙堿類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0023]其中，所述煙堿類農(nóng)藥可以包括吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺中的至少一種[0024]以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明:
[0025]實施例1
[0026]本實施例用于說明本發(fā)明的中間蒼白桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0027]將保藏編號為CGMCC N0.8839 的中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和200轉(zhuǎn)/分振蕩下培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0028]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有80g/L的玉米粉、80g/L的淀粉、80g/L的鹿糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數(shù)法進行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的中間蒼白桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,所得的培養(yǎng)液即為本實施例的微生物菌劑。
[0029]實施例2[0030]本實施例用于說明本發(fā)明的中間蒼白桿菌的培養(yǎng)及微生物菌劑的制備。
[0031]將保藏編號為CGMCC N0.8839 的中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)接種到LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和200轉(zhuǎn)/分振蕩下培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0032]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有80g/L的玉米粉、80g/L的淀粉、80g/L的鹿糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數(shù)法進行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的中間蒼白桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,在所得到的培養(yǎng)液(實測含水約65重量％)中加入硅藻土和粘結(jié)劑(糊精)，相對于每升的培養(yǎng)液，加入的硅藻土為500g，粘結(jié)劑為140g，然后將混合物在造粒機上過16目篩造粒，再用60°C的熱空氣烘干，實時測定水份含量，直至水份含量為4重量％左右，即得到本實施例的微生物菌劑，測得該微生物菌劑中，活菌數(shù)為7 X 108CFU/g。
[0033]實施例3
[0034]按照實施例1的方法制備微生物菌劑，不同的是，所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為含有60g/L的玉米粉、100g/L的淀粉、50g/L的鹿糖、80g/L的豆油、2g/L的氯化鈉、4g/L的碳酸鈣、3g/L的磷酸二氫鉀和3g/L的硫酸亞鐵的培養(yǎng)基。
[0035]對比例I
[0036]將購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)的商品號為1511C0001ACCC02996 的蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)接種到 LB 培養(yǎng)基(含 IOg/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30°C和90轉(zhuǎn)/分振蕩下培養(yǎng)至菌密度OD6tltl值為0.6-0.8，得到種子菌液。
[0037]將IOOmL上述種子菌液加入100L發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基含有80g/L的玉米粉、80g/L的淀粉、80g/L的鹿糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化鈉、3g/L的碳酸鈣、5g/L的磷酸二氫鉀和5g/L的硫酸亞鐵)，在30°C下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中進行取樣并通過顯微鏡直接計數(shù)法進行觀察，直至每克培養(yǎng)液中的蒼白桿菌的活菌數(shù)為IO9CFU,所得到的培養(yǎng)液即為本對比例的微生物菌劑。
[0038]測試實施例1[0039]本測試實施例中，在實驗室環(huán)境測試實施例1-3和對比例I的微生物菌劑的降解煙堿類農(nóng)藥的效果。
[0040]分別配制添加有100mg/L煙堿類農(nóng)藥的LB培養(yǎng)基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)，其中吡煙堿類農(nóng)藥分別為吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺。然后測定實施例1-3和對比例I的微生物菌劑的溶磷圈和溶磷量。然后對IOOmL添加了每一種煙堿類農(nóng)藥的LB培養(yǎng)基中，將實施例1_3和對比例I的微生物菌劑各取0.05g分別加入，30°C培養(yǎng)2天后，高效液相色譜法測量培養(yǎng)基上清中的煙堿類農(nóng)藥的殘余量，并計算降解率。結(jié)果如表1所示。
[0041]表1
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種中間蒼白桿菌，其特征在于:該中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)的保藏編號為CGMCC N0.8839。
2.一種微生物菌劑，該微生物菌劑含有菌體和培養(yǎng)基，其特征在于:所述菌體包括保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于:每克所述微生物菌劑中，保藏編號為CGMCC N0.8839的中間蒼白桿菌的活菌數(shù)為(5-200) X 107CFU。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述培養(yǎng)基包括牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述培養(yǎng)基含有40-150g/L的玉米粉、40-150g/L的淀粉、40-150g/L的蔗糖、10_100g/L的豆油、0.5_8g/L的氯化鈉、.0.5-5g/L的碳酸鈣、2-10g/L的磷酸二氫鉀和l-10g/L的硫酸亞鐵。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的微生物菌劑，其特征在于:所述微生物菌劑還含有惰性固體載體和粘結(jié)劑；所述惰性固體載體包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、蒙脫土、膨潤土、滑石粉、白碳黑和碳酸鈣中的至少一種；所述粘結(jié)劑包括麥芽糖和/或糊精。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物菌劑，其特征在于:所述微生物菌劑中，惰性固體載體的含量為30-90重量％ ;所述粘結(jié)劑的含量為5-20重量％。
8.權(quán)利要求1所述的中間蒼白桿菌和權(quán)利要求2-7中任意一項所述的微生物菌劑在降解煙堿類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述煙堿類農(nóng)藥包括吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、氯噻啉、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺和呋蟲胺中的至少一種。
【文檔編號】B09C1/10GK103937722SQ201410167736
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】趙君才, 阮志勇, 趙秉強, 王慧敏, 趙文勇, 呂昭輝, 劉慧 , 宋昭, 王彥偉, 劉小飛 申請人:煙臺海上傳奇生物科技有限公司