一種采用蘇云金芽孢桿菌降解磷酸三(2-氯乙基)酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用蘇云金芽孢桿菌降解磷酸三(2-氯乙基)酯的方法，包括：在30℃條件下，將蘇云金芽孢桿菌接種于磷酸三(2-氯乙基)酯降解培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床降解培養(yǎng)后，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)測定培養(yǎng)液中殘留的磷酸三(2-氯乙基)酯濃度，以此分析該菌株對磷酸三(2-氯乙基)酯的降解效果。此方法對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，對有機(jī)磷系阻燃劑降解的程度較高，且成本較其他方法低。CGMCC No.93992014.06.30
【專利說明】-種采用蘇云金芽抱桿菌降解磯酸H (2-氯乙基）目旨的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物降解有機(jī)污染物的領(lǐng)域，特別是涉及一種采用蘇云金芽抱桿菌 降解磯酸H (2-氯己基）醋的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 有機(jī)磯系阻燃劑具有良好的阻燃性能，與聚合物基材相容性好，具有耐水、耐熱W 及耐遷移等特點，常作為電子/電器、家具、紡織等材料中的添加型阻燃劑。當(dāng)前，含有機(jī)磯 系阻燃劑的產(chǎn)品在生產(chǎn)、使用W及廢棄回收處理過程中，其極易從該些產(chǎn)品中逃逸揮發(fā)并 進(jìn)入周圍環(huán)境中，繼而擴(kuò)散分布在各種環(huán)境介質(zhì)中。目前，有機(jī)磯系阻燃劑已是污水中的 常見污染物，普遍認(rèn)為污水處理廠的出水是地表水中有機(jī)磯系阻燃劑的主要來源；在沒有 明顯污染源的農(nóng)業(yè)地區(qū)，地表水中的有機(jī)磯系阻燃劑的污染主要來源于覆蓋溫室大棚的塑 料薄膜；垃圾滲濾液中的有機(jī)磯系阻燃劑是地下水甚至也是海水中有機(jī)磯系阻燃劑的主要 來源。目前隨著漠系阻燃劑的限用和禁用，有機(jī)磯系阻燃劑的產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。由 于有機(jī)磯系阻燃劑具有顯著的毒理效應(yīng)，環(huán)境中有機(jī)磯系阻燃劑污染及風(fēng)險評估已經(jīng)成為 環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點。磯酸H (2-氯己基）醋（TCE巧是最常用的一類有機(jī)磯系阻燃劑，現(xiàn) 已越來越受到人們的關(guān)注。
[0003] 目前，對有機(jī)磯系阻燃劑降解方法的研究大多都集中在物理化學(xué)方法和微生物降 解法，從降解效果、二次污染、處理成本、適用性范圍等多方面考慮，微生物降解法無疑是最 佳的選擇。有機(jī)磯系阻燃劑的微生物降解方法主要包括厭氧降解和好氧降解兩種。厭氧降 解反應(yīng)時間長，而好氧降解反應(yīng)時間短，微生物種類多，且對有機(jī)磯系阻燃劑降解的程度較 高。從降解效果、工藝成本、條件控制等多方面綜合比較，有機(jī)磯系阻燃劑的好氧微生物降 解方法體現(xiàn)出了 一定的優(yōu)越性，且已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但在實際應(yīng)用中，好氧微生物降解有機(jī) 磯系阻燃劑的效率往往不高，所W有機(jī)磯系阻燃劑好氧降解菌的篩選及應(yīng)用仍具有一定的 研究意義。由于微生物對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，且污染過程經(jīng)歷一段自然馴化期，因而可W通過 馴化從自然環(huán)境中篩選到能夠降解某種污染物的降解菌株。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種采用蘇云金芽抱桿菌降解磯酸H (2-氯己基）醋的方 法，通過蘇云金芽抱桿菌對磯酸H (2-氯己基）醋的降解，為其污染治理和應(yīng)用提供技術(shù)方 法。
[0005] 本發(fā)明的一種采用蘇云金芽抱桿菌降解磯酸H (2-氯己基）醋的方法，包括：
[0006] (1)將蘇云金芽抱桿菌菌種接到裝有已滅菌的富集培養(yǎng)基中，在搖床中培養(yǎng)；
[0007] (2)然后接種于磯酸H (2-氯己基）醋降解培養(yǎng)基中在搖床中培養(yǎng)；
[000引 做培養(yǎng)液中的磯酸立（2-氯己基）醋經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定，分析該菌株對 磯酸H (2-氯己基）醋的降解效果。
[0009] 步驟（I)所述的富集培養(yǎng)基組成為；lOg/L魚粉蛋白腺、5g/L酵母粉、5g/LNaCl，蒸 觸水 1000血，pH = 6. 8 ?7. 2。
[0010] 步驟（1)所述的培養(yǎng)條件為溫度3(TC，轉(zhuǎn)速12化pm,培養(yǎng)4她。
[00川步驟（2)所述的磯酸S (2-氯己基）醋降解培養(yǎng)基組成為；0.2g/L化Cl, Ig/ L(NH4)2SO4,0. 2g/L MgS04 . 7馬0,0. 02g/L CaCla . 2馬0,0. Olg/L FeCla'O. Olg/L MnSO" 40mg/L磯酸H (2-氯己基）醋，蒸觸水1000血。
[001引步驟（2)所述的降解磯酸；（2-氯己基）醋的條件為抑=6. 8?7. 2,溫度30。 搖床的轉(zhuǎn)動頻率12化pm,培養(yǎng)7天。
[0013] 所述蘇云金芽抱桿菌是從污水處理廠的活性污泥中篩選出來的，此菌株屬于微 桿菌科（Microbacteriaceae)，該菌株的馴化采用梯度增加污染物濃度的馴化方法進(jìn)行馴 化培養(yǎng)，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基151(0.2肖/1化(：1，1肖/1(畑4)25〇4,0.2肖/11拆〇4*7&0,0.02徑/1 CaCla ? 2&0,0. Olg/L 化Cl2,0. Olg/L MnSO"蒸觸水 IOOOmL, pH = 6. 8 ?7. 2)中加入磯酸 H (2-氯己基）醋-丙麗溶液，配制磯酸H (2-氯己基）醋濃度梯度為5、10、15、20、30、40、 60mg/L的馴化培養(yǎng)基，采用梯度增加污染物濃度的馴化方法進(jìn)行馴化培養(yǎng)。該菌落為圓形， 邊緣整齊，淡黃色，光滑，濕潤，凸起；菌體呈微桿狀，革蘭氏染色陽性，菌體周圍有粘液層包 泰。
[0014] 在此條件下降解培養(yǎng)7天，磯酸H (2-氯己基）醋的降解率達(dá)到82. 25%。
[0015] 有益效果
[0016] 此方法對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，對有機(jī)磯系阻燃劑降解的程度較高，且成本較其他方法 低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是蘇云金芽抱桿菌所屬種群系統(tǒng)樹；
[001引圖2是磯酸H (2-氯己基）醋標(biāo)準(zhǔn)樣品的GC-MS圖；
[0019] 圖3是磯酸H (2-氯己基）醋的總離子流圖；
[0020] 圖4是降解培養(yǎng)基（DM)中蘇云金芽抱桿菌對磯酸H (2-氯己基）醋的降解曲線。

【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W對本發(fā)明作各種改動或修改，該些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0022] 實施例1
[002引 1、菌株的分離
[0024] (1)采集污水處理廠的活性污泥，置于一個長31. 2畑1，寬22. Ocm,高22. 5cm的玻 璃馴化裝置，在不加營養(yǎng)物質(zhì)，沒有進(jìn)水出水交換的基礎(chǔ)上用空壓機(jī)不間斷曝氣3天。然后 進(jìn)行換水，排出裝置中大約IOL的泥水混合物，加入營養(yǎng)液并進(jìn)行不間斷曝氣。在培養(yǎng)了 10天后在加入營養(yǎng)液的同時開始加入磯酸H (2-氯己基）醋-丙麗溶液，保持裝置中磯酸 S (2-氯己基）醋濃度在Ippm左右，并按照SBR工藝（進(jìn)水、曝氣、靜置、排水和閑置）進(jìn) 行馴化培養(yǎng)，隔天換水，培養(yǎng)馴化一個月。培養(yǎng)液的配制；〇. 6g/L葡萄糖、0. 8g/L無水己酸 軸、0. 3g/L 酵母粉、0. 283g/L NH4C1、0. 07g/L K2HP04 ? 3肥0、0. 022g/L K肥P04。配制成大 約10升左右的營養(yǎng)液。
[002引 似將馴化后的水樣沉淀30分鐘后，用移液槍移取上清液ImL于裝有IOOmL富集 培養(yǎng)基的250mL滅菌錐形瓶中，放在搖床上培養(yǎng)。搖床轉(zhuǎn)速為120巧m，溫度為3(TC。富集 培養(yǎng)基EM巧nrichment Medium)的主要成分為；10g/L魚粉蛋白腺、5g/L酵母粉、5g/LNaCl， 蒸觸水1000血，pH = 6. 8?7. 2。
[0026] (3)在無菌條件下移取富集培養(yǎng)基的混濁菌液ImL于裝有IOOmL馴化培養(yǎng)基的 250mL滅菌錐形瓶中，放入搖床中，利用磯酸H (2-氯己基）醋作為唯一碳源進(jìn)行W 7天 為一個周期的逐漸增加污染物濃度的馴化方法進(jìn)行馴化培養(yǎng)。搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，溫度 為30°C，培養(yǎng)時間為兩個月。在無機(jī)鹽培養(yǎng)基MSM(0. 2g/L化Cl，lg/L(NH4)2S04,0.2g/L M拆04 ? 7肥0,0. 02g/L CaC12 ? 2肥0,0. Olg/L 化C12,0. Olg/L MnS04,蒸觸水 1000血，pH = 6. 8?7. 2)中加入磯酸H (2-氯己基）醋-丙麗溶液，配制磯酸H (2-氯己基）醋濃度為 5、10、15、20、30、40、60mg/L 的馴化培養(yǎng)基。
[0027] (4)取馴化兩個月后最后一個周期的馴化培養(yǎng)基ImU按10倍稀釋法，用無菌水 將菌液作10-1?10-7梯度稀釋。每種稀釋濃度分別取0. ImL菌液均勻涂布于固體培養(yǎng) 基上，將培養(yǎng)皿倒置于301：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基的主要成分為；0.2肖/1化(：1，1徑/ L(NH4)2S04,0. 2g/L M拆04*7肥0,0. 02g/L CaC12*2肥0,0. Olg/L 化C12,0. Olg/L MnS04， 60mg/L磯酸H (2-氯己基）醋，20g/L瓊脂，蒸觸水1000血，pH = 6. 8?7. 2。
[0028] (5)待長出單菌落后，觀察各菌落形態(tài)，挑取形態(tài)清晰的單一菌落，編號，在分離培 養(yǎng)基上劃線分離，將培養(yǎng)皿倒置于3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她，再觀察結(jié)果。反復(fù)5?7次，并 在電子顯微鏡下觀察，確保是純的單一菌株后，將其標(biāo)記為H-1，并將其接種到固體斜面培 養(yǎng)基上，4C下保存于冰箱中，待后續(xù)進(jìn)行降解試驗。分離培養(yǎng)基SM(Separate Medium)的 主要成分為；lOg/L魚粉蛋白腺，5g/L酵母粉，5g/L化Cl，60mg/L磯酸H (2-氯己基）醋， 20g/L瓊脂，蒸觸水IOOOmL, pH = 6. 8?7. 2。固體斜面培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基的成分相同。
[0029] 2、菌株的鑒定
[0030] (1)菌體及菌落形態(tài)特征
[0031] 菌株個體為微桿狀，革蘭氏染色陽性，菌體周圍有粘液層包裹；其菌落為圓形，邊 緣整齊，淡黃色，光滑，濕潤，凸起。
[0032] 似菌體的ies rDNA序列
[0033] 通過16S rDNA序列測定和分析比較，該序列與Bacillus thuringiensis的16S rDNA序列的同源性達(dá)到99%，確定該菌株為蘇云金芽抱桿菌炬acillus thuringiensis), 其16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。該菌株已于2014年6月30日保藏至中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中也，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCC NO. 9399,保藏單 位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0034] 實施例2蘇云金芽抱桿菌對磯酸H (2-氯己基）醋的降解分析
[00巧]在無菌條件下，將蘇云金芽抱桿菌接種到裝有已滅菌的100血富集培養(yǎng)基的 250血錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床內(nèi)，3(TC，120巧m，培養(yǎng)4她。富集培養(yǎng)基EM巧nriChment Medium)的主要成分為；10g/L魚粉蛋白腺、5g/L酵母粉、5g/LNaCl，蒸觸水1000血，抑= 6. 8 ?7. 2。
[0036] 將富集培養(yǎng)的菌液于10血滅菌離也管中，W 6000r/min的轉(zhuǎn)速離也IOmin后收集 菌體并用無菌生理鹽水反復(fù)洗涂并離也2?3次，最后W等體積的生理鹽水重息配成一定 濃度的菌息液，按10%的量接種于磯酸H (2-氯己基）醋降解培養(yǎng)基中進(jìn)行降解實驗，樣 品經(jīng)GC-MS測定，分析該菌對磯酸H (2-氯己基）醋的降解效果。磯酸H (2-氯己基）醋 降解培養(yǎng)基DM(Degradation Medium)的主要成分為；0.2g/L 化Cl, lg/L(NH4)2S04,0.2g/L M拆04*7肥0,0. 02g/L CaC12*2肥0,0. Olg/L 化C12,0. Olg/L MnS04,40mg/L 磯酸H (2-氯 己基）醋，蒸觸水1000血，pH = 6. 8?7. 2。
[0037] TCEP濃度采用GC-MS法進(jìn)行測定，分析條件如下：
[0038] (1)氣相色譜條件
[0039] 色譜柱：HP-5 (30. OmXO. 25mmXO. 25m);
[0040] 升溫程序；初溫 9(TC，W 1(TC /min 升至 23(TC，保持 IOmin ;
[0041] 載氣；高純氮氣，純度大于99. 999 % ;
[0042] 恒流控制；1. 0血/min ;
[0043] 模式；不分流進(jìn)樣；
[0044]進(jìn)樣量；1L;
[004引 進(jìn)樣口溫度；25(TC。
[004引 似質(zhì)譜條件
[0047]離子源；EI，70eV，溫度 230°C ;
[004引 四極桿溫度；15(TC;
[004引接口溫度；27(TC;
[0050] 溶劑延遲時間；5min ;
[0051] 掃描質(zhì)量范圍；m/z 35-350amu ;
[0052] TCEP 的特征峰；11. 73min ;
[0053] 特征離子；249,如圖3。
[0054] 先用磯酸H (2-氯己基）醋-丙麗溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，并W色譜級丙麗為對照，測 得樣品中的磯酸H (2-氯己基）醋在11. 73min左右處出現(xiàn)波峰（如圖2)。確定了磯酸H (2-氯己基）醋標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰時間，就可W進(jìn)一步分析磯酸H (2-氯己基）醋的降解效 果。同時，配制磯酸H (2-氯己基）醋濃度為5、10、15、20、40、60、80mg/L的磯酸H (2-氯 己基）醋-丙麗標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制磯酸H (2-氯己基）醋濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，此標(biāo)準(zhǔn)曲線 為巧=5X106X-1X107, R2 = 0. 9983。W向降解培養(yǎng)基（DM)中接種在ZY-6菌作為實驗 組，接種滅活的ZY-6菌為對照組，通過對實驗組和對照組的GC-MS圖比較，可W得到磯酸H (2-氯己基）醋的初始濃度為40mg/l，最終濃度為7. lOmg/L，降解效率為82. 25%。
【權(quán)利要求】
1. 一種采用蘇云金芽孢桿菌降解磷酸三（2-氯乙基）酯的方法，包括下述步驟： (1) 將蘇云金芽孢桿菌菌種接到裝有已滅菌的富集培養(yǎng)基中，在搖床中培養(yǎng)； (2) 然后接種于磷酸三（2-氯乙基）酯降解培養(yǎng)基中在搖床中培養(yǎng)； (3) 培養(yǎng)液中的磷酸三（2-氯乙基）酯經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定，分析該菌株對磷酸 三（2-氯乙基）酯的降解效果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用蘇云金芽孢桿菌降解磷酸三（2-氯乙基）酯的方 法，其特征在于：步驟（1)所述的富集培養(yǎng)基組成為：l〇g/L魚粉蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/ LNaCl，蒸餾水 lOOOmL，pH = 6. 8 ?7. 2。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用蘇云金芽孢桿菌降解磷酸三（2-氯乙基）酯的方 法，其特征在于：步驟（1)所述的培養(yǎng)條件為溫度30°C，轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)48h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用蘇云金芽孢桿菌降解磷酸三（2-氯乙基）酯的方 法，其特征在于：步驟（2)所述的磷酸三（2-氯乙基）酯降解培養(yǎng)基組成為：0. 2g/L NaCl， lg/L(NH4)2S04,0. 2g/L MgS04 · 7Η20,0· 02g/L CaCl2 · 2Η20,0· Olg/L FeCl2,0. Olg/L MnS04， 40mg/L磷酸三（2-氯乙基）酯，蒸饋水lOOOmL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用蘇云金芽孢桿菌降解磷酸三（2-氯乙基）酯的方 法，其特征在于：步驟（2)所述的降解磷酸三（2-氯乙基）酯的條件為pH = 6. 8?7. 2,溫 度30°C，搖床的轉(zhuǎn)動頻率120rpm，培養(yǎng)7天。
【文檔編號】C02F101/36GK104261568SQ201410438100
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】趙曉祥, 趙銀平, 孫璐璐, 耿艷芳 申請人:東華大學(xué)