專利名稱：環(huán)境凈化用的新微生物及其方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的微生物，它能有效降解有機鹵代化合物例如三氯乙烯，并涉及一種降解有機鹵代化合物的方法，特別是土壤、地下水或廢水中的三氯乙烯。
背景技術：
近年來，工業(yè)上使用有機溶劑，通過在國家的許多部分丟棄這些化合物或含有這些化合物的廢水，已產生環(huán)境污染問題。尤其是有機氯代化合物產生的土壤污染是一種重要的社會問題，恢復污染土壤的技術已變得更為必要。凈化污染土壤的方法包括物理方法和生物方法。
物理方法包括空氣-剝脫法(即凈化的空氣進入挖出的污染土壤中使含在其中的有機氯代化合物揮發(fā)出來，并通過活性炭的吸收而除去它們的一種方法)，真空提取法(即將管子插入污染的土壤中以產生降壓的狀態(tài)使有機氯代化合物揮發(fā)出來并從土壤中提取。然而這些方法需要大量的動力以凈化空氣等等，并且有以下缺點，前者需要挖出土壤，后者在低濃度的污染物中提取效率低。凈化過程不能順利進行。此外這兩種方法只是將污染物質吸附到活性炭上，所以需要另一種方法解除污染物質的毒性。
最近已經報導了正在發(fā)展中的生物處理方法，它利用微生物的能力降解物質，并且能完全降解或解除污染物質的毒性，此外與物理方法相比，處理時只需較少的能量。而且生物方法即使在低濃度的污染物中也可以凈化，因此做為一種低費用的土壤凈化方法，希望是很大的。已知的生物方法包括固相處理法(挖出的土壤與磷、氮、微生物等混合以促進微生物降解污染物)。稀泥處理法(挖出的土壤與水、磷、氮微生物等混合以液體形式處理以提高微生物凈化污染物的速度)、原位(on-site)處理法(甲烷、空氣、磷、氮被注射進土壤，而并不把土壤挖出，以促進微生物降解污染物)。
在傳統(tǒng)使用的生物處理方法中，固相處理方法和稀泥處理方法需要挖出土壤，此外只有很窄的應用范圍，處理和設備的費用相對較高。
另一方面，在原位處理法中，由于使用土生土長微生物做為降解者，與上述方法相比在處理和設備上較為便宜，并能應用于一種較寬的范圍之內。但是由于處在土壤中微生物的絕對數量很少的條件下，原位處理法的凈化速率降低。尤其在難以降解的化合物的情況下，例如有機鹵代化合物，當土壤中沒有成活的微生物能夠降解所說的污染物時，凈化是不可能的。在這種情況下，為了提高土壤凈化的速率，我們認為把有能力降解有機鹵代化合物的微生物接種到土壤中是有必要的。
已知能降解三氯乙烯的微生物包括發(fā)孢甲基彎菌OB3(日本未審查專利公開(Kohyo)號，4(1992)-501667，日本未審查專利公開號，5(1993)-212371)，和發(fā)孢甲基彎菌TUKUBA(日本未審查專利公開號，2(1990)-92274，日本未審查專利公開號，3(1991)292970)，它是能降解甲烷的生物體，惡臭假單胞菌F1(日本未審查專利公開號，64(1989)-34499)，惡臭假單胞菌BH(Fujita et al化學工程，39(6)494-498，1994)，惡臭假單胞菌UC-R5，UC-P2(日本未審查專利公開號No．62(1987)-84780)，惡臭假單胞菌KWI-9(日本未審查專利公開號，6(1994)-70753)，門多薩假單胞菌KR1(日本未審查專利公開號，2(1990)-503866，5(1993)-502593)，洋蔥假單胞菌G4(日本未審查專利公開號，4(1992)-502277)、洋蔥假單胞菌KK01(日本未審查專利公開號，6(1994)-296711)，它屬于假單胞菌屬，真養(yǎng)產堿桿菌JMP134(A．R．Harker，應用和環(huán)境微生物學，56(4)1179-1181，1990)，真養(yǎng)產堿桿菌KS01(日本未審查專利公開號，7(1995)-123976)，歐洲亞硝化單胞菌(D．Arciero et al.，生物化學與生物物理研究通訊，159(2)640-643，1989)它是一種氨-氧化細菌，棒狀桿菌J1(日本未審查專利公開號，8(1996)-66182)和其它等等。
這些已知微生物三氯乙烯的降解能力不是非常高，這些微生物的大部分只在液體培養(yǎng)基中能降解5ppm的三氯乙烯。此外，因為在特異環(huán)境如土壤中，三氯乙烯的降解能力是必需的，所以用于生物修復的微生物有必要不僅有足夠降解三氯乙烯的能力，而且即使在土壤中也能保留三氯乙烯的降解能力。然而，已知微生物的大部分其中方面沒有足夠能力。
已報道洋蔥假單胞菌KK01在液體培養(yǎng)基中能降解起始濃度在30ppm至15ppm的三氯乙烯，在土壤中能降解起始濃度在5ppm至1ppm的三氯乙烯(日本未審查專利公開號，6(1994)-296711)。此外，已報道真養(yǎng)產堿桿菌KS01在液體培養(yǎng)基中能降解起始濃度在50ppm至低于檢測水平以下的三氯乙烯，在土壤中能降解起始濃度在1ppm至低于檢測水平以下的三氯乙烯(日本未審查專利公開號，7(1995)-123976)。
已經確認這些微生物比傳統(tǒng)微生物有更高的降解能力，這些能力即使在土壤中也能表現(xiàn)出來。然而為了誘導這些微生物的降解能力，則需要向土壤中添加至少一種或多種芳香化合物。但是芳香化合物本身是污染物，所以有引起二次污染的危險。對實際應用來說，這是一種需要解決的大挑戰(zhàn)，所以要獲得一種微生物，或者當芳香化合物加入時它能使芳香化合物完全降解并隨三氯乙烯一起去除，或者允許不添加芳香化合物而把三氯乙烯降解掉。
相應地，為了把三氯乙烯的生物凈化推向實際應用，有必要獲得一種微生物，它有高的降解能力，并且當加入芳香化合物時，能使芳香化合物完全降解并隨三氯乙烯一起去除，或者允許不添加芳香化合物而把三氯乙烯降解掉。
此外，在很多情況下，升高微生物的濃度至與所需處理能力相當的水平是很困難的，因為原生動物的捕食和土生土長微生物的競爭效應，在土壤中彌散微生物的濃度被抑制得很低。為了增加濃度許多方法被實施，例如把空氣和營養(yǎng)泵入土壤的壓力法。但是盡管需要大量的能量，單獨這些方法很難提高細菌的濃度，因此微生物的降解能力維持在很低的水平。在封閉的系統(tǒng)例如反應器和開放系統(tǒng)中，為了保持高的細菌濃度，大量的能量是必需的，例如補充營養(yǎng)物、充氣等等。
如果每單位量細菌的降解能力升高，那么即使在低的細菌濃度下也可獲得足夠的降解能力，這樣避免了為了保持細菌的濃度而投入大量能量的需要。通過表達能降解這些物質的酶，微生物可以降解三氯乙烯，酶的表達需要誘導物。已知在培養(yǎng)時加入誘導物并使微生物與所說誘導物相接觸，微生物表現(xiàn)出降解能力，但是以前的研究從未關注過接觸時間的長度和增加每單位量細菌降解能力的方法。
包含擴散三氯乙烯-降解微生物進入土壤以影響三氯乙烯降解等的生物-擴增(Bio-augmentation)目前很難得到社會接受，因為釋放特異的微生物進入環(huán)境就有對生態(tài)系統(tǒng)產生難以控制的影響的潛在危險性。但是噴灑經滅菌處理已完全喪失繁殖能力的微生物只相當于噴灑有機物質，因此被認為對生態(tài)系統(tǒng)幾乎沒影響，在日本審查后專利公開號，8(1996)-3012公開的發(fā)明聲稱通過把降解細菌壓碎，然后灑進土壤可以最大程度減少對生態(tài)系統(tǒng)不合需要的影響。但是應很容易理解的是微生物的壓碎過程需要廣泛的設備，大量的時間和勞動力，因此實際上噴灑大量降解細菌進入污染的土壤將十分困難。
上述發(fā)明通過贊揚壓碎的細菌比完整的細菌更易滲透進土壤來進一步列舉有利影響，但所說發(fā)明并未提及壓碎后細菌所保留的降解能力的持久性。而且已知的三氯乙烯-氧化酶需要NAD做為輔酶。因為輔酶十分昂貴，因此提供輔酶至一定濃度將極為困難，此濃度對壓碎細菌后從細菌中釋放出的酶的降解反應是必需的。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的是提供新的微生物，它能比傳統(tǒng)已知的微生物以更有效的方式降解有機鹵代化合物例如三氯乙烯，并提供一種利用所說微生物降解有機鹵代化合物的方法。本發(fā)明另一種目的是提供一種便宜的方法使得特定微生物釋放到環(huán)境中后將它對生態(tài)系統(tǒng)的影響減至最小。
為了解決上述提到的問題，在廣泛研究后發(fā)明者成功分離了一種新的微生物，它不屬于已知微生物種類中的任一種，與傳統(tǒng)已知微生物中任一種相比有很高的降解三氯乙烯的能力，所以完成了本發(fā)明。
這樣本發(fā)明提供一種細菌，它有以下分類學特性表1形態(tài) 球形，桿狀革蘭氏染色 +孢子形成 -運動性 -與氧的關系 需氧的氧化酶檢測 -過氧化氫酶檢測 +抗酸性 -桿-球循環(huán)+空氣中菌絲體形成 -細胞壁的肽聚糖類型 內消旋-二氨基庚二酸羥乙?；?Glycolyl)檢測 -(乙酰基類型)霉菌酸 -主要的類異戊二烯醌類 MK-9，MK-9(H2)(痕量)DNA中GC含量(mole％) 73(通過HPLC)而且可以降解三氯乙烯。此細菌的一種代表菌株是菌株MO7(FERMBP-5624)。
本發(fā)明進一步提供一種方法用以降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物，所說的方法包括允許所說的細菌作用于所說的有機鹵代化合物或／和芳香化合物。其中情況下，有機鹵代化合物主要是三氯乙烯，芳香化合物優(yōu)選酚。
本發(fā)明進一步提供一種方法用于在含有有機鹵代化合物的土壤、廢水、或其它廢物中降解有機鹵代化合物，該方法包括把所說細菌的培養(yǎng)物加到土壤、廢水或其它廢物中。就實際應用而言，其中重要的有機鹵代化合物是三氯乙烯。
用其中的細菌培養(yǎng)物優(yōu)選培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)的細菌團，可以是活著的細菌團，或是無菌的細菌團。
本發(fā)明也提供一種方法用于降解含有有機鹵代化合物的土壤、廢水或其它廢物中的有機鹵代化合物，所說的方法包括接種本發(fā)明的細菌到該土壤、廢水、或其它廢物中，加入一種芳香化合物或一種可降解的碳源或它們的混合物到該土壤、廢水或其它廢物中，然后培養(yǎng)所接種的微生物。其中所用的芳香化合物優(yōu)選酚的化合物，例如酚，可降解的碳源其中優(yōu)選糖類，例如葡萄糖。
本發(fā)明也提供一種方法用以降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物，其中能夠降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的一種微生物無菌化培養(yǎng)的細菌團，允許作用于該有機鹵代化合物或芳香化合物。本發(fā)明也提供一種方法用以降解含有有機鹵代化合物和／或芳香化合物的土壤，廢水、或其它廢物中的有機鹵代化合物和／或芳香化合物，其中能夠降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的一種微生物無菌化培養(yǎng)的細菌團加入到所說的土壤、廢水、或其它廢物中。上述方法中，所說的無菌化處理可以是，例如紫外線照射。
本發(fā)明也提供了一種有機鹵代化合物和／或芳香化合物的降解物，該降解物包括本發(fā)明細菌的培養(yǎng)細菌細胞。該細菌團可以是成活的細菌團或滅菌化的細菌團。它們的滅菌化處理可以是，如紫外照射。從儲存的角度來看，該降解物中所含的細菌團優(yōu)選是干燥或冷凍形式的細菌團。
附圖簡述

圖1表明本發(fā)明的MO7菌株在用NJ(鄰近結合)方法所構建的種系發(fā)生樹中的位置。
圖2表明本發(fā)明的MO7菌株在用UPGMA(平均距離)方法所建的種系發(fā)生樹中的位置。
圖3圖示使用本發(fā)明的MO7菌株，表明三氯乙烯的初始濃度對降解速率的影響。
圖4圖示使用本發(fā)明的MO7菌株，表明pH對三氯乙烯(初始濃度30ppm)降解速率的影響。
圖5圖示使用本發(fā)明的MO7菌株，表明溫度對三氯乙烯(初始濃度30ppm)降解速率的影響。
圖6圖示使用本發(fā)明MO7菌株的死亡細菌細胞(用紫外線照射滅菌)，表明三氯乙烯的初始濃度對三氯乙烯(30ppm的初始濃度)降解速率的影響。
圖7圖示使用本發(fā)明MO7菌株的滅菌(用紫外線照射)和未滅菌培養(yǎng)的細菌細胞表明正在降解的三氯乙烯殘存活性的時間過程。
圖8圖示表示當本發(fā)明的MO7菌株培養(yǎng)在含有酚和三氯乙烯的培養(yǎng)基中時的生長曲線(OD)，酚消耗的時間過程和三氯乙烯的降解速率。
圖9是圖示表示當本發(fā)明的MO7菌株培養(yǎng)在含有酚的培養(yǎng)基中時的生長曲線(OD)和酚消耗的時間過程。
圖10圖示表明依照圖9所設定的培養(yǎng)時間過程中，細菌被培養(yǎng)不同時間后由每單位細菌細胞(OD=1．0)產生的特定的三氯乙烯的降解速率。
圖11圖示依照圖9所提出的培養(yǎng)時間過程中，細胞被培養(yǎng)不同時間后由全部細菌細胞產生的三氯乙烯的降解速率。
圖12圖示當本發(fā)明的MO7菌株培養(yǎng)在含酚(500ppm)的培養(yǎng)基中，當酚消耗完畢后加酚繼續(xù)培養(yǎng)時的生長曲線(OD)和酚消耗的時間過程。
圖13圖示在依照圖12所提出的培養(yǎng)時間過程中，當細胞被培養(yǎng)不同時間后由每單位細菌細胞(OD=1．0)所產生的三氯乙烯的特定降解速率。
圖14圖示在圖12的培養(yǎng)時間過程中，當細胞被培養(yǎng)不同時間后由全部細菌細胞產生的三氯乙烯的降解速率。
圖15圖示通過把本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌細胞加入含有三氯乙烯的土壤中，當三氯乙烯被降解時，細菌細胞的量和被降解的三氯乙烯的量之間的關系。
圖16圖示把本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌細胞加入一次和二次時被降解的三氯乙烯的量。
圖17圖示通過加入本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌團，當三氯乙烯被降解時，在土壤中三氯乙烯不同初始濃度下，接種的細菌細胞的量和三氯乙烯降解速率之間的關系。
圖18圖示通過加入本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌細胞至含有三氯乙烯的土壤中，當三氯乙烯被降解時，土壤中殘存的三氯乙烯的時間過程。
圖19示氯乙烯、1，1-二氫乙烯、順式-1，2-二氯乙烯和反式-1，2-二氯乙烯的分析方法流程圖。
圖20示二氯乙酸和三氯乙酸的分析方法流程圖。
圖21示三氯乙醇分析方法流程圖。
圖22示水合氯醛分析方法流程圖。
圖23圖示通過加入本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌細胞或其滅菌產物到含有三氯乙烯的土壤中，當三氯乙烯被降解時的結果。
圖24圖示通過加入本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌細胞至含有三氯乙烯的土壤中，當三氯乙烯被降解時，溫度對三氯乙烯降解速率的影響。
圖25圖示通過把本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌細胞的少量以及誘導劑(酚)加入到含三氯乙烯的土壤中，當三氯乙烯被降解時得到的結果。
圖26圖示通過把本發(fā)明的MO7菌株所培養(yǎng)的細菌群體或生長在谷氨酸上的MO715菌株加入到含三氯乙烯土壤中，當三氯乙烯被降解時得到的結果。
詳細說明本發(fā)明的一種有代表性的細菌菌株MO7可以以下列方式分離。例如，分離的來源如土壤或活性污泥培養(yǎng)在含酚的培養(yǎng)基中，在其中繁殖的微生物得到分離。分離物接下來孵育在含有三氯乙烯的培養(yǎng)基中以選擇有能力降解三氯乙烯的微生物。微生物分離的方法在實施例1中得到詳細說明。
分離的MO7菌株有以下分類學特性表2形態(tài) 球形，桿狀革蘭氏染色 +孢子形成 -運動性 -與氧的行為 需氧的氧化酶檢測 -過氧化氫酶檢測 +抗酸性 -桿-球循環(huán)+空氣中菌絲體 -細胞壁的肽聚糖類型 內消旋-二氨基庚二酸羥乙?；鶛z測 -(乙?；愋?霉菌酸 -主要的類異戊二烯醌類 MK-9，MK-9(H2)(痕量)細胞DNA中GC含量(摩％)73(通過HPLC)
而且MO7菌株有以下特性菌落的顏色 無特征性菌落顏色形成菌落周圍細胞的延伸 -細胞壁的阿拉伯半乳聚糖聚合物-(#1)#1使用整個細菌團的一種酸水解產物來評估調查了MO7菌株的形態(tài)學和生理學特征，得到的結果顯示于表2。根據上述描述的結果，依據出版物(N．R．Krieg和J．G．Holt，“Bergy’s系統(tǒng)細菌學手冊”，第1卷(1984)，Williams和Wilkins；J．G．Holt，N．R．Krieg，P．H．A．Senath，J．T．Staley和S．T．Williams，“Bergy’s系統(tǒng)細菌學手冊”，第9版(1984)，Williams和Wilkins)，進行菌株的鑒定，得到的結果是分離出的MO7菌株與任何已知的屬或種類并不一致。又克隆了16S rRNA基因，它的序列與已知微生物的序列相比較發(fā)現(xiàn)最近的相關者是顯示于圖1和2中的腫大地桿菌。然而即使是這個生物體最多只有95％的同源性，因此可以斷定分離的菌株不屬于該種類。因此本發(fā)明的細菌菌株被證實為一種新的種類，它不同于任何已知的細菌。
在本發(fā)明的方法中，通過允許本發(fā)明的細菌作用于有機鹵代化合物和／或芳香化合物使有機鹵代化合物和／或芳香化合物被降解。被本發(fā)明細菌降解的有機鹵代化合物包括三氯乙烯，二氯乙烯和氯乙烯。從實際來看，三氯乙烯是最重要的，就芳香化合物而言有酚類化合物，例如酚。
根據本發(fā)明的一種實施方案，提供了一種方法用于降解土壤、廢水、或其它廢物中的有機鹵代化合物，該方法包括把本發(fā)明的細菌培養(yǎng)物加到土壤、廢水或其它廢物中。細菌培養(yǎng)物其中包括培養(yǎng)本發(fā)明細菌得到的培養(yǎng)物液體，從該培養(yǎng)物液體中分離的細菌團，或存在于培養(yǎng)液體中的滅菌細菌，或分離的滅菌的培養(yǎng)細菌團。
對于本發(fā)明細菌的培養(yǎng)，該細菌能夠繁殖的任何培養(yǎng)基都可以使用。培養(yǎng)基可以包括碳源，如葡萄糖或蔗糖，一種有機氮源，例如酵母提取液、蛋白胨、或肉汁提取液，或一種無機氮源如銨鹽或硝酸鹽。也可以含有無機鹽包括陽離子如鉀離子，鈉離子、鈣離子、或鎂離子，陰離子如氯離子，硫酸根離子，磷酸根離子。碳源的濃度依照細菌種類在大約0．1％-1％的范圍內變化，氮源的濃度依照細菌種類大約在0．01％-1％的范圍內變化。無機鹽的濃度依照細菌種類在大約0．001％-1％的范圍內變化。
培養(yǎng)優(yōu)選通過有氧的液體培養(yǎng)來進行。有氧的條件可以通過傳統(tǒng)方法來確保，例如充氣、攪拌、充氣和攪拌、或振蕩。為了誘導有機鹵代化合物三氯乙烯和芳香化合物如酚的降解能力，最好把芳香化合物如酚加到培養(yǎng)基中。在這種情況下，芳香化合物如酚，可以在除了別的碳源以外加入，也可以做為唯一的碳源來加入。加入到培養(yǎng)基中酚的量優(yōu)選在大約100ppm到1000ppm的范圍內。
在一些情況下，本發(fā)明的微生物可以以細菌團的形式使用，該細菌團可以通過傳統(tǒng)分離細菌細胞的方法來分離，例如離心。當細菌團使用之前儲存時，可以轉換成冰凍或干燥形式的細菌團。在這種情況下，干燥細菌團的傳統(tǒng)方法可以采用，例如冰凍干燥或噴霧干燥。在本發(fā)明的實際應用中，為了最大程度減小對環(huán)境(微生物相)的影響，可以使用滅菌培養(yǎng)物或滅菌細菌。為了此目的而滅菌的方法中，可以采用傳統(tǒng)的方法例如紫外線照射成活的細菌。這樣滅菌的細胞或培養(yǎng)物也可以包括在本發(fā)明所定義的“培養(yǎng)物”中。
當把本發(fā)明的培養(yǎng)物加到要處理的受體時，成活的細菌優(yōu)選以每克要處理的受體加入106-109個細胞的量，或者有相應降解有機鹵代化合物能力的滅菌細菌。
作為一種方法以允許本發(fā)明的微生物作用于有機鹵代化合物如三氯乙烯，為了降解固體如土壤、液體例如廢水(其中引用做為要處理的對象)中所含的有機鹵代化合物，只需把本發(fā)明的培養(yǎng)物加到或與要處理的對象混合。
根據本發(fā)明另一實施方案，通過把本發(fā)明的微生物接種到要處理的對象，例如土壤、廢水、或其它廢物中，然后允許該有機體在其中繁殖，含在要處理對象中的有機鹵代化合物例如三氯乙烯可以被降解。因此本發(fā)明也提供一種方法降解含有有機鹵代化合物的土壤、廢水或其它廢物中的有機鹵代化合物，該方法包括接種本發(fā)明的細菌至土壤、廢水和其它廢物中，加入一種芳香化合物，一種可降解的碳源或它們的混合物到土壤、廢水或其它廢物中，然后培養(yǎng)接種的微生物。
在這種情況下，糖類例如葡萄糖優(yōu)選做為可降解的碳源。相對于要處理對象的量而言，碳源的量大約是0．1％-1％。此外當一種芳香化合物加入要處理的對象時，該芳香化合物需要被加入。作為一種芳香化合物，酚，甲苯酚以及諸如此類可以使用。在這種情況下，有機鹵代化合物降解以后，加入的芳香化合物還有剩余，那將引起另一種環(huán)境污染。所以芳香化合物過多量的加入并不是必需的，相對于要處理的對象，加入芳香化合物的量優(yōu)選大約100至500ppm。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，照以上說明制備的本發(fā)明培養(yǎng)細菌團，不管是成活還是滅菌的細菌團，都保存降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的能力。因此，本發(fā)明提供一種方法用以降解含有有機鹵代化合物和／或芳香化合物的土壤、廢水或其它廢物中的有機鹵代化合物和／或芳香化合物，其中能夠降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的微生物滅菌的培養(yǎng)細菌團加入到該土壤、廢水或其它廢物中。
所使用的滅菌方法包括紫外線照射、環(huán)氧乙烷處理、放射、以及諸如此類的方法。滅菌產物有一種出人意料的特性，即在儲存過程中對其降解有機鹵代化合物的能力而言有更高的穩(wěn)定性。
本發(fā)明也提供了一種有機鹵代化合物和／或芳香化合物的降解物，該降解物包括本發(fā)明的細菌培養(yǎng)物。培養(yǎng)物優(yōu)選一培養(yǎng)細菌團，它可以是成活細菌團或滅菌細菌團。滅菌處理可以由紫外線照射、環(huán)氧乙烷處理、放射或上述描述的其它方法來施行。從儲存的觀點來看，本發(fā)明的降解物優(yōu)選選擇冷凍或干燥形式，依照上述提到的傳統(tǒng)方法可以得到干燥產物。
菌株MO715，本發(fā)明的一種代表性的突變(其中做為一種組成性的突變體來引用)，在誘導三氯乙烯降解時并不需要芳香化合物(例如酚)，它可以依照下列方法分離通過紫外線、放射或有突變活性的化學物質如亞硝基胍的作用使MO7菌株突變，基本突變體從產生的突變體中選擇。微生物分離的方法在實施例18中有詳細說明。
本發(fā)明組成性突變體的培養(yǎng)可以依照母本菌株MO7同樣的方式來施行，除了前者的培養(yǎng)并不需要芳香化合物來誘導降解三氯乙烯的能力。培養(yǎng)所用的可降解的碳源優(yōu)選選擇糖類如葡萄糖或氨基酸如谷氨酸。使用的方法也與母本菌株MO7完全相同除了前者的培養(yǎng)不需要芳香化合物來誘導降解三氯乙烯的能力。應當注意的是就降解有機鹵代化合物的能力而言，其成活細菌或滅菌細菌有和母本菌株MO7同樣的效果。
上述微生物菌株MO7已根據布達佩斯條約的章程于1996年8月12日國際保藏于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-5624。而上述的微生物菌株MO715，也已根據布達佩斯條約的章程，國際保藏于通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學和人體技術研究所，保藏號FERM BP-5928。
實施例參考以下實例本發(fā)明將更易理解，然而這些實例只想用來說明解釋此發(fā)明，不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1．分離MO7菌株并對其16S rDNA進行菌落與測序本發(fā)明使用的微生物以下列方法從活性污泥中分離出來的，此活性污泥來自日本愛知縣的廢水處理廠。收集的活性污泥的0．1毫升接種于含1％(體積／體積)的維生素溶液(成分顯示于表5)的6毫升NMS培養(yǎng)基中，此NMS培養(yǎng)基中加有500ppm的酚，存放于30毫升的小瓶中。
小瓶用丁基橡皮塞塞住，用鋁蓋密封。然后于30℃下，160r．p．m振蕩培養(yǎng)一段時間，可以從幾天到大約十二天。當培養(yǎng)基中觀察到混濁，即使是最輕微的混濁后，培養(yǎng)物傳代到相同的培養(yǎng)基中，接下來在振蕩中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代重復四次。第四次傳代結束后，培養(yǎng)基做適當稀釋，鋪板于瓊脂板上，此瓊脂板通過把1．5％的瓊脂加入到含有500ppm的酚的NYG培養(yǎng)基(它的組成顯示于表5)中而制備的。出現(xiàn)的菌落挑到瓊脂板上并孵育。此操作重復幾次以分離微生物。除了上述NYG培養(yǎng)基，在選擇培養(yǎng)微生物的最佳條件以后，另一種培養(yǎng)基例如營養(yǎng)培養(yǎng)基也可以使用。
表3NMS培養(yǎng)基七水硫酸鎂0．1g二水硫酸鈣0．2g硝酸鉀0．23g硫酸銨0．65g磷酸二氫鉀 0．272g十二水磷酸氫二鈉 0．727g微量元素溶液 0．5ml去離子水 1L微量元素溶液二水乙二胺四乙酸二鈉500mg七水硫酸鐵(II) 200mg七水硫酸鋅 10mg四水二氯化錳3mg硼酸30mg六水氯化鈷(II) 20mg六水氯化鎳(II) 2mg二水鉬化鈉 3mg去離子水1L*微量元素溶液分開滅菌，在其它成分滅菌以后再加入。
表4維生素溶液鹽酸硫胺素 3mg對氨基苯甲酸13mg腺嘌呤 1000mgNAD 250mg維生素B12 10mg二磷酸硫胺 100mg去離子水1L
表5NYG培養(yǎng)基酵母提取液 0．5g葡萄糖 0．18gNMS培養(yǎng)基 1L使用白金圈挑出瓊脂板上的一種菌落，分離的微生物接種進10毫升NMS培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含有0．05％的酵母提取液和500ppm的酚，放于18厘米試管中。30℃，130r．p．m振蕩培養(yǎng)5天以后，5000r．p．m離心10分鐘收獲細菌團，然后在4毫米的NMS培養(yǎng)基中重新懸浮。細菌團的懸浮液存放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯的量是使得所有成分同時溶解于液相后三氯乙烯為30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用一鋁蓋密封。30℃下過夜培養(yǎng)后，小瓶中的氣相用配有FID或ECD檢測器的氣相色譜儀分析。
從得到的結果來看，篩選出了有降解三氯乙烯高能力的細菌菌株，檢定了形態(tài)學和生理方面的特性得到顯示于表2的結果。
基于該結果，參考出版物(N．R．Krieg和J．G．Holt，“Bergy’s系統(tǒng)細菌學手冊”第一卷(1984)Williams和Wilkins，J．G．Holt，N．R．Krieg，P．H．A．Senath，J．T．Stanley和S．T．Williams，“Bergy’s系統(tǒng)細菌學手冊”第九版(1984)Williams和Wilkins)進行簽定，發(fā)現(xiàn)此菌株不屬于已知的任一種類。此菌種命名為MO7菌株，并于1996年8月12日根據布達佩斯條約的規(guī)章，國際保藏于日本通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-5624。
此外，本發(fā)明微生物的16S rDNA序列得到確定，并與已知微生物的序列相比較。結果概括如下。
依據Hiraishi(日本微生物生態(tài)學聯(lián)合會雜志Vol．10(1)31-42，1995)的方法利用PCR擴增本發(fā)明微生物的16S rDNA，PCR引物有如下堿基序列5＇-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3＇(SEQ ID NO1)，和5＇-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CGG CAG GTT-3(SEQ IDNO2)。PCR反應使用熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)依據下列程序來進行即90℃預熱30秒后，96℃，60秒／55℃，120秒／72℃，180秒，30個循環(huán)，然后72℃加熱300秒。
使用QIA quick(Quiagen)凈化擴增的PCR片段，依據Hiraishi的方法(日本微生物生態(tài)學聯(lián)合會雜志Vol．10(2)81-102，1995)進行測序，此方法直接利用PCR做為模板。用于測序反應的引物有如下堿基序列5＇-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3＇(SEQ ID NO1)、5＇-GGC CGG ACG GGT GAG T-3＇(SEQ ID NO3)、5＇-TAC GGG AGGCAG CAG-3＇(SEQ ID NO4)、5＇-CTG CCA GCA GCC GCG CG-3＇(SEQ ID NO5)，5＇-G ATT AGA TAC CCT GGT AG-3＇(SEQ ID NO6)，5＇-ACT CAA AGG AAT TGA CGG-3＇(SEQ ID NO7)、5＇-GCAACG AGC GCA ACC C-3＇(SEQ ID NO8)，或5＇-TGT ACA CAC CGCCCG T-3＇(SEQ ID NO9)。依據試劑盒中指導的步驟，使用染料終止劑循環(huán)測序試劑盒(Perkin Elmer)進行PCR反應，測序樣品進行電泳，并使用ABI 373A測序儀(Perkin Elmer)進行序列分析。通過這些程序確定的本發(fā)明微生物的16S rDNA堿基序列顯示于表6(SEQID NO10)。
表6序列1466個堿基；352A；355C；288T；467GAACGCTGGCG GCGTGCTTAA CACATGCAAG TCGAACGGTG AAGCTTGGAG CTTGCTTCGAGTGGATCAGT GGCGAACGGG TGAGTAACAC GTGAGCAACC TGCCCCAGAC TCTGGAATAAGCGCTGGAAA CGGCGTCTAA TACTGGATAT GTGACGGACC TGCATGGGTA CCGTCTGGAAAGTTTTTCGG TTTGGGATGG GCTCGCGGCC TATCAGCTTG TTGGTGAGGT AATGGCTCACCAAGGCGACA ACGGGTANCC GGCCTGAGAG GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGAAACACGGCCCAAACTC CTACGGGAGG CACCAGTGGG GAAATATTGC ACAATGGGCG AAAGCCTGATGCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCT TCGGGTTGTA AACCTCTTTC AGCAGGGAAGAAGCGAAAGT GACGGTACCT GCAGAATAAG CACCGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGGTAATACGTAG GGTGCGAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGAGCTT GTAGGCGGTTTGTCGCGTCT GCTGTGAAAA TCCGGGGCTC AACCCCGGAC TTGCAGTGGG TACGGGCAGACTAGAGTGTG GTAGGGGAGA CTGGAATTCC TGGTGTAGCG GTGAAATGCG CAGATATCAGGAGGAACACC GATGGCGAAG GCAGGTCTCT GGGCCACTAC TGACGCTGAG AAGCGAAAGCATGGGGAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCATGC CGTAAACGTT GGGCGCTAGGTGTGGGACTC ATTCCACGAG TTCCGTGCCG CAGCTAACGC ATTAAGCGCC CCGCCTGGGGCAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGCGGAGCATGCGGATT AATTCGATGC AACGCGAAGA ACCTTACCAA GGCTTGACAT ATACCGGAAACTTCCAGAGA TGGTTGCCCC CTTTGGGTCG GTATACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGCTCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTCGTT CTATGTTGCCAGCACGTCAT GGTGGGGACT CATGGAAGAC TGCCGGGGTC AACTCGGAAG AAGGTGGGGATGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGTCT TGGGCTTCAC GCATGCTACA ATGGCCGGTACAAAGGGCTG CGATACCGCA AGGTGGAGCG AATCCCCAAA AAACCGGTCT CAGTTCGGATTGGGGTCTGC AACTCGACCC CATGAAGTCG GAGTCGCTAG TAATCGCAAA TCAGCAACGCTGCGGTGAAT ACTTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CAAGTCACGA AAGTTCGGTAACACCCGAAG CCGGTGGCCC AACCCTTGTG GGGGGAGCCG TC得到的堿基序列與國立遺傳研究所(DDBJ+DDBJ NEW)的DNA信息庫中的信息進行比較，使用程序“blast”在缺少分類等級的情況下進行同源菌株研究。最初選出50個種類具有最高同源性。從它們中間那些被認為與生理分類檢測絕對不同的菌株(分支桿菌屬有產生霉菌酸的特性)被排除在外。然后對剩余的菌株以及被認為密切相關種類的類型菌株進行多次排序分析。
從得到的結果來看，使用NJ(鄰近結合)的方法(圖1)或UPGMA(平均距離)方法(圖2)(在5′-末端序列排序后進行排序分析)建立種系發(fā)生樹。最相關的生物體證實為腫大地桿菌(種系發(fā)生樹包括沉淀分枝桿菌做為參考)。相關菌株(屬于同一組的微生物)使用Genetryx-Mac 8．0再一次進行同源研究。但是即使是最相近的腫大地桿菌，其基因同源也只達到95％，判定不是相同的屬，因此，可以肯定本發(fā)明的微生物是不同于已知任何微生物的一種新微生物。
微生物降解了污染在培養(yǎng)基中約100ppm高濃度三氯乙烯的50％，在24小時內完全降解了約30ppm的三氯乙烯。為了在降解三氯乙烯時伴有微生物的繁殖，有必要把至少一種芳香化合物例如酚加入到含有三氯乙烯的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基、土壤、水等等)中。
參考下面的實例，在本發(fā)明中使用的微生物將得到更詳細的說明。
實施例2含有0．05％酵母提取液和500ppm酚的100毫升NMS培養(yǎng)基放于500毫升錐形燒瓶中，接種本發(fā)明微生物一種菌落的一白金圈菌量，此微生物通過在瓊脂板上傳代而儲存，瓊脂板是通過把1．5％的瓊脂加到含有500ppm酚的NYG培養(yǎng)基中制備的，或者接種1．0毫升預培養(yǎng)液，此預培養(yǎng)液是通過在30℃含有500ppm酚的NYG培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)本發(fā)明微生物而獲得的。30℃130r．p．m下振蕩培養(yǎng)3天，5000r．p．m離心10分鐘收獲細菌團，然后重新懸浮在與培養(yǎng)基有相同量的NMS培養(yǎng)基中。
懸浮液的OD600是0．5(細胞數是1×109c．f．u／毫升)細菌團4毫升的懸浮液放在20毫升小瓶中，三氯乙烯加入其中使得所有成分都溶于液體相后其濃度分別為10，50，或30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住并用鋁蓋密封。30℃振蕩過夜培養(yǎng)后，瓶中的氣相通常由配有ECD檢測器的氣相色譜儀來分析。
結果顯示于圖3，此微生物在24小時內完全降解三氯乙烯。50ppm和100ppm高濃度的三氯乙烯在24小時內分別降解70％和50％。即使三氯乙烯初始濃度高至50至100ppm時，本微生物所降解三氯乙烯的量與三氯乙烯初始濃度為30ppm時降解的量相比并不降低，表明在高濃度的三氯乙烯出現(xiàn)時，本微生物能抵抗降解抑制。因為還沒有報告表明高達100ppm的三氯乙烯被微生物降解，本微生物的降解能力是極高的。
實施例3照實施例2同樣方法培養(yǎng)的細菌團通過5000r．p．m離心10分鐘而收獲，然后重懸于制備的各種不同pH值的M9培養(yǎng)基(Na2HPO4·7H2O12．8克／升，KH2PO43克／升，NaCl0．5克／升，NH4Cl1．0克／升)中，其體積等于原培養(yǎng)液體。4毫升細菌團的懸浮液存放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液體相后三氯乙烯的濃度為30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用鋁蓋密封。30℃振蕩培養(yǎng)過夜后，瓶中的氣相通常由配有ECD檢測器的氣相色譜儀來分析。按圖4所顯示，結果表明在pH5或更低活力急劇下降，而在pH6至9降解速率高達100％，即使在pH10活力只略微降至90％。
因此證明MO7菌株剩余細菌降解三氯乙烯最佳pH值在6和9之間，表明在高的pH條件顯示高的降解活力。由三氯乙烯的需氧降解產生的三氯乙烯氧化物在堿性環(huán)境中自發(fā)降解，產生無害的乙醛酸。相反，在酸性條件下它自發(fā)降解產生鹵酸。因此本微生物三氯乙烯的需氧降解優(yōu)選在堿性環(huán)境中進行。本微生物對于堿性環(huán)境下降解三氯乙烯是有用的，因為它在高pH條件下顯示出高的降解能力。
實施例4照實施例2同樣方法培養(yǎng)的細菌團通過5000r．p．m離心10分鐘而收獲，然后懸浮到與培養(yǎng)液體相同體積的NMS培養(yǎng)基中。4毫升細菌團的懸浮液存放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液體相后三氯乙烯的濃度為30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用鋁蓋密封。每一組在不同溫度下于細菌培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。三氯乙烯殘存濃度通常用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析瓶中氣相來監(jiān)控。
按圖5所顯示，結果表明4℃下經過7天三氯乙烯的降解進行緩慢。在37℃下降解在一天內中止，降解速率很低。另一方面，在20℃和30℃下80％至90％在一天內被降解。但是20℃下的降解活性比30℃下高大約10％。被三氯乙烯等污染正在產生問題的地下土壤的溫度據說穩(wěn)定在15至20℃。然而在大多數關于三氯乙烯-降解的報告中，微生物的降解能力在30℃被評估，此溫度高于土壤的溫度，極少有研究表明在與土壤環(huán)境相同溫度下降解能力維持在與評估實驗相類似的水平。
因為代表微生物降解基本反應的酶反應的反應速率伴隨溫度下降10℃而降低一半，所以推測比評估實驗溫度低的土壤中的微生物的三氯乙烯降解速率要下降。在與土壤環(huán)境相同的溫度下降解能力并未有所下降，本微生物表明有高的實用特征，盡管其機制并不明了。
實施例5照實施例2同樣方法培養(yǎng)的細菌團通過5000r．p．m離心10分鐘而收獲，然后懸浮到與培養(yǎng)液體相同體積的NMS培養(yǎng)基中。細菌團的懸浮液放在佩特里細菌培養(yǎng)皿中，展開呈大約1毫米的厚度，然后在260納米波長、時間不少于60秒，距離光源40厘米的條件下用15W紫外線燈照射滅菌。4毫升細菌團的懸浮液在滅菌后放于20毫升小瓶中。加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相后三氯乙烯的濃度為30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用鋁蓋密封。30℃下振蕩培養(yǎng)，瓶中的氣相通常用配有ECD檢測器的氣相色譜儀來分析。
按圖6所顯示，結果表明滅菌后細菌團保存了成活細菌80％或更多的三氯乙烯-降解活性。此外，在實驗中，以NYG培養(yǎng)基1／100的量取出滅菌細菌團懸浮液接種或懸浮液鋪板至NYG瓊脂培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)，未觀察到培養(yǎng)液體混濁度的升高和菌落形成，因此肯定是完全滅菌。滅菌細菌懸浮液儲存于4℃時存留的活性與成活細菌團儲存三天時幾乎相同，該懸浮液比成活細菌團儲存七天時有著更高的活性。該結果表明，盡管死亡細菌的初始活性降至成活細菌團的80％，因為在儲存過程中死細菌的活性降低的更少一些，所以在儲存時保留了比成活細菌團更高的降解三氯乙烯的活性。
通過對微生物進行滅菌而沒有破壞具有細胞外環(huán)境的細菌團的邊緣結構如細胞壁，有可能保存了輔酶等等，這些輔酶在對于表達酶活性所必需的濃度下對三氯乙烯的降解反應是必需的。因此為了維持三氯乙烯降解的活性而補充輔酶是不必要的，散布培養(yǎng)的細菌是唯一所需要的。因此在最低費用和對生態(tài)系統(tǒng)最低影響下可能影響三氯乙烯等的凈化。
實施例6含有0．05％酵母抽提液和500ppm酚的4毫升pH培養(yǎng)基(組成見表8)放于20毫升小瓶中，通過從瓊脂板上挑取本微生物一種菌落的一白金圈菌量接種本微生物，此瓊脂板通過把1．5％的瓊脂加到含有500ppm酚的NYG培養(yǎng)基中而制備，或者接種0．01毫升(細菌數是106細胞／毫升)預培養(yǎng)液，此預培養(yǎng)液是通過在30℃，含有500ppm酚的NYG培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)本微生物而獲得的。
表7pH培養(yǎng)基七水硫酸鎂 0．2g硫酸鈣 0．1g六水氯化鐵 0．02g磷酸氫二鉀 1．0g硫酸銨 1．0g氯化鈉 0．1g去離子水1L加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相再同時加上接種以及500ppm酚以后三氯乙烯濃度為30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用鋁蓋密封。30℃下振蕩培養(yǎng)，三氯乙烯的濃度通常用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析瓶中氣相而測量。通過用0．45μ濾膜過濾培養(yǎng)液，往1毫升過濾液中按順序加入0．1毫升K3Fe(CN)6／0．1M甘氨酸水溶液、1毫升4-氨基安替比林水溶液，然后混合，于505納米下測量吸收值確定酚濃度。
顯示于圖8中的結果表明隨著細菌團的繁殖，酚和三氯乙烯下降，培養(yǎng)31小時后它們完全降解。因此可以肯定在有誘導三氯乙烯能力的芳香化合物如酚存在條件下繁殖時，本微生物有著高的降解三氯乙烯的活性。與已知的微生物相比，除了報道洋蔥假單胞菌KK01在2天內把30ppm的三氯乙烯降解至15ppm和報道真養(yǎng)產堿桿菌KS01(日本未審查專利公開號7(1995)-123976)在4天內完全降解50和25ppm的三氯乙烯外，所有報告都只談論到在10ppm的低濃度下降解三氯乙烯。
在由真養(yǎng)產堿桿菌(日本未審查專利公開號7(1995)-123976)降解三氯乙烯時，接種到培養(yǎng)基中微生物的量是108個細胞／毫升，相當于實施例6中敘述的本微生物的100倍。為了降解三氯乙烯所要求的本發(fā)明微生物的細菌的量遠遠少于真養(yǎng)產堿桿菌KS01。其好處是降低了培養(yǎng)的費用。也可以肯定的是加入并混合的酚被降解到檢測水平以下，因此幾乎沒有了由酚這個環(huán)境污染物所造成的環(huán)境污染的危險性。
為了提高微生物的降解能力，此微生物在土壤中有降解三氯乙烯的能力，并制備有降解能力的微生物，此微生物能處理高濃度的污染，發(fā)明者在接種前集中并調查培養(yǎng)方法。做為一種結果我們發(fā)現(xiàn)在接種以前有一種微生物培養(yǎng)時間最佳值，并且通過向培養(yǎng)基中加入誘導物增強降解三氯乙烯的能力，我們已完成了本發(fā)明。參考下列例子，本發(fā)明會得到更完全的解釋。
實施例7含有0．05％酵母抽提液和500ppm酚的100毫升pH培養(yǎng)基放于500毫升錐形燒瓶中，接種本發(fā)明微生物一種菌落的一白金圈菌量，此微生物通過在瓊脂板上傳代而儲存，瓊脂板是通過把1．5％的瓊脂加到含有500ppm酚的NYG培養(yǎng)基中制備的，或者接種1．0毫升預培養(yǎng)液，此預培養(yǎng)液是通過在30℃，含有500ppm酚的NYG培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)本發(fā)明微生物而獲得的。在30℃，130r．p．m振蕩培養(yǎng)時，按照實施例6中相同的方法確定培養(yǎng)液的混濁度和酚的濃度。通過5000r．p．m離心10分鐘收獲培養(yǎng)液中的細菌，然后懸浮到與培養(yǎng)基相同體積的NMS培養(yǎng)基中。懸浮液的OD600是0．2(細菌數是1×108c．f．u／毫升)。
細菌團的懸浮液放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相后三氯乙烯的濃度為30ppm。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，用鋁蓋密封。30℃下振蕩培養(yǎng)24小時后，瓶中的氣相由配有ECD檢測器的氣相色譜儀來分析。結果顯示于圖9至圖11。圖9中的線圖代表培養(yǎng)液的混濁度和酚的濃度。圖10中的條狀圖代表在各個不同培養(yǎng)時間的收獲的本發(fā)明微生物每單位量細菌團的降解活性(比活性)。圖11中的條狀圖代表在各個不同培養(yǎng)時間收獲的本發(fā)明微生物每單位量培養(yǎng)液的降解活性(總活性)。
從上述獲得的關于三氯乙烯降解活性的結果來看，從誘導期到對數生長期特異活性顯著增加，以后在一定水平上持平。但是在殘余的酚變成零后它逐漸降低。然而當酚的濃度變?yōu)榱銜r，在靜止期總活性仍保持最高值。這些觀察表明在接種進土壤以前，培養(yǎng)的同時監(jiān)控培養(yǎng)液的混濁度和酚的濃度，并在混濁度的增長停止進入靜止期以及酚濃度大約降為零時終止培養(yǎng)，可以獲得有著三氯乙烯降解高活性的細菌團。
實施例8本發(fā)明微生物按照類似于實施例7的方法培養(yǎng)，培養(yǎng)液的混濁度和酚濃度按類似于實施例6的方法測定。此外，在培養(yǎng)中當酚濃度接近零時500ppm的酚再次加入，培養(yǎng)繼續(xù)進行。5000r．p．m．離心10分鐘收獲培養(yǎng)液中的細菌團，然后重懸到與培養(yǎng)基相同體積的NMS培養(yǎng)基。
懸浮液的OD600是0．2(細菌數是2．5×108c．f．u／毫升)。細菌團的懸浮液放于20毫升小瓶中，加入三氯乙烯使得在所有成分都溶于液相后三氯乙烯的濃度為30ppm，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住后，用鋁蓋密封。30℃下振蕩培養(yǎng)24小時后，瓶中的氣相由配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析。
結果顯示于圖12至圖14。圖12中的線圖代表收獲以前培養(yǎng)階段培養(yǎng)液的混濁度和酚的濃度。圖10中的條狀圖代表在各個不同培養(yǎng)時間收獲的本發(fā)明微生物的比活性。圖14中的條狀圖代表在各個不同培養(yǎng)時間收獲的本發(fā)明微生物的總活性。培養(yǎng)45小時當殘存酚變?yōu)榱銜r，500ppm的酚加入培養(yǎng)液，酚的濃度再次降低，培養(yǎng)液的混濁度升高。當69小時時再次加入酚，既沒有觀察到培養(yǎng)液混濁度的升高，也沒有觀察到酚濃度的降低。
關于三氯乙烯降解活性，按圖13中所顯示，在41至60小時之間的靜止期，當仍保留有足夠酚時可獲得高的比活性，但是當酚濃度降低以后比活性降低。在93小時時加入酚，細菌團的量和比活性都降低。然而在93至114小時此期間當仍有殘存酚時，比活性高于45至69小時時大部分酚被降解時的特異活性。另一方面，假如總活性比只在培養(yǎng)開始時加酚的總活性高2．5倍，當細菌的量和比活性都高時，總活性在60小時時最好。
參考下列實施例，下面將會解釋土壤中三氯乙烯的降解。
實施例9往100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙土(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃在1．5毫升，4．5毫升，7．5毫升，15毫升或30毫升NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm的酚和0．05％酵母抽提液，離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％。細菌團的懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，并用鋁蓋緊封，然后允許在30℃下保持一定時間。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去離子水，此去離子水是用通過活性碳和10毫升正己烷的空氣充氣，然后密封小瓶。小瓶在超聲波清洗機上超聲處理10分鐘，然后在振蕩器上振蕩10分鐘。分離出的正己烷用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析，顯示于圖15的結果表明直至細菌的密度達到2．5×108cfu／克濕土壤(15毫升培養(yǎng)液)三氯乙烯的降解和細菌的密度才相互關聯(lián)，但當密度達到約5×108cfu／克濕土壤(30毫升培養(yǎng)液)或更高，則變?yōu)轱柡?。因此表明當本發(fā)明微生物用于降解三氯乙烯時，大約2．5×108cfu／克濕土壤的細菌密度是最合適的，并且本發(fā)明微生物有一特征，對于凈化土壤中給定濃度污染物所需細菌有一最小的評估值。
實施例10往100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙土(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃在7．5毫升NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％酵母抽提液，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％。細菌的懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，并用鋁蓋緊封，然后允許在30℃下保持一定時間。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去離子水，此去離子水是用通過活性碳和10毫升正己烷的空氣充氣，然后密封小瓶。小瓶在超聲波清洗機上超聲處理10分鐘，然后在振蕩器上振蕩10分鐘。分離出的正己烷用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析。顯示于圖16中的結果表明對應于7．5毫升培養(yǎng)液的細菌團向土壤中加入兩次，其降解速率等于對應于15毫升培養(yǎng)液的細菌團加入一次。就實際所需要的量而言(污染土壤實際的量多于幾十立方米)，一次補充降解污染土壤中所含三氯乙烯所需培養(yǎng)液的量是很困難的，降解微生物必需連續(xù)培養(yǎng)并加入土壤中。結果表明本發(fā)明微生物的連續(xù)加入產生了與所需細菌團一次加入時相同的效果。因此，通過重復加入小量的培養(yǎng)液體，本發(fā)明的微生物可以處理大面積的污染地點，而這樣的地點對于一次性培養(yǎng)和加入細菌團則是不夠的。
實施例11往100毫升小瓶中加入人為用所需濃度的三氯乙烯污染的30克沙粒狀土壤(空氣干燥)。土壤中污染物的濃度分別設為15、30、45、100和150毫克／千克。本發(fā)明微生物于30℃在15、30和45毫升NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％的酵母抽提液，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌團的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％。細菌團的懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，并用鋁蓋緊封，然后允許在30℃下保持一定時間。土壤中細菌團的濃度為9．4×108，1．9×109，2．8×109cfu／克濕土壤，分別對應于15、30和45毫升培養(yǎng)液。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去離子水，此去離子水是用通過活性碳和10毫升正己烷的空氣充氣，然后密封小瓶。小瓶在超聲波清洗機上聲處理10分鐘，然后在振蕩器上振蕩10分鐘。分離出的正己烷用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析。顯示于圖17中的結果表明土壤中非常高濃度(約150毫克／千克)的三氯乙烯能被降解。上述結果表明因為三氯乙烯降解量的增加與加到土壤中細菌團的量成正比，所以通過增加加入細菌的量或者連續(xù)加入來加強高濃度(約150毫克／千克)污染物的凈化。
實施例12往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙土(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃下在NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％的酵母抽提液，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌團的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％。細菌團的接種量為108至109細胞／克濕土壤。細菌團的懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允許在30℃下保持一定時間。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去離子水，此去離子水是用通過活性碳和10毫升正己烷的空氣充氣，然后密封小瓶。小瓶在超聲波清洗機上聲處理10分鐘，然后在振蕩器上振蕩10分鐘。分離出的正己烷用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析，通過在同一時間內制備多個樣品，經過給定的時間后抽提部分樣品的整個體積，接著測定來確定土壤中三氯乙烯濃度改變的時間過程，抽提前樣品儲存于4℃。
土壤中三氯乙烯濃度的測定使用涉及土壤污染的環(huán)境標準(土壤環(huán)境標準)中所指示的方法來施行。這樣土壤樣品和溶劑(鹽酸加到凈化的水中，pH調至5．8至6．3)以10％的重量體積比加到帶有螺旋插口的錐形燒瓶中，螺旋插口帶一攪拌棒，燒瓶立刻密封。此時應小心使得混合物的體積不少于500毫升，以盡量減少相對于混合物體積的帶有螺旋插口的錐形燒瓶中頭部空間。制備的樣品液體保持在常溫常壓下用磁力棒連續(xù)攪拌4小時。
樣品液體允許放置30分鐘后，抽取到一種玻璃注射器中。帶有0．45μ孔徑濾膜的濾器連到注射器上，壓擠活塞以排除空氣和開始幾毫升液體，濾出液體分部收集到帶有塞子的試管中，從中稱出用以測量的量，用氣相色譜儀進行分析，顯示于圖19中的結果表明加入細菌團后一天之內土壤中全部三氯乙烯的90％被降解。
它表明通過把本發(fā)明微生物加入土壤來凈化三氯乙烯的方法是一項技術，它有著高的凈化能力，幾乎等于一天之內降解土壤中約18毫升／千克三氯乙烯的能力。依據國家(環(huán)境標準，涉及土壤污染的土壤環(huán)境標準)設計的分析方法測定放置7天時的土壤樣品，三氯乙烯的濃度低于基礎值(0．03ppm)。做為一種結果，它表明通過使用本發(fā)明微生物來凈化污染的土壤，三氯乙烯可以凈化到滿足環(huán)境標準的水平。目前公認物理處理方法例如真空抽提不能從低濃度中凈化，但是使用本發(fā)明微生物可以使凈化達到低于基礎值的水平。
實施例13往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙土(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃下在NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％的酵母抽提液，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌團的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％，細菌團的接種量為108至109細胞／克濕土壤。細菌團的懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允許在30℃下放置特定的時間。此后對據說伴隨土壤中三氯乙烯降解而形成的副產品進行分析。
土壤中的副產品按以下分析氯乙烯，1，1-二氯乙烯，順式-1，2-二氯乙烯和反式-1，2-二氯乙烯按圖19中顯示的方法進行分析。二氯乙酸和三氯乙酸、三氯乙醇和水合氯醛分別按圖20、21和22中顯示的方法進行分析。顯示于表9中的結果表明所有副產品都低于檢測范圍以下。
在厭氧條件下三氯乙烯的脫氯反應導致二氯乙烯的聚集，此物毒性更大。已知在有氧條件下以形成三氯乙烯氧化酶為起始的降解過程產生二氯乙酸等等做為中間產物，對于由本發(fā)明微生物在土壤中降解三氯乙烯，無有害物質的積累。盡管除了測定過物質以外其它物質的出現(xiàn)還未知，但此技術是一種高度安全的方法。
表8分析的項目 結果 檢測極限氯乙烯 未檢測到 0．01ppm1，1-二氯乙烯 未檢測到 0．01ppm順式-1，2-二氯乙烯 未檢測到 0．01ppm反式-1，2-二氯乙烯 未檢測到 0．01ppm二氯乙酸 未檢測到 0．05ppm三氯乙醇 未檢測到 0．01ppm三氯乙酸 未檢測到 0．05ppm水合氯醛 未檢測到 0．05ppm實施例14往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙土(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃下在NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％的酵母抽提液，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌團的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％，細菌團的接種量為108至109細胞／克濕土壤。把細菌團的懸浮液鋪盤于佩特里細菌培養(yǎng)皿中呈約1毫米厚度，然后在260納米波長，時間不少于60秒，距離光源40厘米的條件下用15W紫外燈照射滅菌。本發(fā)明微生物的細菌團懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允許在30℃下放置一定的時間。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去離子水，此去離子水是通過活性碳和10毫升正己烷的空氣充氣，然后密封小瓶。小瓶在超聲波清洗機上聲處理10分鐘，然后在振蕩器上振蕩10分鐘。分離出的正己烷用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析。此外，在實驗中，滅菌細菌團懸浮液以NYG培養(yǎng)基1／100的量取出接種或懸浮液鋪板至NYG瓊脂培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)，未觀察到培養(yǎng)液體混濁度的升高和菌落形成，因此肯定是完全滅菌。顯示于圖23中的結果表明死細胞和活細胞產生相同程度的三氯乙烯的降解。
盡管使用微生物的大多數凈化方法包括把成活生物體加到土壤中，但目前從公眾接受的觀點來看把細菌加入土壤是困難的。擔心通過釋放特異微生物進入環(huán)境就存在對生態(tài)系統(tǒng)產生難以控制的影響的潛在危險性。但是加入經滅菌處理已完全喪失繁殖能力的微生物只相當于加入有機物質，因此被認為對生態(tài)系統(tǒng)幾乎無影響。所以進行一項實驗，其中研究把用紫外線滅菌的降解微生物加入土壤中，結果表明死亡細菌的加入被證實是一種極其有用的方法。
發(fā)表在日本未審查專利公開號8(1996)-3012的發(fā)明聲稱通過把降解細菌壓碎，然后灑進土壤可以最大程度減少對生態(tài)系統(tǒng)的影響。但是應很容易預想的是把大量降解細菌噴灑進污染的土壤中實際是困難的，因為微生物的壓碎需要廣泛的設備，大量的時間和勞動力。而且已知有三氯乙烯-氧化活性的酶需要NAD做為輔酶。因為輔酶十分昂貴，因此提供輔酶至一定濃度將極為困難，此濃度對壓碎細菌后從細菌群體中釋放出的酶的降解反應是必需的。另一方面，使用本發(fā)明微生物的方法沒有這樣的問題，可以使三氯乙烯等的凈化在低費用、及對生態(tài)系統(tǒng)產生最小影響的情況下進行。
實施例15往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙土(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃下在NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％的酵母抽提液，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌團的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％，細菌團的接種量為108至109細胞／克濕土壤。把細菌團的懸浮液鋪盤于佩特里細菌培養(yǎng)皿中呈約1毫米厚度，然后在260納米波長，時間不少于60秒，距離光源40厘米的條件下用15W紫外燈照射滅菌。
本發(fā)明滅菌微生物的懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允許在30℃下放置一定的時間。此后，土壤中的三氯乙烯降解，并對被認為伴隨三氯乙烯降解而形成的副產品按實施例13相類似的方法進行分析。此外，在實驗中，滅菌細菌團懸浮液以NYG培養(yǎng)基1／100的量取出接種，或懸浮液鋪板至NYG瓊脂培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)，未觀察到培養(yǎng)液體混濁度的升高和菌落的形成，因此肯定是完全滅菌。
顯示于表10中的結果表明所有副產品都低于檢測范圍以下，在無氧條件下三氯乙烯的脫氯反應導致二氯乙烯的聚集，此物毒性更大。已知在有氧條件下以形成三氯乙烯氧化酶為起始的降解過程產生二氯乙酸等做為中間產物。對于由本發(fā)明微生物在土壤中進行的三氯乙烯的降解，無有害物質的積累。盡管除了測定過的物質以外其它物質的出現(xiàn)還未知，但仍表明此技術是一種高度安全的方法。
表9分析的項目結果 檢測限度氯乙烯 未檢測到 0．01ppm1，1-二氯乙烯 未檢測到 0．01ppm順式-1，2-二氯乙烯 未檢測到 0．01ppm反式-1，2-二氯乙烯 未檢測到 0．01ppm二氯乙酸未檢測到 0．05ppm三氯乙醇未檢測到 0．01ppm三氯乙酸未檢測到 0．05ppm水合氯醛未檢測到 0．05ppm實施例16往用特氟隆包被的丁基橡皮隔密封的100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙土(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃下在NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％的酵母抽提液，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的NMS培養(yǎng)基中使得在細菌團的懸浮液加入以后土壤中水含量為25％，細菌團的接種量為108至109細胞／克濕土壤。本發(fā)明微生物的懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住，然后允許在20℃下放置一定的時間。
此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去離子水，此去離子水是用通過活性碳和10毫升正己烷的空氣充氣，然后密封小瓶。小瓶在超聲波清洗機上聲處理10分鐘，然后在振蕩器上振蕩10分鐘。分離出的正己烷用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析。
顯示于圖24中的結果表明，三氯乙烯在20℃時被降解的程度等于30℃下降解的程度。因為這表明三氯乙烯在土壤溫度下充分降解，所以與其它相比，本發(fā)明微生物被證實有高的實際應用性。
實施例17往100毫升小瓶中加入人為用三氯乙烯污染的30克沙粒狀土壤(空氣干燥)。本發(fā)明微生物于30℃下在NMS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天，NMS培養(yǎng)基中含有500ppm酚和0．05％的酵母抽提液，在土壤中分別含有500ppm，0．02％和1mM酚、酵母抽提液和葡萄糖的培養(yǎng)液以NMS培養(yǎng)基(或pH培養(yǎng)基)1／100的體積加入，然后加到土壤中。細菌密度設定為106細胞／克濕土壤。水含量在培養(yǎng)液加入時設定為25％。
小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮隔塞住，然后允許在30℃下保持一定時間。此后，往含有30克土壤的小瓶中加入50毫升去離子水，此去離子水是用通過活性碳和10毫升正己烷的空氣充氣，然后密封小瓶。小瓶在超聲波清洗機上聲處理10分鐘，然后在振蕩器上振蕩10分鐘。分離出的正己烷用配有ECD檢測器的氣相色譜儀分析。
顯示于圖25中的結果表明土壤中的三氯乙烯在NMS培養(yǎng)基和pH培養(yǎng)基中很相似地從14毫克／千克降至1毫克／千克。由于酚加入到土壤中，土生土長的微生物也參與了三氯乙烯的降解，但結果表明更大的效果來自于MO7菌株的加入。盡管存在土生土長的微生物，可以很清楚地排除這個可能性，即菌株既在滅菌培養(yǎng)基中又在自然環(huán)境中施加影響。可以肯定既使在自然環(huán)境下，菌量為106細胞／克濕土壤，加入酚可充分誘導MO7菌株的活性。
實施例18建立一種組成性突變體挑取本發(fā)明微生物一種菌落一白金圈菌量，此菌通過在含1．5％瓊脂的瓊脂板上傳代而儲存，接種于含2ml1／3LB培養(yǎng)基(其成分見表11)的試管中。30℃，130r．p．m．振蕩過夜培養(yǎng)以后，液體培養(yǎng)基中的一小份按適當比例稀釋，然后鋪板于含1．5％瓊脂的1／3LB培養(yǎng)基上。30℃下培養(yǎng)后計錄細胞的數目。液體培養(yǎng)基剩余部分鋪盤于佩特里細菌培養(yǎng)皿中，然后在260納米波長，照射時間3分鐘，距離光源30厘米的條件下接受15W紫外燈的照射。
表101／3LB培養(yǎng)基蛋白胨 3．0克酵母抽提液 1．5克氯化鈉 3．0克去離子水1．0升然后液體培養(yǎng)基按適當比例稀釋后，鋪板于含1．5％瓊脂的1／3LB培養(yǎng)基上。30℃下培養(yǎng)計錄細胞的數目以確定死亡率。當觀察到99％或更高的死亡率時，可以認為有足夠的突變。從此點的液體培養(yǎng)基中選擇所需要的突變型。
鄰苯二酚2，3-二加氧酶(C230)通過metafission把氧引入鄰苯二酚形成2-羥基己二烯二酸半醛。產物是黃色。當C230噴灑后表明時，很容易變?yōu)辄S色。利用酚的三氯乙烯-降解細菌的三氯乙烯降解酶已知是酚羥化酶(PH)，它能把酚轉換成鄰苯二酚(M．Fujita et al發(fā)酵生物工程雜志，79100，1995；V．Shingler et al細菌學雜志，174711，1992)。
已知一種例子，C230通過一種操縱子來表達，其中操縱子中盡管C230本身不直接參與三氯乙烯的降解，但C230基因鄰近PH基因(M．Fujita et al發(fā)酵生物工程雜志，79100，1995；V．Shingler et al細菌學雜志，174711，1992)。如果C230伴隨PH而表達，則有可能使用C230做為指示劑來選擇三氯乙烯-降解酶表達的菌株。當使用酚做為唯一碳源來培養(yǎng)時，本發(fā)明的微生物會降解酚，液體培養(yǎng)基隨著細菌的生長而變黃。這使得所說的選擇方法應用于微生物。
相應的，突變后細菌團懸浮液按適當比例稀釋后，鋪板于含1．5％瓊脂的1／3LB培養(yǎng)基上。30℃下培養(yǎng)1至3天后，噴灑鄰苯二酚溶液(0．1％(重量／體積)乙醚溶液)。
當死亡率達到99．99％時，研究紫外線照射后出現(xiàn)的約10000個菌落，選擇出16個黃色菌落。
當菌落在1／3LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以后，鋪板于含1．5％瓊脂的1／3LB培養(yǎng)基上。30℃下培養(yǎng)以后，出現(xiàn)的菌落用鄰苯二酚溶液噴灑，再次分離黃色菌落以得到能基本表達C230的菌株。
挑取一白金圈能基本表達C230的菌株，接種進裝在20毫升小瓶的M培養(yǎng)基中(成分顯示于表12)，M培養(yǎng)基中含有4毫升谷氨酸鈉(0．1％)。小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮塞塞住后，用鋁蓋密封，然后30℃下振蕩培養(yǎng)2天。然后加入三氯乙烯使得所有成分都溶于液相后三氯乙烯濃度為30ppm。30℃下培養(yǎng)5天，三氯乙烯的濃度按實施例6中方法來確定。
表11M培養(yǎng)基硝酸銨 3．0克磷酸氫二鈉 2．2克磷酸二氫鉀 0．8克七水硫酸鐵(II) 10．0毫克二水硫酸鈣 10．0毫克七水硫酸鎂 10．0毫克酵母抽提液 50．0毫克去離子水1．0升，pH7．0結果表明母本MO7菌株幾乎不降解三氯乙烯，但基本表達C230的一些菌能降解30ppm三氯乙烯中的52至34％。這些微生物證實是起源于母本MO7菌株的突變體，在不需要酚時能降解三氯乙烯。
參考這個實施例，使用具有降解三氯乙烯最高活性的MO715菌株說明土壤中三氯乙烯的降解。
實施例19由組成性突變體進行三氯乙烯的降解按例9中制備人為用三氯乙烯(11毫克／千克土壤)污染的土壤。MO715菌株于30℃，100毫升含有谷氨酸鈉(0．1重量／體積％)的M培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)2天，然后離心收獲細胞，重懸于合適量的M培養(yǎng)基中使得土壤中水含量為25％。細菌懸浮液(不含酚)加入土壤后，小瓶用特氟隆包被的丁基橡皮隔塞住，允許在30℃下放置一定的時間。三氯乙烯按類似于實施例9中的方法來分析。培養(yǎng)于酚和MO7菌株上的液體培養(yǎng)基也按類似方法分析。
做為一種結果，用谷氨酸鈉培養(yǎng)的MO715菌株細菌懸浮液加入以后，12小時內約35％三氯乙烯降解，48小時內60％三氯乙烯降解。生長于谷氨酸鈉上的MO7菌株幾乎沒有降解三氯乙烯。這表明本發(fā)明微生物不需要酚的誘導，也能在土壤中降解三氯乙烯。
從前面敘述中可以判斷，本發(fā)明是一種非常安全的技術，因為不把有毒物質例如酚擴散進入環(huán)境，也可以降解三氯乙烯。
參照布達佩斯條約下的國際保藏國際保藏機構日本通商產業(yè)省工業(yè)技術院生命工學和人體技術研究所地址日本赤城縣筑波市東1丁目1番3號鑒定號 保藏號 保藏日期MO7FERM BP-5624 1996年8月12日MO715 FERM BP-5928 1997年4月24日序列表SEQ ID NO1序列長度19序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明GAGTTTGATC CTGGCTCAGSEQ ID NO2序列長度27序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明AGAAAGGAGGTGATCCAGCC GCAGGTTSEQ ID NO3序列長度16序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明GGCCGGACGG GTGAGTSEQ ID NO4序列長度15序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明TACGGGAGGC AGCAGSEQ ID NO5序列長度17序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明GTGCCAGCAG CCGCGCGSEQ ID NO6序列長度18序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明GATTAGATAC CCTGGTAGSEQ ID NO7序列長度18序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明ACTCAAAGGA ATTGACGGSEQ ID NO8序列長度16序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明GCAACGAGCG CAACCCSEQ ID NO9序列長度16序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列說明TGTACACACC GCCCGTSEQ ID NO10序列長度1422序列類型核苷酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型cDNA序列說明AACGCTGGCG GCGTGCTTAA CACATGCAAG TCGAACGGTG AAGCTTGGAG CTTGCTTCGA 60GTGGATCAGT GGCGAACGGG TGAGTAACAC GTGAGCAACC TGCCCCAGAC TCTGGAATAA 120GCGCTGGAAA CGGCGTCTAA TACTGGATAT GTGACGGACC TGCATGGGTA CCGTCTGGAA 180AGTTTTTCGG TTTGGGATGG GCTCGCGGCC TATCAGCTTG TTGGTGAGGT AATGGCTCAC 240CAAGGCGACA ACGGGTANCC GGCCTGAGAG GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGAAACACG 300GCCCAAACTC CTACGGGAGG CACCAGTGGG GAAATATTGC ACAATGGGCG AAAGCCTGAT 360GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCT TCGGGTTGTA AACCTCTTTC AGCAGGGAAG 420AAGCGAAAGT GACGGTACCT GCAGAATAAG CACCGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG 480TAATACGTAG GGTGCGAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG TAAAGAGCTT GTAGGCGGTT 540TGTCGCGTCT GCTGTGAAAA TCCGGGGCTC AACCCCGGAC TTGCAGTGGG TACGGGCAGA 600CTAGAGTGTG GTAGGGGAGA CTGGAATTCC TGGTGTAGCG GTGAAATGCG CAGATATCAG 660GAGGAACACC GATGGCGAAG GCAGGTCTCT GGGCCACTAC TGACGCTGAG AAGCGAAAGC 720ATGGGGAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCATGC CGTAAACGTT GGGCGCTAGG 780TGTGGGACTC ATTCCACGAG TTCCGTGCCG CAGCTAACGC ATTAAGCGCC CCGCCTGGGG 840CAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGCGGAG 900CATGCGGATT AATTCGATGC AACGCGAAGA ACCTTACCAA GGCTTGACAT ATACCGGAAA 960CTTCCAGAGA TGGTTGCCCC CTTTGGGTCG GTATACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC 1020TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTCGTT CTATGTTGCC 1080AGCACGTCAT GGTGGGGACT CATGGAAGAC TGCCGGGGTC AACTCGGAAG AAGGTGGGGA 1140TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGTCT TGGGCTTCAC GCATGCTACA ATGGCCGGTA 1200CAAAGGGCTG CGATACCGCA AGGTGGAGCG AATCCCCAAA AAACCGGTCT CAGTTCGGAT 1260TGGGGTCTGC AACTCGACCC CATGAAGTCG GAGTCGCTAG TAATCGCAAA TCAGCAACGC 1320TGCGGTGAAT ACTTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CAAGTCACGA AAGTTCGGTA 1380ACACCCGAAG CCGGTGGCCC AACCCTTGTG GGGGGAGCCG TC 142權利要求
1．一種具有如下特征的細菌，形態(tài) 球形，桿狀革蘭氏染色 +孢子形成 -運動性 -與氧的關系 需氧型氧化酶檢測 -過氧化氫酶檢測 +抗酸性 -桿-球循環(huán)+空氣中菌絲體形成 -細胞壁的肽聚糖類型 內消旋-二氨基庚二酸羥乙?；?glycolyl)檢測 -(乙酰基類型)霉菌酸 -主要的類異戊二烯醌類MK-9，MK-9(H2)(痕量)DNA中GC含量(mole％) 73(通過HPLC)，它可以降解三氯乙烯。
2．權利要求1的細菌，其為MO7菌株(FERM BP-5624)。
3．一種降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的方法，包括使有機鹵代化合物和／或芳香化合物接受權利要求1或2的細菌的作用。
4．權利要求3的方法，其中有機鹵代化合物是三氯乙烯，芳香化合物是酚化合物。
5．一種降解含有有機鹵代化合物的土壤、廢水或其它廢物中的有機鹵代化合物的方法，包括將權利要求1或2的細菌培養(yǎng)物加到土壤、廢水或其它廢物中。
6．權利要求5的方法，其中有機鹵代化合物是三氯乙烯，培養(yǎng)物是培養(yǎng)的細菌細胞。
7．權利要求5或6的方法，其中芳香化合物加到培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)，以獲得細菌培養(yǎng)物。
8．權利要求7的方法，其中所說的芳香化合物是酚化合物。
9．權利要求5至8任一項的方法，其中一可降解的碳源被加到培養(yǎng)基中用以獲得細菌培養(yǎng)物。
10．權利要求9的方法，其中可降解的碳源是葡萄糖。
11．權利要求5至10任一項的方法，其中培養(yǎng)物是培養(yǎng)的細菌細胞。
12．權利要求11的方法，其中培養(yǎng)的細菌細胞是成活的細菌細胞。
13．權利要求11的方法，其中培養(yǎng)的細菌細胞是滅菌化的培養(yǎng)的細菌細胞。
14．權利要求13的方法，其中滅菌處理是紫外線照射。
15．一種降解含有有機鹵代化合物的土壤，廢水或其它廢物中的有機鹵代化合物的方法，包括以下幾步接種權利要求1或2的細菌至土壤、廢水或其它廢物中，加入一種芳香化合物，一種可降解的碳源，或它們的混合物至土壤、廢水或其它廢物中，然后培養(yǎng)接種的微生物。
16．權利要求15的方法，其中有機鹵代化合物是三氯乙烯。
17．權利要求15或16的方法，其中芳香化合物是酚化合物，可降解的碳源是葡萄糖。
18．降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的方法，其中能夠降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的滅菌化的培養(yǎng)的微生物細菌細胞被允許作用于有機鹵代化合物和／或芳香化合物。
19．一種降解含有有機鹵代化合物和／或芳香化合物的土壤、廢水或其它廢物中有機鹵代化合物和或芳香化合物的方法，其中能夠降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的滅菌培養(yǎng)的微生物細菌細胞被加入到所說的土壤、廢水或其它廢物中。
20．權利要求19的方法，其中滅菌處理是紫外線照射。
21．權利要求19或20的方法，其中芳香化合物是酚的化合物，有機鹵代化合物是三氯乙烯。
22．一種有機鹵代化合物和／或芳香化合物的降解劑，包括權利要求1或2的細菌培養(yǎng)物。
23．權利要求22的降解劑，其中培養(yǎng)物是培養(yǎng)的細菌細胞。
24．權利要求23的降解劑，其中培養(yǎng)物是成活的細菌細胞。
25．權利要求23的降解劑，其中培養(yǎng)的細菌細胞是滅菌化的細菌細胞。
26．權利要求25的降解劑，其中滅菌處理是紫外線照射。
27．權利要求22至26任一項的降解劑，它可以是干燥細菌細胞的形式。
28．一種細菌，其在存在或缺少芳香化合物對有機鹵代化合物降解酶的誘導的情況下具有對有機鹵代化合物和／或芳香化合物的降解活性，其中該細菌可由將權利要求1的細菌進行處理和篩選而得到。
29．權利要求28的細菌，它是菌株MO715(FERM BP-5928)。
30．一種降解有機鹵代化合物和／或芳香化合物的方法，包括允許權利要求28或29的細菌作用于有機鹵代化合物和／或芳香化合物。
31．權利要求30的方法，其中有機鹵代化合物是三氯乙烯，芳香化合物是酚化合物。
32．一種降解含有有機鹵代化合物的土壤、廢水或其它廢物中有機鹵代化合物的方法，包括把權利要求28或29的細菌培養(yǎng)物加到土壤、廢水或其它廢物中。
33．權利要求32的方法，其中有機鹵代化合物是三氯乙烯，培養(yǎng)物是培養(yǎng)的細菌細胞。
34．權利要求32或33的方法，其中沒有芳香化合物加到培養(yǎng)基中用以培養(yǎng)以獲得所說細菌培養(yǎng)物。
35．權利要求32至34任一項的方法，其中一可降解的碳源被加到培養(yǎng)基中用以培養(yǎng)以獲得所說細菌培養(yǎng)物。
36．權利要求35的方法，其中可降解的碳源是谷氨酸。
37．權利要求32至36的方法，其中培養(yǎng)物是培養(yǎng)的細菌細胞。
38．權利要求37的方法，其中培養(yǎng)的細菌細胞是活的細菌細胞。
39．權利要求37的方法，其中培養(yǎng)的細菌細胞是滅菌化的細菌細胞。
40．權利要求39的方法，其中滅菌處理是紫外線照射。
41．一種降解含有有機鹵代化合物的土壤、廢水或其它廢物中的有機鹵代化合物的方法，包括以下幾步接種權利要求28或29的細菌至土壤、廢水或其它廢物中，加入一種可降解的碳源至土壤、廢水或其它廢物中，然后培養(yǎng)接種的微生物。
42．權利要求41的方法，其中有機鹵代化合物是三氯乙烯。
43．權利要求41或42的方法，其中可降解的碳源是谷氨酸。
全文摘要
一種具有下列特征的新微生物:形態(tài)(球、桿狀),革蘭氏染色(+),孢子形成(－),運動性(－),與氧的關系(需氧型),氧化酶檢測(－),過氧化氫酶檢測(+),抗酸性(－),桿－球循環(huán)(+),DNA中GC含量(mole%)(73(通過HPLC)),它可以降解氯乙烯。此微生物可以在24小時內降解30ppm的三氯乙烯,可以降解100ppm三氯乙烯的50%。
文檔編號B09C1/10GK1205032SQ9719142
公開日1999年1月13日 申請日期1997年8月19日 優(yōu)先權日1996年8月19日
發(fā)明者沼田耕一, 織田泰, 宮田雅美, 岡村幸治, 不邑敏章, 打田雅俊, 淺見修 申請人:豐田自動車株式會社