專利名稱：抗過氧化氫的新微生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗過氧化氫的一種新的微生物，更具體地講，本發(fā)明涉及一種對過氧化氫濃度表現(xiàn)出線性生存曲線、以建立用過氧化氫滅菌標準的新的微生物。
諸如半導體制造工廠之類的潔凈的工業(yè)必須使用嚴格純度的純水，例如超純水或去離子水。超純水通常通過用具有設計標準孔徑的濾器過濾來獲得。要獲得去離子水，通過特殊的電化學方法或使用離子樹脂層分離或吸附水中含有的離子。本領域技術人員可明顯看出，用市售的適當?shù)膬x器可制備超純水和去離子水。
與顆?；螂x子不同，水中含有的微生物在某種程度上可以通過滅菌來除去，但不能完全消滅。甚至在無菌條件下，在任何時間都可以由大氣或其它物體引起可能的再污染。一旦再污染微生物，由于微生物使用水中所有種類的營養(yǎng)物質來繁殖，因此簡單地減少微生物的數(shù)量是沒有用的。
從微生物繁殖引起的生物膜的形成到微生物附著是一個逐漸發(fā)生的過程，它比微生物繁殖這個問題還要嚴重。生物膜是凝膠狀層，它含有在含水環(huán)境中液固邊辦即基值表面生長的微生物以及這些微生物產生的胞外聚合物(EPS)的聚集體。生物膜由占大多數(shù)的水(濕重的70-95％)和包圍微生物的一種有機物質(干重的70-95％)組成。生物膜的大部分通常由多糖組成。生物膜的另一名稱為多糖蛋白質復合物。
生物膜在基質的整個表面上均勻地形成，或以幾百微米的非常薄的不規(guī)則圖案在基質的部分表面形成生物膜。由于生物膜阻止溶解氧的擴散，因此即使大約50-150μm薄的生物膜中含有的需氧微生物也會變?yōu)閰捬跷⑸铩?br> 因為生物膜具有不同種類的微生物，并根據地方和時間的不同，改變微生物的特性，所以生物膜表現(xiàn)出結構的多相性。生物膜中的微生物形成具有相同功能的微聚生體，因此產生功能的純一性。
在生態(tài)學方面，生物膜被認為是使微生物適應極端不理想環(huán)境的生物學方式。例如，生物膜含有多種具有不同功能的微生物，這些微生物積累溶于營養(yǎng)不足的水相中的微量養(yǎng)分，誘導對環(huán)境因子(諸如pH、鹽、殺生物藥劑、脫水等)短期變化的抗性，或提供生活于生物膜中的微生物之間的基因交換庫。生物膜證明是形成了表現(xiàn)新的小生態(tài)環(huán)境(諸如分解不可分解的材料等)的微生物聚集體。
對于生產半導體的半導體生產線而言，因為水流過生產線的停留時問短，所以超純水或去離子水中微生物的生長對質控沒有影響。質控的重要因素是超純水制備設備、超純水管道系統(tǒng)、生產線或生產過程中的半導體材料表面上生長的生物膜。
生物膜可以在18兆歐·厘米的超純水中產生。值得注意的是即使在水相中只有大約1-10CFU/毫升的少量微生物生存，生物膜卻含有大量的微生物，在生物膜中大約有107-1011個細胞/毫升。
殺生物藥劑通常用來解決微生物帶來的問題。由于存在上述生物膜，簡單的滅菌不足以解決問題。生理學不活動的微生物易于吸附到物體表面，因此形成新的生物膜。不活動的微生物本身作為一個表面，可以吸附新的微生物。與單獨浮動的微生物相比，由于形成生物膜基質，因此生物膜表面的微生物難以滅菌。
生物膜經歷的變化與浮動在水中的微生物數(shù)量無關。影響微生物和生物膜量的因素是養(yǎng)分的種類和量、水的剪切力等。應該注意到，形成生物膜的微生物的除去非常困難，但和微生物滅菌一樣非常重要。
通過兩個步驟的方法除去微生物的沉積使用氧化劑、生物分散劑、表面活性劑和酶減弱物體表面和生物膜基層之間的相互作用的化學方法，化學方法不影響待處理的物體；諸如剪切力之類的物理方法、機械方法和超聲波以除去物體表面微生物沉積(包括生物膜在內)。
化學殺生物藥劑必須在微生物快速繁殖前有效地除去微生物。如果殺生物藥劑在滅菌后不立刻除去，那么它本身可以是污染物。儀器或管道系統(tǒng)用化學殺生物藥劑處理后應使用超純水清洗，最好在線測定殘留的化學殺生物藥劑的濃度?；瘜W殺生物藥劑必須容易并安全地進行處理，并且必須不對滅菌的系統(tǒng)的所有組成部分產生物理和/或化學損害。最優(yōu)選的化學殺生物藥劑是過氧化氫。
在半導體制造公司(諸如Samsung Electronics Co.和MitsubishiSemiconductor或America Inc.等)的工廠中，超純水供應管道通常用過氧化氫滅菌。由于過氧化氫分解為水和氧氣，因此在滅菌后不留下來，不引起管道的腐蝕。在高溫下應用高濃度的過氧化氫時，滅菌非常有效。
由于在較高溫度下管道的材料會損壞，并從排水管排出有機物質或無機物質，因此滅菌溫度通常為大約30℃。
使用高濃度的過氧化氫是昂貴的，而且在滅菌后需要太多的時間來除去過氧化氫。過氧化氫的使用濃度通常為1％的低濃度，以便不會由于過氧化氫和有機材料反應而產生氣體。然而，使用過氧化氫滅菌沒有一定的標準，諸如其濃度、需要的時間或使用周期等。
必須作許多試錯試驗，以建立使用過氧化氫滅菌的最佳標準方法。由于不同的生產線需要不同的滅菌方法，因此試錯試驗是非常低效的。建立滅菌方法之前，半導體生產線的無法投產。在改變濃度和過氧化氫量以及處理時間時，每次改變條件時都必須從管道中收集樣品，以測定存活的微生物數(shù)以檢查該條件的滅菌效果。上述不方便的并且重復的方法必須由新的指示菌取代，以建立滅菌標準。
于低溫下使用甲醛的滅菌可用于不能通過熱處理完全滅菌的材料，諸如醫(yī)療用具和一部分半導體裝置等。尚未找出標準或估計滅菌效力的物理方法和/或化學方法。無一例外，都需要一個指示菌(indicatormicroorganism)以建立滅菌條件的標準。
用作指示菌的微生物應該滿足某些條件(1)指示菌必須是需氧微生物，易于識別和分析，對過氧化氫的抗性比其它污染微生物要強；(2)指示菌必須對過氧化氫或甲醛顯示可重復的、最好是線性的存活曲線；(3)指示菌必須是易于保持和繁殖的微生物；(4)指示菌必須在其保持期間不改變其生物學特性。
自從二十世紀七十年代努力尋找滿足上述條件的微生物后，介紹了新的微生物，例如1996年Wright介紹了嗜熱脂肪芽孢桿菌NCIMB8224。需要再開發(fā)出對過氧化氫表現(xiàn)出更加線性的存活曲線的新微生物。
因此，本發(fā)明涉及抗過氧化氫的新微生物，它基本上避免了由于相關技術的限制和缺點引起的一個或多個問題。
本發(fā)明的目的是提供抗過氧化氫的新微生物。
本發(fā)明另外的特征和優(yōu)點將在以下描述中提出，部分可從描述中明顯看出，或可以通過實施本發(fā)明來認識。通過在上述描述和權利要求書以及附圖中特別指出的結構，可以認識到本發(fā)明的目的和其它優(yōu)點。
為了達到本發(fā)明這些和其它優(yōu)點及目的，正如具體表達和廣泛描述的，新微生物藤黃微球菌HN-2-11具有抗過氧化氫的機制，并對滅菌溫度和過氧化氫濃度表現(xiàn)出線性半對數(shù)存活曲線。因此，它可以是在必須沒有微生物的設備(諸如半導體制造工廠中超純水管道等)中建立滅菌標準的指示菌。
很明顯，上述一般描述和以下詳細描述只是舉例說明，是解釋性的，是對本發(fā)明權利要求的進一步的解釋。
附圖可使得進一步理解本發(fā)明，將其加入說明書中并組成該說明書的一部分，與解釋附圖原理的說明一起說明本發(fā)明的實施例。
在附圖中

圖1為用生物學鑒定系統(tǒng)獲得的HN-2-11的鑒定表；圖2為30℃、40℃和50℃的不同溫度下藤黃微球菌HN-2-11的存活率對過氧化氫的不同濃度0.5％和1.0％作圖獲得的圖；圖3為在40℃下藤黃微球菌HN-2-11的存活率對過氧化氫的不同濃度0.1％、0.25％、0.5％、0.75％和1.0％作圖獲得的圖；圖4為在50℃下藤黃微球菌HN-2-11的存活率過氧化氫的不同濃度0.1％、0.25％、0.5％、0.75％和1.0％作圖獲得的圖。
現(xiàn)在詳細說明本發(fā)明的推薦實施例，其實例在附圖中進行了說明。
本發(fā)明的新微生物為KCTC 8770P，為抗過氧化氫并對過氧化氫濃度顯示線性存活曲線的藤黃微球菌HN-2-11。
用篩選方法在本發(fā)明申請人的半導體制造工廠(三星電子公司)中安裝的超純水管道上分離抗過氧化氫的微生物獲得該微生物。委托KAIST(南朝鮮先進科學技術研究院)附屬的基因銀行鑒定和分析該分離并鑒別的藤黃微球菌HN-2-11。通過研究微生物對過氧化氫的抗性、存活率和抗性機制完成了本發(fā)明。
在用過氧化氫滅菌的條件下，從存活的微生物中篩選出新微生物，因此證明它具有過氧化氫抗性，并對過氧化氫濃度顯示出按比例增加的存活率。該新微生物實際上可用來建立過氧化氫滅菌方法的標準。
實施例1微生物的篩選在本發(fā)明申請人的半導體制造工廠(三星電子公司)中安裝的超純水管道上，在最后超濾出來的離子水和水槽中的去離子水里生存的微生物中篩選抗過氧化氫的微生物。
將滅菌的營養(yǎng)肉湯加入從上述超純水管道上取出的去離子水中，濃度為去離子水量的1/100和1/10,000。將水中的營養(yǎng)肉湯于30℃培養(yǎng)3天。將1％的過氧化氫加入培養(yǎng)液后于30℃1小時，將其在NB/100瓊脂培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)3天。在NB/100瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌落分別在NB/10和NB/100瓊脂培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)3次，以篩選單一的菌落。如此第一次篩選的25個菌株分別在NB/100和NB/10瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-30小時。把培養(yǎng)的微生物的濃度控制在108/毫升，于30℃用1％過氧化氫處理。定量分析在過氧化氫處理下按照時間的微生物存活率。分析的動力學參數(shù)為滅活速率常數(shù)(單位h-1)和D-值(單位h)。
為了檢驗微生物對過氧化氫的抗性，微生物在旋轉式搖床上培養(yǎng)，用0.1N磷酸鹽緩沖液(pH7)稀釋為108CFU/毫升。將30ml稀釋的微生物懸液置于50ml錐形管中，加入各個濃度(按體積百分比計)的過氧化氫。將錐形管置于30℃恒溫的水浴中，按一定的時間間隔取出反應溶液，測定存活的微生物數(shù)。反應溶液用生理鹽水稀釋，并在營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，以計算菌落形成單位。下文的所有抗性試驗均用上述相同的方法進行。滅活速率常數(shù)表示每單位小時微生物存活的程度，用以下公式1和公式2定量定義。N2/N1＝e-kt其中，N1和N2分別為t1和t2下存活的微生物數(shù)。k＝-In(N2/N1)/(t1-t2)其中，N1和N2分別為t1和t2下存活的微生物數(shù)。
D-值(單位h)為減少存活的微生物數(shù)所需的時間，用以下公式3進行定量定義，它可以做為指示菌的特性參數(shù)。D＝-In(N2/N1)/k，N2/N1＝1/10其中，N1和N2分別為t1和t2下存活的微生物數(shù)。
第二次，從第一次篩選的25個菌株中篩選出6個對過氧化氫具有強抗性的菌株。表1顯示了它們的過氧化氫抗性。
表1.從超純水中存活微生物中取出的6個抗過氧化氫菌株的特性
在6個菌株中，將對過氧化氫抗性最強的HN-2-11選為低溫下用過氧化氫滅菌的指示菌。將HN-2-11作為KCTC 8770P委托給KAIST(南朝鮮科學技術研究院)附屬的基因銀行。實施例2菌株(microorganism host)特性的研究和分析對過氧化氫抗性最強的HN-2-11在NB/100瓊脂培養(yǎng)基中的數(shù)量大大增加，表現(xiàn)出最大比例的生長率1.2448h-1，生物量加倍時間為33.4分鐘。HN-2-11也表現(xiàn)出過氧化氫處理下的可重復的線性半對數(shù)存活曲線。HN-2-11的這些特性證明它適于作為低溫下用過氧化氫滅菌的指示菌。
用生物鑒定系統(tǒng)鑒定菌株后，HN-2-11似乎既可劃歸節(jié)桿菌屬和又可劃歸微球菌屬。考慮到圖1所示的形態(tài)學特征和生態(tài)學特征，HN-2-11鑒定為藤黃微球菌，因此，它命名為藤黃微球菌HN-2-11。
在NB/100瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)18小時的藤黃微球菌HN-2-11表面的顯微照片中，藤黃微球菌HN-2-11覆蓋著連接菌體、具有長0.4μm突起的聚合物。
實施例3通過生長步驟分析藤黃微球菌HN-2-11對過氧化氫的抗性藤黃微球菌HN-2-11的過氧化氫處理在30℃、40℃和50℃的不同溫度下進行，對藤黃微球菌HN-2-11使用的過氧化氫濃度由1.5％變?yōu)?％。圖2顯示了藤黃微球菌HN-2-11的存活率。
在30℃用1％過氧化氫處理時，藤黃微球菌HN-2-11表現(xiàn)的滅活速率常數(shù)為0.9936。1小時后38％的初始微生物存活，而2小時后22％的微生物存活。結果發(fā)現(xiàn)，目前的方法-于30℃用1％過氧化氫滅菌1小時實際上對半導體制造工廠的超純水管道中生存的微生物沒有用。從過氧化氫處理的去離子水管道上獲得同樣的結果。
藤黃微球菌HN-2-11用過氧化氫于40℃和50℃處理時，隨著溫度的升高，滅活速率常數(shù)也相應地提高。
圖3表明藤黃微球菌HN-2-11于40℃，在0.1％、0.25％、0.5％、0.75％和1％的不同過氧化氫濃度下作圖的存活曲線。藤黃微球菌HN-2-11在所有過氧化氫濃度下都表現(xiàn)出線性半對數(shù)存活曲線。各個過氧化氫濃度的滅活速率常數(shù)為0.9169(0.1％)、1.005(0.25％)、1.5874(0.5％)、2.443(0.75％)和3.080(1％)。證明用0.25％過氧化氫于40℃滅菌比用1％過氧化氫于30℃滅菌更有效。用1.0％過氧化氫于40℃滅菌時，滅活速率常數(shù)為3.808，而D-值為0.6h(36分鐘)。它意味著通過1小時滅菌，消滅大約97％的微生物。理論上，在滅菌1小時49分鐘后，消滅了99.999％的微生物，而在滅菌2小時后，消滅了99.99951％的微生物。
表2顯示了藤黃微球菌HN-2-11用1％過氧化氫于40℃滅菌時依賴于生長周期的滅活速率常數(shù)和D-值。
表2.藤黃微球菌HN-2-11用1％過氧化氫于40℃滅菌時依賴于生長周期的滅活速率常數(shù)和D-值
圖4表明藤黃微球菌HN-2-11于50℃，在0.1％、0.25％、0.5％、0.75％和1％的不同過氧化氫濃度下作圖的存活曲線。藤黃微球菌HN-2-11在所有過氧化氫濃度下都表現(xiàn)出線性半對數(shù)存活曲線。各個過氧化氫濃度的滅活速率常數(shù)為18.7478(0.1％)、28.415(0.25％)、53.916(0.5％)、86.076(0.75％)和221.380(1％)。證明用0.1％過氧化氫于50℃滅菌消滅該菌的效力為用1％過氧化氫于30℃滅菌的19倍。用0.1％過氧化氫于50℃滅菌時，滅活速率常數(shù)為18.7478，而D-值為0.123h(7.4分鐘)。它意味著通過30分鐘的滅菌，消滅大約99.997％的微生物。理論上，在滅菌22.1分鐘后，可以消滅99.999％的微生物，而在滅菌1小時后，可以消滅99.9999999928％的微生物。
實施例4各個生長期的藤黃微球菌HN-2-11抗過氧化氫的機制與藤黃微球菌HN-2-11的抗過氧化氫機制有關的酶包括過氧化氫酶、過氧化物酶、過氧化物歧化酶。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、谷胱甘肽還原酶等。當氧化壓力(諸如過氧化氫等)誘導產生消除氧自由基的酶時，啟動該機制。藤黃微球菌HN-2-11在靜止生長期產生大量的過氧化氫酶，該過氧化氫酶被認為是部分決定著依賴于生長周期的對過氧化氫的抗性?？梢詮奶冱S微球菌HN-2-11培養(yǎng)溶液的上清液中獲得過氧化氫酶，上清液用高速離心機以3,000rpm以上的轉速分離。然后過氧化氫酶通過諸如鹽析和超濾等常規(guī)的過濾方法進行濃縮。
從滅菌前藤黃微球菌HN-2-11表面的顯微照片中可以看出，連接菌體的聚合物覆蓋著在NB/100瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時、處于靜止生長期的微生物，而菌體具有長0.4μm的突起。如果用過氧化氫處理，微生物表面的聚合物消失，存活率降低。因此，這些聚合物被認為具有抗過氧化氫的功能。
表3顯示藤黃微球菌HN-2-11與其它已知微生物之間滅活速率常數(shù)和D-值的比較。如表3所示，藤黃微球菌HN-2-11的滅活速率常數(shù)相當?shù)停鳧-值非常高。表3.藤黃微球菌HN-2-11與其它已知微生物之間滅活速率常數(shù)和D-值的比較。
因此，新微生物藤黃微球菌HN-2-11具有抗過氧化氫的機制，并表現(xiàn)出對滅菌溫度和過氧化氫濃度的線性半對數(shù)存活曲線。在必須無菌的設備中(諸如半導體制造工廠中的超純水管道等)，它可以作為建立滅菌標準的有用的指示菌。借助于本發(fā)明可以發(fā)現(xiàn)適當?shù)臏缇椒ā?br> 本領域技術人員會清楚地看出，在本發(fā)明的抗過氧化氫新微生物中可以作出多種修改和變化，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，如果它們在所附的權利要求書及其等價物的范圍內，本發(fā)明將包括這些本發(fā)明的修改和變化。
權利要求
1.藤黃微球菌HN-2-11，它抗過氧化氫并且是對過氧化氫濃度表現(xiàn)出線性存活曲線的微生物。
2.建立滅菌的方法，用權利要求1的藤黃微球菌HN-2-11作為指示微生物，通過研究它在不同的過氧化氫濃度和滅菌溫度下的存活率，建立尤其是可用于超純水管道的適當?shù)臏缇椒ā?br> 3.藤黃微球菌HN-2-11的表面聚合物，它是由權利要求1的新微生物藤黃微球菌HN-2-11在靜止生長期產生的并具有抗過氧化氫的機制。
4.過氧化氫酶，它是由權利要求1的新微生物藤黃微球菌HN-2-11產生的并具有抗過氧化氫的機制。
全文摘要
本發(fā)明提供對過氧化氫濃度表現(xiàn)出線性存活曲線的新微生物,以建立用過氧化氫滅菌的標準。新微生物—藤黃微球菌HN－2—11具有抗過氧化氫的機制,并對過氧化氫濃度表現(xiàn)出線性半對數(shù)存活曲線。
文檔編號C02F3/34GK1191897SQ9711734
公開日1998年9月2日 申請日期1997年8月8日 優(yōu)先權日1997年2月25日
發(fā)明者金仁燮, 金承彥, 劉南姬, 李順榮 申請人:三星電子株式會社