一種HyM土壤修復(fù)活性菌群的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明具體涉及一種HyM土壤修復(fù)活性菌群的制備方法。其能有效的提高土壤修復(fù)微生物的生產(chǎn)效率，且最大限度的保證其活性，提升了土壤修復(fù)微生物生產(chǎn)的規(guī)模化、工業(yè)化發(fā)展。一種HyM土壤修復(fù)活性菌群的制備方法為：(1)將菌株CCTCC No.M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和種子培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液；(2)然后配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接種芽孢桿菌菌種和上述種子培養(yǎng)液，再用高速剪切機(jī)進(jìn)行剪切，得到菌落；(3)然后對(duì)菌落進(jìn)行太陽(yáng)能、外加熱源發(fā)酵，得到菌泥；(4)對(duì)菌泥進(jìn)行收集和干燥。
【專利說(shuō)明】一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法
[0001] 一、【技術(shù)領(lǐng)域】： 本發(fā)明具體涉及一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法。
[0002] 二、【背景技術(shù)】：

【背景技術(shù)】中，中國(guó)土壤污染已對(duì)土地資源可持續(xù)利用與農(nóng)產(chǎn)品生態(tài)安全構(gòu)成威脅。全 國(guó)受有機(jī)污染物污染的農(nóng)田已達(dá)3600萬(wàn)公頃，污染物類型包括石油類、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、有 機(jī)氯等；因油田開(kāi)采造成的嚴(yán)重石油污染土地面積達(dá)1萬(wàn)公頃，石油煉化業(yè)也使大面積土 地受到污染；在沈撫石油污水灌區(qū)，表層和底層土壤多環(huán)芳烴含量均超過(guò)600mg/kg，造成 農(nóng)作物和地下水的嚴(yán)重污染。全國(guó)受重金屬污染土地達(dá)2000萬(wàn)公頃，其中嚴(yán)重污染土地超 過(guò)70萬(wàn)公頃，其中13萬(wàn)公頃土地因鎘含量超標(biāo)而被迫棄耕。針對(duì)這種狀況，國(guó)內(nèi)已經(jīng)有很 多解決方案，但是都存在著許多弊端，因此我們需要?jiǎng)?chuàng)新一種新型的土壤修復(fù)活性菌群制 備方法。在核心技術(shù)上突出表現(xiàn)為可以人為調(diào)控活性菌群制備的溫度和馴化適性能力，從 而最大限度的保證其生物活性及抗逆性，使土壤修復(fù)活性菌群的制備實(shí)現(xiàn)規(guī)范性、高活性、 安全性，并且操作簡(jiǎn)便，大大降低技術(shù)成本和提高適性能力。
[0003] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明為了解決上述【背景技術(shù)】中的不足之處，提供一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備 方法，其能有效的提高土壤修復(fù)微生物的生產(chǎn)效率，且最大限度的保證其活性，提升了土壤 修復(fù)微生物生產(chǎn)的規(guī)模化、工業(yè)化發(fā)展。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備 方法，其特征在于：所述的制備方法為： (1) 將菌株CCTCC NO.M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和種子培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液； (2) 然后配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接種芽孢桿菌菌種和上述種子培養(yǎng)液，再用高速 剪切機(jī)進(jìn)行剪切，得到菌落； (3) 然后對(duì)菌落進(jìn)行太陽(yáng)能、外加熱源發(fā)酵，得到菌泥； (4) 對(duì)菌泥進(jìn)行收集和干燥。
[0005] 所述的步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物5. 0-15.0 g/L、蛋白胨 10.0-30.0 g/L、氯化鈉 8. 5-9.0 g/L、葡萄糖 20. 0-30.0 g/L、亞油酸 8-30 g/L、微量元素 1- 1.5g/L、吐溫 80 1 ?5 g /L、腐殖酸 5-10 g /L、低聚糖 5-15 g /L、艾蒿 2-8 g /L、葛根 2- 6 g /L、甘草 2-10 g /L、紅豆杉葉 2-6 g /L、杜鵑 2-5 g /L、紫蘇 2-4 g /L、腐殖酸 3-10 g /L、中蜂蜜3-5 g /L、黃腐酸2-5 g /L、食鹽2-10 g /L、胰蛋白胨2-6 g /L、牛肉膏2-6 g /L、酵素粉2-5 g /L、氨基酸2-12 g /L、意蜂蜜2-6 g /L、紅豆根塊2-6 g /L、其余為水。
[0006] 所述的步驟（3)的工藝流程中： a. 接菌落微生物發(fā)酵液的種子液，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的體積比的5%?15%， 種子液的光密度為1?3 ; b. 發(fā)酵過(guò)程中，長(zhǎng)菌溫度為28°C?30°C，時(shí)間為60h?66h ; c. 采取慢速加糖方式，發(fā)酵液總體積10升，加糖量為100g_350g，且在接種后6h開(kāi)始， 在48h內(nèi)加完； d. 上述發(fā)酵培養(yǎng)基中亞油酸不能直接加入，而經(jīng)與分散劑混合后才能加入，且控制發(fā) 酵液中亞油酸的濃度，采用緩慢加入的方式； e. 發(fā)酵過(guò)程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6. 0?6. 6 之間。
[0007] 所述的步驟（4)菌泥收集和干燥：發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過(guò)高速冷凍離心機(jī)用去離 子無(wú)菌水洗滌三次，洗滌時(shí)轉(zhuǎn)速為7000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為20min，溫度為4°C，離心收集細(xì)胞， 加保護(hù)劑，真空冷凍干燥，即得HyM 土壤修復(fù)活性菌群。
[0008] 所述的微量元素為無(wú)水醋酸鈉或檸檬酸二銨。
[0009] 所述的保護(hù)劑為甘油、脫脂奶粉、海藻糖或甘露醇。
[0010] 所述的亞油酸的濃度為〇· 2 g/L。
[0011] 所述的分散劑為環(huán)糊精。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下：本發(fā)明設(shè)計(jì)了酶誘導(dǎo)物的提供 方式，一定濃度的亞油酸對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，而且亞油酸在發(fā)酵培養(yǎng)基的溶解 性較小，因此用微納粒子技術(shù)處理將亞油酸包覆在環(huán)糊精、淀粉、牛血清蛋白-卵磷脂、牛 血清蛋白、卵磷脂、甘油、單甘脂物質(zhì)之一中，再行添加。其添加方式為：用控速技術(shù)控制添 加速度，發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度控制在〇. 4g/L以內(nèi)，在接種培養(yǎng)12h后再間歇 補(bǔ)加，48h內(nèi)加完?？販匕l(fā)酵結(jié)束，經(jīng)分離、收集、干燥，制得的凍干制品中活菌數(shù)可達(dá)1010 個(gè)/g。菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)42. 7%。乳酸菌活菌計(jì)數(shù)按GB/T 4789. 35-2003規(guī)定測(cè)定，共軛亞油酸采用氣相色譜法（GC)和紫外分光光度法測(cè)定。本發(fā)明 具有如下特點(diǎn)：采用本發(fā)明的植物菌株選擇具有相容性和互補(bǔ)性，通過(guò)添加物消除拮抗性， 菌體抗逆性高，菌體0D值在3?6. 35,所得活菌數(shù)可達(dá)1050個(gè)/g ;所得菌體具有轉(zhuǎn)化亞油 酸生成共軛亞油酸的能力；亞油酸采用微納技術(shù)進(jìn)行保護(hù)溶解，降低其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 作用，另一方面增強(qiáng)了其馴化作用，提高了擴(kuò)繁率，其對(duì)亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)20%?50% ; 且發(fā)酵可廣泛采用太陽(yáng)能、外加熱源增溫系統(tǒng)，降低了能耗，節(jié)省成本。采用本發(fā)明所得乳 酸菌廣泛用于土壤改良和修復(fù)，也可作為益生菌在食品、生物飼料等方面使用，以提高突宿 主體內(nèi)共軛亞油酸的含量。
[0013] 四、【具體實(shí)施方式】： 本發(fā)明能有效轉(zhuǎn)化亞油酸為共軛亞油酸的新的微生物菌株，是乳桿菌屬 (Lactobacillus)的植物乳桿菌一個(gè)種：HSC235 (Lactobacillusplantarum HSC 235)，此菌 株是從天然發(fā)酵的植物中采用MRS乳酸菌培養(yǎng)分離篩選得到。此菌株己于2004年7月16 日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保存號(hào)CCTCC NO.M204051。此菌株的細(xì) 菌學(xué)特征如下：（1)形態(tài)：①細(xì)條狀，直徑〇. 48微米?0. 83微米，長(zhǎng)0. 8微米?5. 2微米； ②在培養(yǎng)初始階段，細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀；③具有耐酸性；④游動(dòng)性：靜止；⑤孢子形成：不形成孢 子；⑥革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。⑵在各種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)（30°C ):① MRS瓊脂平板培 養(yǎng)基：生長(zhǎng)不良，菌落呈圓形，不規(guī)則，表面光滑，乳白色；②MRS瓊脂斜面培養(yǎng)基：生長(zhǎng)不 良，無(wú)光澤，乳白色；③MRS液體培養(yǎng)基：生長(zhǎng)良好，液體混濁，有沉淀。（3)生理特征：1)木 糖：+2)海藻糖：+3)單糖：+4)山梨醇：+5)水楊苷：+6)核糖：+7)鼠李糖：-8)棉子糖：+9) 密二糖：+10)甘露糖：+11)甘露醇：+12)麥芽糖：+13)乳糖：+14)葡萄糖酸鹽：+15)半乳 糖：+16)果糖：+17)七葉靈：+18)纖維二糖：+19)阿拉伯糖：+20)苦杏仁苷：+21)乳酸旋 光性：DL22)接觸酶：-23)產(chǎn)吲哚能力：-24)分解酪素：-根據(jù)以上細(xì)菌學(xué)特征，以及此菌株 HSC235培養(yǎng)物基于其對(duì)底物的利用情況可確定為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum。 該菌種在MRS培養(yǎng)基上保藏，通常所用的培養(yǎng)基含有：碳源（例如葡萄糖、乳糖、乳清），氮 源（如），有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如酵母抽提物，蛋白胨，胰白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米漿），無(wú) 機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵、鈷和錳），及作為誘導(dǎo)物質(zhì)的亞油酸，或者含亞油酸 的其它物質(zhì)，或者亞油酸結(jié)構(gòu)類似物等。在20°C?40°C培養(yǎng)溫度下均能生長(zhǎng)，最適的生長(zhǎng) 溫度為27. 5°C?38°C。培養(yǎng)條件：pH值4.0?7.0,最適的生長(zhǎng)pH值為6.0?6. 6。該菌 種在含明亞油酸的MRS培養(yǎng)基上厭氧條件下培養(yǎng)1天?4天，所得細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化亞油酸及 亞油酸類物質(zhì)為共扼亞油酸的能力。
[0014] 本發(fā)明制備方法，包括：（1)將菌株CCTCC No. M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和 種子培養(yǎng)；(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接菌種，發(fā)酵培養(yǎng)基配方，各組分的含量均為 重量體積百分比，即g/L :酵母提取物：5. 0-15. 0蛋白胨：10. 0-30. 0氯化鈉：8. 5葡萄糖： 20. 0-30. 0亞油酸：8-30微量元素：適量吐溫80 :lml/L?5ml/L其余為水；（3)發(fā)酵工藝 a.接種子液，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的5%?15% (v/v，等單位體積之比），種子液的光 密度（0D值）為1?3;b.發(fā)酵過(guò)程中，長(zhǎng)菌溫度為28°C?30°C，時(shí)間為60h?66h;c.采 取慢速加糖方式，加糖量為l〇〇g-350g (發(fā)總發(fā)酵液體積10升計(jì)），且在接種后6h開(kāi)始，在 48h內(nèi)加完；d.上述發(fā)酵培養(yǎng)基中亞油酸一般不能直接加入，而經(jīng)與其它分散劑混合后才 能加入，且控制發(fā)酵液中亞油酸的濃度，采用緩慢加入的方式；e.發(fā)酵過(guò)程中采用添加氫 氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6. 0?6. 6之間；（4)菌泥收集和干燥：發(fā) 酵結(jié)束，發(fā)酵液通過(guò)高速冷凍離心機(jī)用去離子無(wú)菌水洗滌三次（7000轉(zhuǎn)/分，20min，4°C )， 離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑，真空冷凍干燥，即得活菌粉。
[0015] 本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中微量元素為無(wú)水醋酸鈉5g，MgS04 · 7H20 0· 2g，MnS04 · H20 〇· 〇5g，檸檬酸二銨 2g，CoC12 0· 002g。
[0016] 下面實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0017] 實(shí)施例1 : 一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法為： (1) 將菌株CCTCC NO.M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和種子培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液； (2) 然后配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接種芽孢桿菌菌種和上述種子培養(yǎng)液，再用高速 剪切機(jī)進(jìn)行剪切，得到菌落； 所述的步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯 化鈉8. 5g/L、葡萄糖20. Og/L、亞油酸8 g/L、微量元素 lg/L、吐溫80 lg /L、腐殖酸5 g / L、低聚糖5g /L、艾蒿2 g /L、葛根2 g /L、甘草2 g /L、紅豆杉葉2 g /L、杜醇2g /L、紫 蘇2 g /L、腐殖酸3 g /L、中蜂蜜3g /L、黃腐酸2 g /L、食鹽2 g /L、胰蛋白胨2 g /L、牛 肉膏2 g /L、酵素粉2g /L、氨基酸2 g /L、意蜂蜜2 g /L、紅豆根塊2 g /L、其余為水。
[0018] (3)然后對(duì)菌落進(jìn)行太陽(yáng)能、外加熱源發(fā)酵，得到菌泥； 發(fā)酵工藝：按上述配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子培養(yǎng)液，菌種的接 種量為培養(yǎng)基溶液的5%，即500mL，光密度（0D值）為1 ;將10L發(fā)酵培養(yǎng)基所需的亞油酸 溶解或包埋在環(huán)糊精中，添加入發(fā)酵液中，控制發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度為0. 2g/ L ;剩余的亞油酸在發(fā)酵過(guò)程中再添加入發(fā)酵液中；用氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié)pH6. 0,開(kāi)始培養(yǎng)發(fā) 酵；在開(kāi)始培養(yǎng)發(fā)酵6h后把葡萄糖100g (首先配制成30 %的溶液消毒）慢速加入發(fā)酵罐， 在48h內(nèi)加完；在接種子液培養(yǎng)發(fā)酵12h后，將剩余的溶解或包埋在環(huán)糊精中的亞油酸量， 分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液中亞油酸的總加入量為8g/L ;繼續(xù)發(fā)酵， 總時(shí)間為60h，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中長(zhǎng)菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)溫度控制在30°C左右；發(fā)酵過(guò)程中采用氫 氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵過(guò)程中的pH值維持在6. 0?6. 6之間。
[0019] (4)對(duì)菌泥進(jìn)行收集和干燥。
[0020] 菌泥收集和干燥：發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過(guò)高速冷凍離心機(jī)用去離子無(wú)菌水洗滌三 次（7000轉(zhuǎn)/分，20min，4°C )，離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑（選擇甘油，脫脂奶粉，海藻糖，甘 露醇中的任意一種物質(zhì)作為保護(hù)劑），真空冷凍干燥，即得凍干制品一HyM 土壤修復(fù)活性菌 群。
[0021] 凍干制品中活菌數(shù)所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)2. 1*1010個(gè)/g，菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共 軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)19%。
[0022] 實(shí)施例2 :-種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法為： (1) 將菌株CCTCC NO.M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和種子培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液； (2) 然后配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接種芽孢桿菌菌種和上述種子培養(yǎng)液，再用高速 剪切機(jī)進(jìn)行剪切，得到菌落； 所述的步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物15.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、氯 化鈉9.0 g/L、葡萄糖30.0 g/L、亞油酸30 g/L、微量元素1.5g/L、吐溫80 5 g /L、腐殖酸 10 g /L、低聚糖15 g /L、艾蒿8 g /L、葛根6 g /L、甘草10 g /L、紅豆杉葉6 g /L、杜匿$ 5 g /L、紫蘇4 g /L、腐殖酸10 g /L、中蜂蜜5 g /L、黃腐酸5 g /L、食鹽10 g /L、胰蛋白 胨6 g /L、牛肉膏6 g /L、酵素粉5 g /L、氨基酸12 g /L、意蜂蜜6 g /L、紅豆根塊6 g / L、其余為水。
[0023] (3)然后對(duì)菌落進(jìn)行太陽(yáng)能、外加熱源發(fā)酵，得到菌泥； 發(fā)酵工藝：按上述配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子培養(yǎng)液，菌種的接 種量為培養(yǎng)基溶液的5%，即500mL，光密度（0D值）為1 ;將10L發(fā)酵培養(yǎng)基所需的亞油酸 溶解或包埋在環(huán)糊精中，添加入發(fā)酵液中，控制發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度為0. 2g/ L ;剩余的亞油酸在發(fā)酵過(guò)程中再添加入發(fā)酵液中；用氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié)pH6. 0,開(kāi)始培養(yǎng)發(fā) 酵；在開(kāi)始培養(yǎng)發(fā)酵6h后把葡萄糖100g (首先配制成30 %的溶液消毒）慢速加入發(fā)酵罐， 在48h內(nèi)加完；在接種子液培養(yǎng)發(fā)酵12h后，將剩余的溶解或包埋在環(huán)糊精中的亞油酸量， 分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液中亞油酸的總加入量為8g/L ;繼續(xù)發(fā)酵， 總時(shí)間為60h，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中長(zhǎng)菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)溫度控制在30°C左右；發(fā)酵過(guò)程中采用氫 氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵過(guò)程中的pH值維持在6. 0?6. 6之間。
[0024] (4)對(duì)菌泥進(jìn)行收集和干燥。
[0025] 菌泥收集和干燥：發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過(guò)高速冷凍離心機(jī)用去離子無(wú)菌水洗滌三 次（7000轉(zhuǎn)/分，20min，4°C )，離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑（選擇甘油，脫脂奶粉，海藻糖，甘 露醇中的任意一種物質(zhì)作為保護(hù)劑），真空冷凍干燥，即得凍干制品一HyM 土壤修復(fù)活性菌 群。
[0026] 凍干制品中活菌數(shù)所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)9. 7*1010個(gè)/g。菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共 軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)42. 7%。
[0027] 實(shí)施例3 :-種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法為： (1) 將菌株CCTCC NO.M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和種子培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液； (2) 然后配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接種芽孢桿菌菌種和上述種子培養(yǎng)液，再用高速 剪切機(jī)進(jìn)行剪切，得到菌落； 所述的步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、氯化鈉 8.7 g/L、葡萄糖25 g/L、亞油酸13 g/L、微量元素 lg/L、吐溫80 3 g /L、腐殖酸8 g /L、 低聚糖7 g /L、艾蒿6 g /L、葛根4 g /L、甘草9 g /L、紅豆杉葉5 g /L、杜醇3 g /L、紫 蘇3 g /L、腐殖酸7g /L、中蜂蜜4g /L、黃腐酸3 g /L、食鹽8 g /L、胰蛋白胨4 g /L、牛 肉膏5 g /L、酵素粉3 g /L、氨基酸10g /L、意蜂蜜5 g /L、紅豆根塊4 g /L、其余為水。
[0028] (3)然后對(duì)菌落進(jìn)行太陽(yáng)能、外加熱源發(fā)酵，得到菌泥； 發(fā)酵工藝：按上述配方配制10L發(fā)酵液于發(fā)酵罐中，經(jīng)滅菌后接種子培養(yǎng)液，菌種的接 種量為培養(yǎng)基溶液的5%，即500mL，光密度（0D值）為1 ;將10L發(fā)酵培養(yǎng)基所需的亞油酸 溶解或包埋在環(huán)糊精中，添加入發(fā)酵液中，控制發(fā)酵液中亞油酸初始濃度誘導(dǎo)濃度為0. 2g/ L ;剩余的亞油酸在發(fā)酵過(guò)程中再添加入發(fā)酵液中；用氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié)pH6. 0,開(kāi)始培養(yǎng)發(fā) 酵；在開(kāi)始培養(yǎng)發(fā)酵6h后把葡萄糖100g (首先配制成30 %的溶液消毒）慢速加入發(fā)酵罐， 在48h內(nèi)加完；在接種子液培養(yǎng)發(fā)酵12h后，將剩余的溶解或包埋在環(huán)糊精中的亞油酸量， 分三次間歇補(bǔ)加入發(fā)酵液中，48h內(nèi)加完，發(fā)酵液中亞油酸的總加入量為8g/L ;繼續(xù)發(fā)酵， 總時(shí)間為60h，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中長(zhǎng)菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)溫度控制在30°C左右；發(fā)酵過(guò)程中采用氫 氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵過(guò)程中的pH值維持在6. 0?6. 6之間。
[0029] (4)對(duì)菌泥進(jìn)行收集和干燥。
[0030] 菌泥收集和干燥：發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過(guò)高速冷凍離心機(jī)用去離子無(wú)菌水洗滌三 次（7000轉(zhuǎn)/分，20min，4°C )，離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑（選擇甘油，脫脂奶粉，海藻糖，甘 露醇中的任意一種物質(zhì)作為保護(hù)劑），真空冷凍干燥，即得凍干制品一HyM 土壤修復(fù)活性菌 群。
[0031] 凍干制品中活菌數(shù)所得菌粉活菌數(shù)可達(dá)5. 7*1010個(gè)/g。菌體轉(zhuǎn)化亞油酸生成共 軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)24. 1 %。
[0032] 試驗(yàn)例(根據(jù)實(shí)施例1制得的產(chǎn)品）： 1、試驗(yàn)?zāi)康?驗(yàn)證本發(fā)明對(duì)蘋(píng)果所種植土壤的改善情況及生長(zhǎng)發(fā)育的作用、增產(chǎn)效果進(jìn)行比較，為 此土壤修復(fù)活性菌群在市場(chǎng)上大力推廣提供科學(xué)依據(jù)。
[0033] 2、試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn) 試驗(yàn)2012年2- 8月份安排在杜康鎮(zhèn)后洼村進(jìn)行實(shí)施。
[0034] 3、試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)果園海拔858m，地勢(shì)平坦，土壤類型為黃綿土，質(zhì)地：壤土類，地力等級(jí)2級(jí)。面 積8畝，品種：紅富士，樹(shù)齡15年，樹(shù)勢(shì)整齊一致，管理水平較高。試驗(yàn)處理前采集0 40cm 土樣，如表1 :化驗(yàn)測(cè)得土壤基本養(yǎng)分狀況如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于：所述的制備方法為： (1) 將菌株CCTCC NO.M204051進(jìn)行常規(guī)斜面培養(yǎng)活化和種子培養(yǎng)，得種子培養(yǎng)液； (2) 然后配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并經(jīng)滅菌后接種芽孢桿菌菌種和上述種子培養(yǎng)液，再用高速 剪切機(jī)進(jìn)行剪切，得到菌落； (3) 然后對(duì)菌落進(jìn)行太陽(yáng)能、外加熱源發(fā)酵，得到菌泥； (4) 對(duì)菌泥進(jìn)行收集和干燥。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于：所述 的步驟（2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：酵母提取物5. 0-15. 0 g/L、蛋白胨10. 0-30. 0 g/L、 氯化鈉8.5-9.〇8/1、葡萄糖20.〇-30.〇8/1、亞油酸8-3〇8/1、微量元素1-1.58/1、吐溫 80 1?5 g /L、腐殖酸5-10 g /L、低聚糖5-15 g /L、艾蒿2-8 g /L、葛根2-6 g /L、甘草 2- 10 g /L、紅豆杉葉2-6 g /L、杜鵑2-5 g /L、紫蘇2-4 g /L、腐殖酸3-10 g /L、中蜂蜜 3- 5 g /L、黃腐酸2-5 g /L、食鹽2-10 g /L、胰蛋白胨2-6 g /L、牛肉膏2-6 g /L、酵素粉 2-5 g /L、氨基酸2-12 g /L、意蜂蜜2-6 g /L、紅豆根塊2-6 g /L、其余為水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于： 所述的步驟（3)的工藝流程中： a. 接菌落微生物發(fā)酵液的種子液，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基溶液的體積比的5%?15%， 種子液的光密度為1?3 ; b. 發(fā)酵過(guò)程中，長(zhǎng)菌溫度為28°C?30°C，時(shí)間為60h?66h ; c. 采取慢速加糖方式，發(fā)酵液總體積10升，加糖量為100g_350g，且在接種后6h開(kāi)始， 在48h內(nèi)加完； d. 上述發(fā)酵培養(yǎng)基中亞油酸不能直接加入，而經(jīng)與分散劑混合后才能加入，且控制發(fā) 酵液中亞油酸的濃度，采用緩慢加入的方式； e. 發(fā)酵過(guò)程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸自動(dòng)平衡調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在6.0?6. 6 之間。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于：所述 的步驟（4)菌泥收集和干燥：發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液通過(guò)高速冷凍離心機(jī)用去離子無(wú)菌水洗滌 三次，洗滌時(shí)的轉(zhuǎn)速為7000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為20min，溫度為4°C，離心收集細(xì)胞，加保護(hù)劑，真 空冷凍干燥，即得HyM 土壤修復(fù)活性菌群。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于：所述 的微量元素為無(wú)水醋酸鈉或檸檬酸二銨。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于：所述 的保護(hù)劑為甘油、脫脂奶粉、海藻糖或甘露醇。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于：所述 的亞油酸的濃度為0. 2 g/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種HyM 土壤修復(fù)活性菌群的制備方法，其特征在于：所述 的分散劑為環(huán)糊精。
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK104250624SQ201410190226
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】武興戰(zhàn) 申請(qǐng)人:楊凌國(guó)泰農(nóng)林科技有限公司