專利名稱：用于合成生物聚合物的載體以及生產(chǎn)生物聚合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于合成有機(jī)聚合物(優(yōu)選為生物聚合物)的載體，其具有一種基質(zhì)，在該基質(zhì)表面上合成生物聚合物，并具有針對性地活化基質(zhì)部分區(qū)域的能源，其中，生物聚合物在經(jīng)活化的基質(zhì)部分區(qū)域上進(jìn)行合成。該載體在醫(yī)學(xué)特別是診斷或治療儀器中用作為傳感器芯片。此外，本發(fā)明涉及合成生物聚合物的方法，其中使用了該載體。
生物學(xué)系統(tǒng)是以生物活性大分子的相互作用為基礎(chǔ)的。對于這種相互作用來說大分子的活性是前提，這取決于大分子的空間結(jié)構(gòu)。因此，闡明大分子的空間結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系在研究復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)中起著決定性的作用。闡明生物學(xué)相互作用使得能夠了解在細(xì)胞連接中細(xì)胞如何進(jìn)行相互通訊、酶如何結(jié)合和轉(zhuǎn)化其底物以及細(xì)胞調(diào)控機(jī)制如何起作用或者當(dāng)癌發(fā)生時該機(jī)制如何被阻斷。許多生物大分子可以通過其三維表面結(jié)構(gòu)以及特異的電荷分布而結(jié)合其它分子并與之相互作用。所有具有這種特異性的分子統(tǒng)稱為受體。已知的受體的實例為催化代謝中間體水解的酶，使得能夠轉(zhuǎn)運(yùn)所負(fù)載的分子通過生物膜的蛋白質(zhì)，允許與其它細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)系的糖蛋白，在血液中循環(huán)并發(fā)現(xiàn)、結(jié)合和滅活細(xì)菌或病毒成分的抗體，或者DNA這一遺傳信息載體與序列特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合從而允許其在細(xì)胞中的生物學(xué)用途。與受體特異性結(jié)合的分子統(tǒng)稱為配體，其中，許多生物分子一方面主動地結(jié)合其它分子，另一方面也被其它分子所結(jié)合，因此它們既是配體又是受體。
為了研究受體和配體之間的相互作用、為了確定它們的結(jié)合親和性以及為了闡明結(jié)合強(qiáng)度和結(jié)合特異性，開發(fā)了許多的測試系統(tǒng)(檢測)。在至今仍在醫(yī)學(xué)診斷中使用的簡單生物學(xué)檢測中，將細(xì)菌或病毒的抗原片段固定在固體表面上。隨后滴上待測試的患者的(血液)試樣，從而可以通過檢測系統(tǒng)檢測來自(血液)試樣的特異性抗體與抗原片段之間的相互作用。可是，這種抗原-抗體的檢測非常受限于能夠在載玻片上固定的抗原片段的數(shù)量。
在重要的模式生物和科學(xué)研究生物如細(xì)菌(枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，大腸埃希氏菌(Escherichia coli))和酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))的完整的基因組DNA序列在數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)存在了幾年之后，最近也可以在人類基因組計劃的范圍之內(nèi)完成人基因組的測序。從那時起各個基因功能的研究越來越具有重要性，這些基因在不同的組織和器官中具有不同的活性。闡明分化的基因表達(dá)對于了解癌的發(fā)生是至關(guān)重要的?，F(xiàn)在已經(jīng)知道，有一些個體由于某一特定的基因樣式而具有較高的發(fā)生癌的風(fēng)險。雖然幾年來進(jìn)行了各種各樣的試驗，在最小的空間上人工合成盡可能大量的DNA序列，以便研究它們與其它分子的相互作用，但是能夠提供的空間與可能的DNA分子的數(shù)量之間的比例始終是沒有完全解決的問題。
傳統(tǒng)的方法是以自動化的固相方法為基礎(chǔ)以便通過在增長的鏈上依續(xù)逐一地添加活性單體來合成DNA鏈(DNA陣列)，這些鏈結(jié)合在不溶的基質(zhì)上。這種人工生物學(xué)系統(tǒng)稱為DNA芯片。在生產(chǎn)DNA芯片的時候，首先將組建DNA陣列的單體(核苷酸)以微劑量上載于應(yīng)當(dāng)進(jìn)行合成寡核苷酸的位置上。因為在實踐中這些方法非常昂貴，所以用光控的(＝照相平版印刷術(shù)的＝光刻的)合成方法來替代其用于生產(chǎn)高密度的DNA芯片，這是迄今為止使用最多的方法。
在進(jìn)行光控的DNA芯片的合成時，要使用例如已知于半導(dǎo)體工業(yè)的特殊的掩膜組，以便進(jìn)行選擇性的曝光。在此，固體載體的表面用光敏感的(＝光不穩(wěn)定的)保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后通過一個放置其上的光刻掩膜進(jìn)行曝光。曝光從而使在被曝光的位置上選擇性地脫除保護(hù)基團(tuán)，由此僅在被曝光的區(qū)域存在游離的反應(yīng)性羥基(OH基團(tuán))。隨后添加經(jīng)活化的脫氧核苷酸，該脫氧核苷酸就其而言具有用于保護(hù)基團(tuán)的羥基，致使在先前被曝光的位置上發(fā)生脫氧核苷酸的偶聯(lián)。在氧化反應(yīng)之后清洗該載體，再通過第二個掩膜照射表面，由此脫除其它位置上的保護(hù)基團(tuán)并且為再次的偶聯(lián)進(jìn)行活化。然后，添加第二個仍然具有被保護(hù)了羥基的脫氧核苷酸。繼續(xù)進(jìn)行從曝光至保護(hù)基團(tuán)的脫除和脫氧核苷酸的偶聯(lián)這種循環(huán)，直到固體載體上出現(xiàn)所希望的寡核苷酸。使用這種方法可以生產(chǎn)高密度的DNA陣列(Pease等人，(1994)，PNAS，USA，Vol.91，S.5022-5026)。
EP 476 014 B1同樣描述了在固體載體上生產(chǎn)聚合物庫的方法，在該方法中也是利用光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)和通過相應(yīng)的曝光技術(shù)對其進(jìn)行的解離。但是對于每個單體堿基，即(脫氧)腺嘌呤、(脫氧)胞嘧啶、(脫氧)鳥嘌呤和(脫氧)胸腺嘧啶必須有不同的光刻掩膜，致使所需的不同掩膜的數(shù)量合計為所要合成的DNA序列長度的四倍。與人工DNA序列的合成相比較，基于掩膜的肽的合成更為昂貴，這是因為用于構(gòu)建肽需要20種天然氨基酸以供使用，因此掩膜的數(shù)量總計為肽長度的20倍。所需的掩膜組不僅必須在合成開始之前已經(jīng)準(zhǔn)備好，而且還必須在每次曝光時進(jìn)行非常準(zhǔn)確的調(diào)整，以便避免錯誤曝光和由此引起的污染。雖然從US 5,143,854中已知一種光源，其允許載玻片的可移動性，但是加掩膜的方法由于其十分可觀的技術(shù)費(fèi)用從而特別是對于短系列來說是不合適的，這是因為對于每次新的合成都必須要準(zhǔn)備一個新的掩膜組。
為了避開昂貴和繁瑣的掩膜生產(chǎn)過程，開發(fā)了無掩膜的系統(tǒng)。從WO99/42813中可知，通過可各自可控制的微鏡進(jìn)行曝光可以構(gòu)建生物聚合物如DNA陣列或者多肽。這些微鏡形成一個聯(lián)系在一起的區(qū)域，該區(qū)域由可電控的單個微鏡組成(數(shù)字微鏡器件)。給該微鏡區(qū)域配備一個共有光源。將存在于載玻片之上的生物聚合物以一定的模式進(jìn)行活化，在此，在受控制的區(qū)域偶聯(lián)上各自提供的單體(例如四種不同的堿基)。繼續(xù)進(jìn)行這一過程，直至所有生物聚合物合成了所希望長度。
在所描述的曝光方法中，使用首先具有用作為保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)基團(tuán)的單體構(gòu)件，以便使得能夠進(jìn)行位置確定的合成。光的作用是用于脫除單體構(gòu)件的光不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)，以便隨后在光起作用的位置上進(jìn)行合成。光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)例如可從DE 44 44 996 A1中獲知，該文獻(xiàn)描述了對于堿基糖部分的5′-OH功能具有光不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)的核苷酸衍生物。在產(chǎn)生反應(yīng)性O(shè)H基團(tuán)之后，可以在隨后的反應(yīng)步驟中將下一個單體偶聯(lián)到反應(yīng)基團(tuán)上。采用這種方式可能通過保護(hù)基團(tuán)的交替脫除和偶聯(lián)反應(yīng)合成任何一種聚合物。
DE 199 62 803 A1描述了一種方法，在該方法中通過使用平面型載體同時合成了大量不同的且在空間上相互分開的聚合物。為此使用幾種發(fā)光二極管(二極管陣列)用于選擇性曝光。該方法利用可電控的發(fā)光二極管以選擇性地脫除保護(hù)基團(tuán)，因此沒有昂貴的掩膜同樣也行。用于需合成的生物聚合物的單體位于在透明區(qū)域下面的獨(dú)特設(shè)備之中。在該設(shè)備中可以單獨(dú)和順次提供用于待進(jìn)行的合成所需的化學(xué)物質(zhì)。使用相應(yīng)的程序，用計算機(jī)控制二極管陣列中的單個發(fā)光二極管以相應(yīng)于順次和循環(huán)地提供各個單體。為了在曝光期間排除外部的干擾影響，將化學(xué)合成的位置和曝光裝置在空間上嚴(yán)格地相互分開。因此，同樣如掩膜技術(shù)和通過微區(qū)域鏡的曝光一樣，該方法由于合成和曝光在空間上的分離主要造成曝光的不精確。在合成結(jié)束之后，芯片上不存在實際上不連續(xù)的區(qū)域，而是形成位于兩個或幾個所指定的產(chǎn)物之間的過渡產(chǎn)物。這種不精確的過渡產(chǎn)物在此特別是由于光在掩膜上的衍射效應(yīng)以及投影的不精確而造成的。
因此，本發(fā)明的任務(wù)在于，提供用于合成生物聚合物的載體，其可以避免光在掩膜上的衍射效應(yīng)以及投影的不精確，并可以在載體上選擇出準(zhǔn)確的事先指定的區(qū)域，隨后在其上進(jìn)行生物聚合物的合成。應(yīng)當(dāng)避免因缺少的、附加的或邊緣的曝光而出現(xiàn)非特異性的過渡產(chǎn)物。
該任務(wù)根據(jù)本發(fā)明通過一種用于合成生物聚合物的載體來解決，該載體具有一種基質(zhì)(在該基質(zhì)表面上合成生物聚合物)和有針對性地活化基質(zhì)部分區(qū)域的能源，其中，生物聚合物在經(jīng)活化的基質(zhì)部分區(qū)域上進(jìn)行合成，并且基質(zhì)和能源形成一個單元。通過基質(zhì)和能源形成的單元可以有效地防止光的散射和衍射效應(yīng)。如此使生物聚合物如寡核苷酸或肽的陣列在載體的整個表面上進(jìn)行合成。完全沒有位于兩個或幾個所指定的產(chǎn)物之間的進(jìn)行干擾的過渡產(chǎn)物，以使可以取消特異性的控制來發(fā)現(xiàn)“錯誤的”、由于錯誤曝光而形成的生物聚合物。通過這種方式可以在載體上以不變的面積合成較高數(shù)量的生物聚合物。
本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及傳感器芯片以及含有該載體的醫(yī)學(xué)特別是診斷或治療儀器。
除此之外，本發(fā)明還涉及合成生物聚合物的方法，在該方法中使用根據(jù)本發(fā)明的載體。根據(jù)本發(fā)明的方法的其它步驟涉及通過在經(jīng)選擇的部分區(qū)域解離保護(hù)基團(tuán)而有針對性地活化基質(zhì)部分區(qū)域，提供其本身具有保護(hù)基團(tuán)的生物單體，以及將生物單體與針對性地被活化的基質(zhì)部分區(qū)域進(jìn)行相互作用。在此用于有針對性地活化基質(zhì)部分區(qū)域的能量在載體內(nèi)部散發(fā)，由此在經(jīng)選擇的部分區(qū)域解離保護(hù)基團(tuán)。
通過根據(jù)本發(fā)明的載體和方法，各種類型的投影光學(xué)手段都是多余的，生物聚合物的生產(chǎn)只需要少量的合成技術(shù)費(fèi)用且同時導(dǎo)致合成質(zhì)量的顯著改善，因為避免出現(xiàn)了處于各個生物聚合物之間的非特異性過渡產(chǎn)物即合成終產(chǎn)物中的污染物。因此可以快速地、特別地和靈活地生產(chǎn)生物聚合物陣列。此外也可能簡單地并且有針對性和選擇性地合成生物聚合物，而且節(jié)省費(fèi)用和時間。
在下面將定義幾個在本發(fā)明的描述和闡述中使用的概念。
1.配體配體是可被確定的受體所識別的分子。配體可以天然地存在或者人工產(chǎn)生。配體的實例為細(xì)胞膜受體的激動劑和拮抗劑、毒素、病毒和細(xì)菌的表位、激素(Optiate、甾體等等)、肽、酶、酶底物、輔因子、藥物物質(zhì)、糖分子、卵磷脂、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白質(zhì)、肽和脂類。
2.受體受體是對于確定的配體具有結(jié)合親和性的分子。受體可以天然地存在或者人工產(chǎn)生。它們同樣可以其天然狀態(tài)或者作為與其它分子的聚集體而存在。受體直接地或者通過特異性的結(jié)合物質(zhì)或結(jié)合分子間接地以共價或非共價方式與配體結(jié)合。受體的實例為抗體特別是單克隆和多克隆抗體、抗血清、細(xì)胞膜受體、多核苷酸、核酸、輔因子、卵磷脂、糖分子、多糖、細(xì)胞、細(xì)胞膜和細(xì)胞器。受體與相應(yīng)的配體一起通過其分子識別形成“配體-受體復(fù)合物”。
3.有機(jī)聚合物有機(jī)聚合物是由小分子有機(jī)化合物(單體)通過聚合化反應(yīng)過程與其自身或者與其它小分子有機(jī)化合物反應(yīng)而形成的，其中所形成的產(chǎn)物(聚合物)為具有高相對分子量的化合物。有機(jī)聚合物的實例為烯烴的聚合物如聚乙烯、聚丙烯，或者也可以是經(jīng)修飾的聚合物如聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯和聚酰胺(尼龍)。
4.生物單體生物單體為一種單個的構(gòu)件或者一組或一群單個的小構(gòu)件，就其本身而言可以相互結(jié)合并由此形成生物聚合物。生物單體的實例為20種天然存在的L-氨基酸、D-氨基酸、人工合成的氨基酸、核苷酸、核苷、糖分子如戊糖或己糖以及短鏈的肽如四聚體或五聚體。正如其在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用一樣，術(shù)語“生物單體”涉及所有用于合成生物聚合物的構(gòu)件。如果用于合成作為生物聚合物的蛋白質(zhì)，不使用單個的氨基酸，而是使用短肽序列如四聚體、五聚體或六聚體，如此由四個、五個或六個氨基酸構(gòu)成的構(gòu)件同樣也稱為生物單體。
5.生物聚合物生物聚合物為各個由生物單體合成的產(chǎn)物，而不受其長度和其單個組分的影響。使用三種不同的氨基酸作為生物單體，如此將結(jié)果所得的三聚體稱為生物聚合物。生物聚合物可以由同樣的或者相互不同的生物單體合成。
6.保護(hù)基團(tuán)每個可以結(jié)合到單體上并用于單體修飾的物質(zhì)都稱為保護(hù)基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)可以通過能源的作用如曝光而選擇性地解離。通過保護(hù)基團(tuán)的解離可以將反應(yīng)性基團(tuán)如羥基游離。保護(hù)基團(tuán)的實例為硝基藜蘆氧基羰基、硝基芐氧基羰基、二甲基二甲氧基苯甲酸基羰基、5-溴-7-硝基二氫吲哚基、羥基-α-甲基肉桂?；?、2-氧亞甲蒽醌和對硝基苯基乙氧基羰基。
7.類似物或衍生物所有天然存在的和人工合成的生物單體和生物聚合物的變化物都可理解為類似物或衍生物。核酸的已知類似物例如為PNA或LNA。
下面描述了根據(jù)本發(fā)明的載體以及方法的有利實施方案。
對于生物聚合物的有效的合成，使用由聚合物層組成的三維基質(zhì)(3D基質(zhì))作為基質(zhì)?？梢允褂梅墙宦?lián)的或交聯(lián)的聚合物，具有低交聯(lián)度的交聯(lián)聚合物在此是特別合適的。合適的聚合物層具有大量的單個聚合物鏈，這些聚合物鏈與固體表面相連接。在聚合物鏈和固體表面之間優(yōu)選地存在有共價鍵。除了線性聚合物鏈之外，也可以使用分枝的聚合物鏈。在三維聚合物層的大表面上任意地形成許多位置，在這些位置上可以開始合成生物聚合物。適合于構(gòu)成3D基質(zhì)的聚合物的實例此外可以從EP 1 035 218 A1中獲知。
如果使用薄的聚合物層作為基質(zhì)，特別是具有30-3000nm的強(qiáng)度或厚度的聚合物層，則該三維聚合物層不會影響生物聚合物的合成。如果至少使用一種在部分區(qū)域可溶脹的聚合物層作為基質(zhì)，這種情況經(jīng)證實是特別有利的。在水中的溶脹能力由成分如丙烯酸、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酰胺或乙烯吡咯烷酮保證。這種聚合物層在其經(jīng)溶脹的狀態(tài)優(yōu)選地具有50-500nm的厚度。
三維聚合物層此外具有反應(yīng)性起始基團(tuán)。這些反應(yīng)性起始基團(tuán)優(yōu)選地為羥基(OH基團(tuán))，其直接與三維聚合物層相連接。此外作為另一種選擇，這些反應(yīng)性起始基團(tuán)也可以通過其它功能基團(tuán)特別是通過低分子量的化合物與聚合物層相連接。對于聚合物層與反應(yīng)性起始基團(tuán)之間的化合物，共價化合物是特別合適的，其保證了與反應(yīng)性起始基團(tuán)長久的結(jié)合。
反應(yīng)性起始基團(tuán)由保護(hù)基團(tuán)來保護(hù)。只要保護(hù)基團(tuán)連接到起始基團(tuán)之上或者說與起始基團(tuán)相連接，這些起始基團(tuán)就是失活的。只有通過保護(hù)基團(tuán)的解離，起始基團(tuán)才能獲得其活性。
可以在載體的輔助下合成的生物聚合物為受體或配體、核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、肽、多糖、脂類以及其衍生物或類似物。在合成較長的生物聚合物時使用生物聚合物的部分結(jié)構(gòu)作為單體經(jīng)證實是合理的。四聚體在此是特別合適的。將這些具有較長鏈的單體裝配形成生物聚合物。由此可以減少反應(yīng)步驟，隨之使得合成完畢的生物聚合物的純度的顯著改善和獲得較高的產(chǎn)率。以這種方式在使用256個四聚體寡核苷酸的情況下，只通過五個偶聯(lián)步驟就產(chǎn)生出任何一種十二聚體，但在以前為此需要20個偶聯(lián)步驟。使用四聚體作為生物單體特別是在合成高度同源的DNA序列時是有利的，因為對此只需要少量的作為生物單體的寡聚體。特別地也可以通過使用寡聚體作為生物單體來產(chǎn)生聚合物序列，至今這些聚合物序列由于其長度或者所需的偶聯(lián)步驟的數(shù)量而不能夠以足夠的質(zhì)量和產(chǎn)率在傳統(tǒng)的固相合成中生產(chǎn)出來。
可用電控制的發(fā)光二極管(LED)或者激光二極管(LD)適合作為對于保護(hù)基團(tuán)的解離和由此伴隨的反應(yīng)性O(shè)H基團(tuán)的活化所需的能源。當(dāng)使用發(fā)光二極管時，那么如果它們在UV范圍內(nèi)放射富含能量的輻射則是有利的。經(jīng)證實，UV光對于保護(hù)基團(tuán)的解離是特別合適的。例如某些來自III-V半導(dǎo)體的化合物稱為UV發(fā)光二極管。因此，例如由氮化鎵(GaN)構(gòu)成的LED可發(fā)射波長為380nm的光(另外見Rep.Prog.Phys.61(1998)1-75；應(yīng)用于發(fā)射短波長光的設(shè)備的第三族氮化物半導(dǎo)體(Group III nitride semiconductors for short wavelength-light-emitting devices))。此外，通過使用AlGaN化合物可以獲得200-360nm的波長。特別優(yōu)選的是在一個基質(zhì)上單片式集成幾個LED和/或其信號處理/控制器。
在一個進(jìn)一步的優(yōu)選實施形式中，載體不僅由發(fā)射光的二極管排列構(gòu)成，而且其附加地具有檢測器。通過生物分子的合成與以照相機(jī)形式構(gòu)成的檢測器的結(jié)合可以放棄各種外部的檢測。該檢測器本身可證明在基質(zhì)的表面上合成的生物聚合物與測試樣品之間的相互作用。在此，生物聚合物與其它分子之間的所有相互作用可理解為相互作用，特別是共價鍵的形成、離子型相互作用、范德華力和氫鍵。所有類型的生物或人工樣品都可以考慮作為測試樣品，特別是血液樣品、患者材料、涂片、鼻腔和咽喉沖洗液、皮屑和唾液樣品。這些樣品就其本身而言具有受體或者配體，它們可與生物聚合物(就其本身而言為配體或者受體)相互作用。例如使用單鏈核酸(單鏈DNA、RNA，單鏈cDNA)作為生物聚合物，因此可以通過兩條互補(bǔ)鏈的雜交而證明在測試樣品中存在有與這些核酸鏈互補(bǔ)的單鏈。這樣的雜交在本發(fā)明的意義中為受體/配體反應(yīng)。生物聚合物與測試樣品之間的相互作用的檢測通過化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)來進(jìn)行。對此，熒光是特別合適的。但是，也可以使用以鏈霉抗生物素蛋白為基礎(chǔ)或者以放射性標(biāo)記或非標(biāo)記的方法為基礎(chǔ)的其它檢測方法(見例如Souteyrand，E.，Cloarec，J.P.，Martin，J.R.，Wilson，C.，Lawrence，I.，Mikkelsen S.，Lawrence，M.F.1997.通過場效應(yīng)直接檢測合成的同源寡聚體DNA序列的雜交(Direct detection ofthe hybridisation of synthetic homo-oligomer DNA sequences byfield effect).J.Phys.Chem.B，1001，2980；以及DE 4318519 C2，電化學(xué)傳感器(Elektrochemischer Sensor))。特別優(yōu)選的是在該基質(zhì)上單片式集成這些傳感器和其信號處理器。
經(jīng)證實特別有利的是，如果由基質(zhì)和能源所組成的單元非常緊密，而且基質(zhì)和能源之間的平均間距小于10μm。
由于這一微小的間距，生物聚合物的合成在能源附近進(jìn)行。因此，起始基團(tuán)或正在增長的生物聚合物在空間上位于發(fā)光二極管的附近，該發(fā)光二極管可發(fā)射用于保護(hù)基團(tuán)的解離所需的UV光。通過起始基團(tuán)和發(fā)光二極管之間在空間上的接近可以有效地避免光的散射光效應(yīng)以及衍射效應(yīng)?；|(zhì)和能源之間的微小間距特別是可以通過在發(fā)射UV的發(fā)光二極管上直接涂一層基質(zhì)來達(dá)到。在這種情況下，γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷適合作為基質(zhì)，其在加涂層的過程中可以涂布于發(fā)光二極管之上。
本發(fā)明的這一實施形式附加地在

圖1中進(jìn)行了描述。載體1具有能源5和基質(zhì)3，在該基質(zhì)表面上合成生物聚合物7。能源5是以LED的形式出現(xiàn)的。該LED具有含有絕緣體9的pn-過渡(pn-bergang)。在該pn-過渡上產(chǎn)生光子，因此這就成為能源5。基質(zhì)3和能源5之間小于10μm的平均間距是由絕緣體9來決定的。
本發(fā)明的另一種實施形式在圖3中進(jìn)行了描述。載體1仍具有基質(zhì)3和能源5。在這一實施形式中，能源5由大量的LED構(gòu)成，致使在基質(zhì)3之上可以同時合成大量的生物聚合物7(陣列排列)。
本發(fā)明的另一目的為合成生物聚合物的方法，在該方法中使用根據(jù)本發(fā)明的載體。準(zhǔn)備好該載體，隨后通過在經(jīng)選擇的部分區(qū)域中解離保護(hù)基團(tuán)而將基質(zhì)的部分區(qū)域進(jìn)行有針對性的活化。隨后向這些區(qū)域提供在其上具有保護(hù)基團(tuán)的生物單體，生物單體在此與經(jīng)針對性活化的基質(zhì)部分區(qū)域相互作用?？梢灾貜?fù)進(jìn)行以下的連續(xù)循環(huán)，即有針對性地活化基質(zhì)部分區(qū)域、提供生物單體以及生物單體與經(jīng)針對性活化的基質(zhì)部分區(qū)域之間相互作用，直至形成所希望的生物聚合物。在根據(jù)本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)，對于有針對性地活化基質(zhì)部分區(qū)域所需的能量總是從載體的內(nèi)部發(fā)射出來。為此，由能源和基質(zhì)所構(gòu)成的緊密單元是特別合適的。
為了同時合成大量不同的聚合物，可以通過計算機(jī)輔助而選擇和活化部分區(qū)域。
為了解離保護(hù)基團(tuán)以活化反應(yīng)性起始基團(tuán)(優(yōu)選的為OH基團(tuán))，可以使用局部的pH值改變。為此根據(jù)本發(fā)明的載體具有電極結(jié)構(gòu)作為能源。通過加載電壓和電流可以獲得非常強(qiáng)的局部pH值改變。在此于單個電極之間可以達(dá)到大約5的pH差值。保護(hù)基團(tuán)的去除例如可以在pH值為2的情形下實現(xiàn)。當(dāng)在電極上加載負(fù)電壓時，通過電極上水的電解可形成堿性環(huán)境。酸性環(huán)境可通過在電極上加載正電壓來形成。在電極上電解水時進(jìn)行著以下化學(xué)反應(yīng)(正電壓時)；以及(負(fù)電壓時)。
當(dāng)中性pH值為7時，反應(yīng)性起始基團(tuán)由完整的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)著。因為通過正電壓可以形成pH值的局部降低，所以保護(hù)基團(tuán)可通過微電極上的正電壓而選擇性地去除，這些微電極通過由能源和基質(zhì)所組成的單元直接位于保護(hù)基團(tuán)的附近。此外，特別有利的是，如果在電極的附近存在pH值測量設(shè)備(pH-ISFET)，借此一方面可以檢測存在的pH值，另一方面可以對電極進(jìn)行電控制，由此可引起pH值的局部改變。
該實施形式附加地給出在圖4之中。載體1具有基質(zhì)3和以電極51以及53的形式存在的能源。在圖4的左側(cè)指出了加載電壓/電流的電極51。其pH值為7。在右側(cè)指出了不加載電壓/電流的電極53。其pH值為2。將檢測器13安排成pH-ISFET，其用于檢測由電極所形成的局部pH值。
對于生物聚合物的生產(chǎn)，在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以使用任何的生物單體。特別合適的為核苷酸、寡核苷酸特別是四聚體、氨基酸、肽、糖特別是單糖和二糖和/或其衍生物或類似物。
對于不同的篩選方法，生物單體可以來源于cDNA-、RNA-、基因組DNA-文庫和/或肽-文庫。
在供給裝置中提供生物單體經(jīng)證實是特別有利的。此外，對于生物聚合物的合成有利的反應(yīng)步驟如洗滌步驟同樣可以在供給裝置中進(jìn)行。在供給裝置中，表面用相應(yīng)的反應(yīng)溶液特別是生物單體進(jìn)行濕潤或進(jìn)行涂布。供給裝置可以微射流透明小容器或微射流小室的形式構(gòu)成。為了避免污染，經(jīng)證實有利的是，具有至少一個反應(yīng)溶液或生物單體的供給裝置，以及至少一個與供給裝置在空間上分離的排出裝置。微射流透明小容器的上側(cè)在此可同時用作為光阱，從而可以將由散射光引起的載體的錯誤曝光排除在外。特別有利的是，如果在芯片上或者集成地或者混雜地形成溝道，則可防止其它LED的散射光或者類似情況。
這一實施形式附加地在圖2中給出。載體1具有基質(zhì)3、能源5以及絕緣體9。生物聚合物7的合成在基質(zhì)3的凹處進(jìn)行，其被做成了溝道11。
此外，經(jīng)證實有利的是使用電場來將帶電荷的生物單體引導(dǎo)至經(jīng)活化的基質(zhì)部分區(qū)域?；|(zhì)的部分區(qū)域可通過加載至少一個電場而挑選出來。為此，保護(hù)基團(tuán)被完全脫除，隨后順次提供帶電荷的生物單體。帶電荷的生物單體由電場吸引向被選擇的位置，同時其在不希望的位置受到電排斥。因此，通過順次提供四種不同的并用保護(hù)基團(tuán)修飾的堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤可以形成生物聚合物。通過帶電荷的核苷酸在電場中相應(yīng)的吸引或排斥可以將它們引導(dǎo)至所希望的基質(zhì)上的位置。在去除結(jié)合了的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)之后，重新加載電場和提供新的核苷酸直至生物聚合物達(dá)到所希望的長度。
如果在根據(jù)本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)使用如上所述具有檢測器的載體，那么根據(jù)本發(fā)明的方法可以具有附加的步驟。將經(jīng)合成的生物聚合物與測試樣品反應(yīng)，和通過生物化學(xué)反應(yīng)特別是通過生物和/或化學(xué)熒光來證明受體-配體復(fù)合物的存在。
本發(fā)明的另一目的涉及具有根據(jù)本發(fā)明的載體的傳感器芯片。此外，本發(fā)明還涉及同樣含有根據(jù)本發(fā)明的載體的醫(yī)學(xué)特別是診斷或治療儀器。例如在傳感器芯片特別是DNA傳感器芯片上用作感受元件，從而本發(fā)明形成了一種使用樣品分子的、位置不固定且可攜帶的DNA分析法，在前述的分析過程中已可得出其應(yīng)用可能性。當(dāng)傳染病爆發(fā)時，可以使用這種傳感器芯片或醫(yī)學(xué)儀器來就地鑒定細(xì)菌或病毒的病原體，和區(qū)分受感染的與未受感染的人。此外，通過安裝邏輯電子元件，儀器可以自行處理對于DNA分析法復(fù)雜的問題例如生物聚合物設(shè)計。因此，由于預(yù)先確定的疑難問題，醫(yī)學(xué)儀器可以自行發(fā)展相應(yīng)的傳感器芯片，然后其合成所需的生物聚合物并最終分析結(jié)果。
圖1-4用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。其中顯示圖1.第一個本發(fā)明的實施形式，其中以簡單的方式描繪了基質(zhì)和能源之間的單元；圖2.第二個本發(fā)明的實施形式，其中生物聚合物在基質(zhì)的凹處(溝道)中形成；圖3.本發(fā)明的另一實施形式，在此使用大量的LED用于同時合成大量的生物聚合物；以及圖4.一個本發(fā)明可替換的實施形式，其中以圖解的形式描繪了通過局部pH值改變來去除保護(hù)基團(tuán)。
下面的實施例用于更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，其為一個簡單的實施例。
實施例1.給傳感器加涂層CMOS傳感器用硅烷涂覆2個小時，這是通過將傳感器浸于由1％γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(＝1％GOPS)和于甲苯中的0.1％三乙胺組成的溶液中而實現(xiàn)的。隨后讓芯片控干，并在干燥柜中于120℃固定大約2個小時?？蓪?zhǔn)備好的芯片在除濕的條件下貯藏，直至用保護(hù)基團(tuán)涂覆。
2.通過羥基來功能化經(jīng)硅烷涂覆的芯片將所述經(jīng)預(yù)處理的芯片在高溫度的(70℃)乙二醇中溫育1個小時，該乙二醇含有催化有效量的濃硫酸。隨后將芯片在乙醇中洗滌并干燥。在此處理后，該芯片具有了通過羥基功能化的表面，OH基團(tuán)在此為反應(yīng)性起始基團(tuán)。
3.在起始基團(tuán)上加上保護(hù)基團(tuán)在芯片表面上的起始基團(tuán)通過加上pNPEOC基團(tuán)來保護(hù)。為此將經(jīng)預(yù)處理的芯片在2-(5-甲氧基-2-硝苯基)-乙氧基羰基氯的二氯甲烷溶液中于-15℃并在無光的條件下溫育4個小時。保護(hù)基團(tuán)具有下面的化學(xué)分子式 然后將芯片在冷的二氯甲烷中進(jìn)行漂洗。將芯片干燥并避光保存直至使用。
4.在使用UV光的條件下于經(jīng)預(yù)處理的芯片之上合成生物聚合物將經(jīng)預(yù)處理的芯片放入供給室之中，然后通過用UV發(fā)光二極管活化2分鐘從而在預(yù)先確定的區(qū)域選擇性地解離保護(hù)基團(tuán)。隨后將芯片在無水乙腈中進(jìn)行漂洗，并與溶解在乙腈中的第一個核苷酸進(jìn)行溫育。為此可使用具有pNEPOC保護(hù)基團(tuán)的商業(yè)上通用的核苷酸。隨后將芯片再次用乙腈進(jìn)行洗滌，并通過重新的選擇性曝光來去除其它或另外的保護(hù)基團(tuán)。以這種方式可以將所有的位置進(jìn)行選擇性的去保護(hù)，在這些位置上應(yīng)當(dāng)有用腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶或者胸苷修飾的核苷酸。在所有四種核苷酸偶聯(lián)之后，在芯片上的所有位置之上再次存在有pNEPOC保護(hù)層，隨后可以通過有針對性的去保護(hù)和添加核苷酸來開始合成下一次的核苷酸層。
商業(yè)上通用的胸苷或胞嘧啶衍生物的實例-5′-O-(2-(2-氯-6-硝苯基)乙氧基羰基胸苷-3′-O((β-氰基乙氧基)(N，N-二異丙胺基)氨基磷酸鹽)-5′-O-(2-(2-氯-6-硝苯基)乙氧基羰基)-N-4-(4-硝苯基)乙氧基羰基)2′-脫氧胞苷-3′-O((β-氰基乙氧基)(N，N-二異丙胺基)氨基磷酸鹽)
相關(guān)符號列表1 載體3 基質(zhì)5 能源51 電極-pH＝753 電極-pH＝27 生物聚合物9 絕緣體11 溝道13 檢測器
權(quán)利要求
1.用于合成有機(jī)聚合物，特別是生物聚合物的載體，其具有一種基質(zhì)，在該基質(zhì)表面上合成生物聚合物，并具有針對性地活化基質(zhì)部分區(qū)域的能源，生物聚合物在經(jīng)活化的基質(zhì)部分區(qū)域上進(jìn)行合成，其特征在于，基質(zhì)和能源形成一個單元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，基質(zhì)為可溶脹的、具有反應(yīng)性起始基團(tuán)的三維聚合物層。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，聚合物層由非交聯(lián)的或交聯(lián)的，特別是具有低交聯(lián)度的交聯(lián)聚合物所組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的載體，其特征在于，聚合物層具有30-3000nm的厚度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于，經(jīng)溶脹的聚合物層具有50-500nm的厚度。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任何一項所述的載體，其特征在于，反應(yīng)性起始基團(tuán)直接或者通過其它功能基團(tuán)與聚合物層共價鍵連結(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6中任何一項所述的載體，其特征在于，反應(yīng)性起始基團(tuán)為OH基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任何一項所述的載體，其特征在于，反應(yīng)性起始基團(tuán)由非反應(yīng)性保護(hù)基團(tuán)來保護(hù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項所述的載體，其特征在于，生物聚合物為受體、配體、核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、肽、多糖、脂類和/或其衍生物或類似物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項所述的載體，其特征在于，能源為至少一個可電控的發(fā)光二極管(LED)或者至少一個激光二極管(LD)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的載體，其特征在于，發(fā)光二極管在UV范圍內(nèi)放射富含能量的輻射。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任何一項所述的載體，其特征在于，該載體另外具有至少一個檢測器。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的載體，其特征在于，檢測器以照相機(jī)的形式構(gòu)成。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的載體，其特征在于，檢測器檢測在基質(zhì)表面合成的生物聚合物與測試樣品之間的相互作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的載體，其特征在于，測試樣品包括配體、受體、蛋白質(zhì)、抗體、肽、核酸和/或其衍生物或類似物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的載體，其特征在于，通過(生物)化學(xué)反應(yīng)，特別是通過熒光、放射性和/或非放射性標(biāo)記方法，特別是通過鏈霉抗生物素蛋白的生物素化反應(yīng)來檢測相互作用來進(jìn)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任何一項所述的載體，其特征在于，固定在基質(zhì)中的生物分子與能源的之間的平均間距小于10μm。
18.根據(jù)權(quán)利要求10-17中任何一項所述的載體，其特征在于發(fā)射UV的發(fā)光二極管用基質(zhì)，特別是用γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷涂覆。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的載體，其特征在于，能源單片式集成在載體之中。
20.合成生物聚合物的方法，其包括下列步驟(a)準(zhǔn)備根據(jù)權(quán)利要求1-19中任何一項所述的載體；(b)通過在經(jīng)選擇的部分區(qū)域解離保護(hù)基團(tuán)來有針對性地活化基質(zhì)的部分區(qū)域；(c)提供生物單體，其本身具有保護(hù)基團(tuán)；(d)生物單體與在步驟(b)中有針對性地活化了的基質(zhì)部分區(qū)域相互作用；(e)視需要重復(fù)步驟(b)-(d)；其特征在于，在載體內(nèi)部發(fā)射出用于步驟(b)中的活化的能量。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，借助計算機(jī)來選擇和活化所述部分區(qū)域。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其特征在于，保護(hù)基團(tuán)通過局部pH值改變而解離。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，局部pH值通過至少一個加載正電壓的電極來改變。
24.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任何一項所述的方法，其特征在于，生物單體為核苷酸、寡核苷酸特別是四聚體、氨基酸、肽、糖特別是單糖和二糖和/或其衍生物或類似物。
25.根據(jù)權(quán)利要求20-24中任何一項所述的方法，其特征在于，生物單體來源于cDNA-、RNA-、基因組DNA-文庫和/或肽-文庫。
26.根據(jù)權(quán)利要求20-25中任何一項所述的方法，其特征在于，生物單體在供給裝置中供給。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，供給裝置以微射流透明小容器或微射流小室的形式構(gòu)成，其具有至少一種生物單體的供給裝置以及至少一個與供給裝置在空間上分離的排出裝置。
28.根據(jù)權(quán)利要求20-27中任何一項所述的方法，其特征在于，生物單體是帶電荷的，并且通過加載至少一個電場而選擇基質(zhì)的部分區(qū)域。
29.根據(jù)權(quán)利要求20-28中任何一項所述的方法，其特征在于，該方法附加地包括以下步驟(f)經(jīng)合成的生物單體與測試樣品反應(yīng)；(g)通過(生物)化學(xué)反應(yīng)，特別是通過熒光、放射性和/或非放射性標(biāo)記方法，特別是通過鏈霉抗生物素蛋白的生物素化反應(yīng)來檢測它們之間的相互作用。
30.具有根據(jù)權(quán)利要求1-19中任何一項所述的載體的傳感器芯片。
31.具有根據(jù)權(quán)利要求1-19中任何一項所述的載體的醫(yī)學(xué)儀器特別是診斷或治療儀器。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于合成生物聚合物的載體、其應(yīng)用以及生產(chǎn)生物聚合物的方法。
文檔編號B01J19/00GK1599640SQ02824083
公開日2005年3月23日 申請日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月16日
發(fā)明者H·克拉普羅斯, M·勒曼恩, I·弗倫德, J·斯特肯 申請人:邁克納斯公司