專利名稱：核酸的擴(kuò)增方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)療領(lǐng)域等中診斷以及研究中使用的靶核酸的擴(kuò)增方法、檢測用試劑、以及其裝置。
背景技術(shù)：
作為用于檢測微量核酸的技術(shù)，在各種各樣的核酸擴(kuò)增方法中使用被標(biāo)記的寡聚物或終止物等檢測生成的核酸。
例如，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法合成與單鏈或雙鏈的靶核酸的序列互補(bǔ)的兩種寡聚物，過量加到耐熱性DNA聚合酶存在下的反應(yīng)液中。如果反應(yīng)液中存在靶核酸，寡聚物與靶核酸的特定部位結(jié)合。而聚合酶通過連續(xù)附加與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸，使這些聚合物的3’末端延伸。通過連續(xù)地升降溫度，延伸的聚合物作為生成的核酸與靶核酸分離，與原來靶核酸同樣可以與寡聚物結(jié)合。通過重復(fù)該過程，可以使兩種聚合物之間的靶核酸成指數(shù)擴(kuò)增。
還有，LCR(連接酶連鎖反應(yīng))法，在有溫度穩(wěn)定DNA連接酶存在下的反應(yīng)液中加入過量的兩種鄰接的寡核苷酸探針和與他們互補(bǔ)的探針。各個(gè)探針與靶序列結(jié)合，通過DNA連接酶連接兩種鄰接結(jié)合的探針。然后與PCR法同樣，通過連續(xù)地升降溫度，連接的探針與靶序列分離，與原來的靶核酸同樣與探針結(jié)合。
另外，作為核酸擴(kuò)增法也可以利用RCR(修復(fù)連鎖反應(yīng))法、TAS法、3SR法、NASBA法、SPSR法、LAT法、SDA法等。
其中，特別是PCR法可以作為各種樣品中的核酸的高靈敏度分析法使用，被用于傳染病或遺傳病、癌的診斷等。另外，PCR法也是適用于移植或親子鑒定時(shí)的DNA類型檢查。此時(shí)，成為分析或檢查對(duì)象的核酸往往使用被標(biāo)記的寡聚物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?，F(xiàn)在，作為標(biāo)記使用的化學(xué)物質(zhì)的開發(fā)或通過檢測裝置的改良，即使微量也能夠檢測。
在上述的核酸擴(kuò)增法中，有各種各樣的試劑盒等銷售，作為標(biāo)記方法被簡化，通常，使用由發(fā)光體標(biāo)記的寡聚物可以大量擴(kuò)增靶核酸。而為了用檢測靈敏度提高的序列儀或反應(yīng)板閱讀儀等對(duì)擴(kuò)增的靶核酸進(jìn)行檢測，一般都是將該樣品稀釋為裝置的檢測范圍內(nèi)使用。因此，為了能夠通過檢測裝置進(jìn)行測定將生成核酸的濃度最適化，需要對(duì)樣品進(jìn)行分注、稀釋等繁雜的操作。另外，在自動(dòng)化進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增等情況，需要用于稀釋的工程或裝置配件等。
在上述的測定方法中，一次測定只使用生成核酸的數(shù)十分之一。而生成核酸的測定次數(shù)也在幾乎所有的情況下都是數(shù)次。因此，也可以使用不需要標(biāo)記的寡聚物。然而，在現(xiàn)在的核酸擴(kuò)增法中，對(duì)于作為靶模板核酸，由于需要一定量以上的寡聚物，所以也不能簡單地減少被標(biāo)記的寡聚物。今后，如果基因診斷等發(fā)達(dá)起來，雖然在多數(shù)檢體中需要進(jìn)行相同靶部位的擴(kuò)增，但此時(shí)如果能夠減少被標(biāo)記的寡聚物的使用量，就可以使每一檢體需要的費(fèi)用降低。
為了解決這些問題，期盼簡便、而且費(fèi)用低的標(biāo)記核酸擴(kuò)增法。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，使用標(biāo)記或修飾的寡聚物和該標(biāo)記或沒有該標(biāo)記的寡聚物的混合物，對(duì)任意核酸進(jìn)行擴(kuò)增?；旌衔镎{(diào)整含有生成核酸的溶液中的該標(biāo)記或該發(fā)光體的量在檢測裝置的測定范圍內(nèi)。另外，在使用修飾的寡聚物時(shí)，使發(fā)光體結(jié)合在修飾基團(tuán)上。
本發(fā)明與以往的方法比較，由于標(biāo)記或修飾的寡聚物的使用量降低，預(yù)計(jì)可以降低用于擴(kuò)增的成本。另外，由于省略了生成核酸的稀釋等操作，特別是在從多個(gè)樣品擴(kuò)增同一靶核酸時(shí)，可以縮短操作時(shí)間。
以下，對(duì)于上述以及其他本發(fā)明的新的特征和效果，參照?qǐng)D進(jìn)行說明。另外，在本說明書中，用語定義如下。
所謂“標(biāo)記”包括為了檢測生成的核酸，附加到寡聚物的熒光體、發(fā)光體、放射性同位素。
所謂“標(biāo)記和被標(biāo)記”包括將上述熒光體、發(fā)光體、放射性同位素附加和被附加到寡聚物或核酸。
所謂“靶核酸”包括在擴(kuò)增反應(yīng)中的反應(yīng)液中含有的核酸中，由可任意擴(kuò)增的堿基序列構(gòu)成的核酸。
所謂“生成核酸”以及“生成DNA”包括不論標(biāo)記或修飾的、還是沒有標(biāo)記或修飾的在擴(kuò)增反應(yīng)中生成的核酸以及DNA。
所謂“與靶核酸相關(guān)的序列”包括與靶核酸的堿基序列相同或互補(bǔ)的序列的一部分或全部。
所謂“作為模板的核酸”包括含有靶核酸、在反應(yīng)開始時(shí)存在的核酸。另外，在擴(kuò)增反應(yīng)中，雖然生成核酸也可作為模板，但在本發(fā)明中，與作為模板的核酸有區(qū)別。


圖1是標(biāo)記核酸的生成方法的梗概圖。
圖2是適用的核酸分析裝置的一實(shí)施例。
圖3是圖2的核酸分析裝置的變形例。
圖4是實(shí)施例1的核酸擴(kuò)增法的梗概圖。
圖5是被標(biāo)記的ALD-F引物的比例為1/50時(shí)的解析結(jié)果。
圖6是被標(biāo)記的ALD-F引物的比例為1/100時(shí)的解析結(jié)果。
圖7是實(shí)施例2的提取·擴(kuò)增部100的外觀圖。
圖8是實(shí)施例2的提取·擴(kuò)增部100的平面圖。
圖9是實(shí)施例2的吸頭向噴嘴的裝卸動(dòng)作圖。
具體實(shí)施例方式
核酸擴(kuò)增法、例如PCR法是選擇夾住作為單鏈或雙鏈DNA的靶部位的兩個(gè)部位，使成為DNA復(fù)制起點(diǎn)的寡聚物分別附著在上述兩個(gè)部位，通過使用DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)只使需要的部位擴(kuò)增的方法。
此時(shí)使用的寡聚物通常由20～25個(gè)堿基構(gòu)成，需要對(duì)擴(kuò)增部位進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，使用在該寡聚物附加了發(fā)光體等標(biāo)記物質(zhì)的寡聚物。
在以往的標(biāo)記方法中，添加的標(biāo)記寡聚物在反應(yīng)液中的濃度僅為0.2μM～2μM，擴(kuò)增后，稀釋到檢測裝置的測定范圍后，進(jìn)行測定·檢測。
在本發(fā)明中，就象圖1所表示的那樣，使用標(biāo)記的寡聚物(以下稱為寡聚物A)和與該寡聚物相同堿基序列，沒有標(biāo)記的寡聚物(以下稱為寡聚物B)的混合物，進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(PCR、LCR等)。此時(shí)，寡聚物A和寡聚物B也可以不是相同堿基序列，而是具有靶核酸中含有的任意特定序列的寡聚物。另外，寡聚物A和寡聚物B的堿基數(shù)即使不同也可以。
這兩種寡聚物以混合量比為1∶1～1∶10000，最好是1∶10～1∶500的比例混合，在反應(yīng)液中兩者合計(jì)添加為0.2μM～2μM后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增工序后，雖然生成標(biāo)記的核酸和沒有標(biāo)記的核酸的混合物，但不進(jìn)行稀釋等濃度調(diào)整也可以進(jìn)行測定·檢測等。
將以往的靶核酸的擴(kuò)增、生成核酸的稀釋、檢測以及分析與本發(fā)明的擴(kuò)增、檢測以及分析進(jìn)行對(duì)比，兩者都可以得到同樣的結(jié)果。
圖2示出了本發(fā)明的核酸檢測以及分析裝置的概念圖。本裝置由提取部、混合部、擴(kuò)增部、檢測部、信號(hào)處理裝置、以及操作和輸出部構(gòu)成。提取部是由生物樣品提取作為模板核酸的機(jī)構(gòu)。例如，可以利用特開2000-166556號(hào)記載的裝置。混合部是將各個(gè)定量的寡聚物A和寡聚物B混合，制備寡聚物混合物的機(jī)構(gòu)。擴(kuò)增部是將核酸、寡聚物混合物、以及核酸擴(kuò)增試劑混合，通過例如PCR法或恒溫?cái)U(kuò)增法對(duì)所定核酸進(jìn)行擴(kuò)增的機(jī)構(gòu)。檢測部和信號(hào)處理裝置是對(duì)擴(kuò)增的所定核酸進(jìn)行檢測的機(jī)構(gòu)。而操作和輸出部可以控制上述各機(jī)構(gòu)、對(duì)生物樣品中含有的所定核酸進(jìn)行檢測、以及分析。另外，就象圖3示出的那樣，也存在沒有混合部、利用制備好的寡聚物混合物的核酸檢測以及分析裝置等的變形例。
檢測以及分析按照以下步驟進(jìn)行。首先，借助于操作和輸出部進(jìn)行檢測和分析的操作。根據(jù)該指示，在提取部提取作為模板的核酸。然后在混合部，使標(biāo)記的或附加修飾基團(tuán)的寡聚物和具有與上述標(biāo)記的、或標(biāo)記修飾基團(tuán)的寡聚物相同堿基序列，且沒有被標(biāo)記，或附加修飾基團(tuán)的寡聚物混合。使用該寡聚物的混合物，在擴(kuò)增部擴(kuò)增靶核酸。在檢測部，被擴(kuò)增的靶核酸通過檢測器被檢測或分析。該檢測數(shù)據(jù)通過信號(hào)處理裝置處理，該結(jié)果被發(fā)送到輸出部。上述各個(gè)部構(gòu)成一體化的裝置有利于提高檢測·分析效率而優(yōu)選。因此，在本發(fā)明中，在擴(kuò)增部和檢測部之間不是特別需要對(duì)被擴(kuò)增的靶核酸進(jìn)行稀釋的機(jī)構(gòu)。
靶核酸的擴(kuò)增反應(yīng)液使用一般經(jīng)常用的緩沖液(例如，Tris-HCl緩沖液)、耐熱性DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)、鹽類(例如氯化鎂)、脫氧核苷三磷酸、模板DNA(例如人基因組DNA)進(jìn)行制備。反應(yīng)液通過一般常用的變性、退火、延伸的溫度循環(huán)進(jìn)行，由于靶核酸和DNA寡聚物的序列堿基數(shù)不同而多少有些差異。
另外，在使用一般的不含有擴(kuò)增用寡聚物的PCR用試劑盒(例如，寶酒造公司PCR擴(kuò)增試劑盒)時(shí)，向反應(yīng)液中添加上述寡聚物A和寡聚物B的混合量比為1∶1～1∶10000，最好是1∶10～1∶500，使該寡聚物總量達(dá)到試劑盒指定的濃度，按照指定的溫度循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)。
在進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增反應(yīng)的同時(shí)還進(jìn)行其他反應(yīng)(例如，RT-PCR)時(shí)，寡聚物A和寡聚物B的混合量比以1∶1～1∶10000，最好是1∶10～1∶500比例混合，使其總量達(dá)到適合反應(yīng)的濃度，也使用試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。通過這樣反應(yīng)，生成核酸中的發(fā)光強(qiáng)度或放射活性適合于檢測或分析。
作為核酸擴(kuò)增法，除了PCR法之外，還可舉RCR(修復(fù)連鎖反應(yīng))法、TAS法、3SR法、NASBA法、SPSR法、LAT法、SDA法等，只要是使用上述寡聚物的混合物進(jìn)行的方法并沒有特別限定。
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，可以不用稀釋通過檢測裝置進(jìn)行檢測或分析。此時(shí)，不是通過一邊進(jìn)行生成核酸分離，一邊進(jìn)行檢測的裝置(例如，DNA測序儀)，而是通過對(duì)反應(yīng)液中的生成核酸進(jìn)行檢測的裝置(例如，熒光反應(yīng)板閱讀儀)除去未反應(yīng)的寡聚物。
使用附加了修飾基團(tuán)的聚合物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)后，借助于該修飾基團(tuán)對(duì)附加了備有光電子倍增管、光電二極管、CCD元件等光檢測器的裝置能夠檢測或測定那樣的發(fā)光體進(jìn)行處理后，進(jìn)行測定或檢測。另外，在本發(fā)明的核酸檢測和分析裝置中，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，可以在擴(kuò)增部借助于該修飾基團(tuán)對(duì)附加發(fā)光體進(jìn)行處理后，進(jìn)行檢測或分析。
另外，對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中使用的寡聚物進(jìn)行標(biāo)記的物質(zhì)只要是在靶核酸檢測時(shí)，能夠被備有本發(fā)明的檢測部所檢測的，就沒有特別限制，可以是熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素等。這些物質(zhì)發(fā)光強(qiáng)度高、即使微量也可以檢測或分析。另外，修飾基團(tuán)可以使用磷酸基、氨基、巰基、生物素、地高辛配基等，無論哪一種修飾基團(tuán)都容易附加熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
還有，對(duì)于擴(kuò)增的靶核酸的檢測方法只要是用上述檢測器能夠檢測的，就沒有特別限定，測定裝置只要是備有DNA分析器、凝膠圖像分析儀、熒光分光光度計(jì)、測序儀、反應(yīng)板閱讀儀等檢測部的裝置，就沒有特別限定。
在以往的方法中，核酸擴(kuò)增時(shí)，由于全部的生成核酸被標(biāo)記、或附加了修飾基團(tuán)，所以制備出大大過量的標(biāo)記或修飾的靶核酸。為了能夠用檢測裝置進(jìn)行檢測，就要將生成核酸的濃度最適化，所以需要對(duì)樣品進(jìn)行分注、稀釋等繁雜的操作。另外，在使靶核酸擴(kuò)增自動(dòng)化進(jìn)行的情況等，需要用于稀釋的工程或裝置部件。在本發(fā)明中，可以降低標(biāo)記或修飾使用的熒光體、發(fā)光體和放射性同位素的使用量，預(yù)計(jì)可降低成本。
以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1通過本實(shí)施例就對(duì)特定的基因(例如作為靶序列，醛縮酶)區(qū)域進(jìn)行檢測的方法進(jìn)行說明。本方法由從檢體提取作為模板的DNA的提取工序、用于對(duì)模板DNA中的靶核酸部進(jìn)行擴(kuò)增的引物組的制備工序、擴(kuò)增反應(yīng)工序以及檢測工序構(gòu)成。
作為檢體可以使用人外周血(全血)、來自活組織檢查的組織片、尿等。從這些檢體提取基因組DNA可以通過眾所周知的方法進(jìn)行。例如，對(duì)于人外周血，可以使用QIAGEN公司的DNA Blood Mini Kit。具體來說，按照試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)程序，向1.5ml微量管中加入人全血200μL、QIAGEN蛋白酶20μL。然后，加緩沖液AL200μL，使用voltex充分?jǐn)嚢韬?，?6℃下進(jìn)行10分鐘的溫育。然后對(duì)微量管進(jìn)行離心，收集液體，加乙醇200μL，再用voltex充分?jǐn)嚢?。將全部該混合液注入到收集管中的旋轉(zhuǎn)柱，于8000rpm下離心1分鐘，使液體通過柱，將基因組DNA捕捉在柱內(nèi)。然后將同一旋轉(zhuǎn)柱移到新的收集管中，打開蓋，向旋轉(zhuǎn)柱中注入緩沖液AW1500μL，于8000rpm下離心1分鐘。再將旋轉(zhuǎn)柱移到新的收集管中，注入緩沖液AW2500μL，于14000rpm下離心3分鐘，進(jìn)行柱的洗滌。再將旋轉(zhuǎn)柱移動(dòng)新的收入緩沖液AE100μL，于8000rpm下離心3分鐘，進(jìn)行柱的洗滌。再將旋轉(zhuǎn)柱移到新的收集管中，注入緩沖液AE100μL，于8000rpm下離心1分鐘，使捕捉的基因組DNA溶液洗脫，獲得基因組DNA。另外，通過使用吸光光度計(jì)對(duì)洗脫的基因組DNA溶液進(jìn)行測定，對(duì)洗脫液中的核酸量進(jìn)行定量。
對(duì)于尿的情況，首先將采集到離心沉淀管的尿于1000rpm下離心5分鐘，只收集沉渣，然后向沉渣中加生理鹽水，使其再分散，進(jìn)行清洗，再次于1000rpm下離心5分鐘，收集沉渣作為樣品。然后，進(jìn)行眾所周知的蛋白酶K消化，通過酚·氯仿萃取等提取基因組DNA。對(duì)于組織切片也可以同樣操作。另外，也可以使用于-80℃下冷凍保存的尿沉渣物、組織片、血液的白血球的樣品。
作為PCR擴(kuò)增用引物使用以下3種聚核苷酸。
5’FAM-GGGCTTGACTTTCCAACACG 3’ (ALD-FF引物)5’GGGCTTGACTTTCCAACACG 3’ (ALD-FN引物)5’TCTAGCCTCAATCCTCATAC3’ (ALD-R引物)
ALD-FF引物和ALD-FN引物是都具有同一序列的聚核苷酸，可以與靶序列的醛縮酶基因區(qū)域的一部分進(jìn)行雜交，都可作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的正向引物使用。ALD-FF引物是在其5’末端結(jié)合了作為熒光體的FAM的標(biāo)記聚核苷酸，通過熒光檢測可以檢測。ALD-FN引物是沒有標(biāo)記的聚核苷酸。熒光體向聚核苷酸的標(biāo)記可以通過眾所周知的方法進(jìn)行。
ALD-R引物可以與靶序列的醛縮酶基因區(qū)域的一部分進(jìn)行雜交，作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的反向引物使用。
對(duì)于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的正向引物溶液，將ALD-FF引物和ALD-FN引物配制成1∶100的濃度比，以總體為25μM的濃度。
對(duì)于反向引物溶液，使用將ALD-R配制成25μM的溶液。
參照?qǐng)D4對(duì)本工序進(jìn)行說明。在本工序中，使用上述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
將作為模板的基因組DNA1μg、2mM的dNTP5μL、50mM的MgCl21.5μL、10×Tsp緩沖液5μL、滅菌水35.1μL、TspDNA聚合酶0.4μL、25μM的正向引物混合溶液(ALD-FF引物∶ALD-FN引物＝1∶100的混合液)1μL、25μM的反向引物溶液1μL混合。PCR反應(yīng)條件，最初的變性條件為94℃下進(jìn)行2分鐘，擴(kuò)增溫度循環(huán)為94℃30秒鐘、57℃30秒鐘、72℃60秒鐘，進(jìn)行10次循環(huán)；然后反復(fù)進(jìn)行89℃30秒鐘、57℃30秒鐘、72℃60秒鐘，進(jìn)行20次循環(huán)，最后于72℃下進(jìn)行7分鐘延伸反應(yīng)。接下來對(duì)PCR擴(kuò)增的生成核酸進(jìn)行檢測。對(duì)此，在后面進(jìn)行敘述。
為了比較，用以往方式進(jìn)行PCR反應(yīng)。此時(shí)，作為正向引物溶液只使用ALD-FF引物溶液。其他的濃度、液量、反應(yīng)條件等都同樣設(shè)定。對(duì)本實(shí)施例中的PCR條件下的生成DNA量與在以往PCR條件下的生成DNA量進(jìn)行比較。比較通過眾所周知的凝膠電泳進(jìn)行。對(duì)于凝膠電泳裝置使用Mupid(アドバンス公司生產(chǎn))。使用凝膠為瓊脂糖。首先向本實(shí)施例的反應(yīng)液和以往PCR反應(yīng)液各5μL中分別加6×樣品緩沖液1μL，分別注入到Mupid內(nèi)的凝膠的不同注入口。其次，于100V的恒壓下進(jìn)行50分鐘的電泳。然后用5mg/L的溴乙錠溶液對(duì)整個(gè)凝膠進(jìn)行染色。如果存在雙鏈DNA，溴乙錠摻入到雙鏈DNA中，通過紫外線照射可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光。通過測定該熒光強(qiáng)度，可以對(duì)DNA量進(jìn)行定量。通過電泳，模板DNA和通過PCR的生成DNA(由于分子量不同)都被分離為帶狀。對(duì)生成DNA的帶的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較的結(jié)果表明，在本實(shí)施例PCR條件下的生成DNA量與以往PCR條件下的生成DNA量大致處于同等程度?？梢源_認(rèn)使用本實(shí)施例的正向引物混合溶液的PCR與以往沒有什么變化，PCR反應(yīng)沒有差別。即，即使使用本實(shí)施例的正向引物混合溶液，也可以進(jìn)行與通常條件相同的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。另外，在通過上述紫外線照射對(duì)來自溴乙錠的熒光進(jìn)行的熒光檢測中，F(xiàn)AM熒光體的影響被消除，F(xiàn)AM熒光體對(duì)DNA量的定量沒有影響。
除了上述實(shí)施例之外，作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的正向引物混合溶液，也可以通過按照1∶1至1∶10000的濃度比制備ALD-FF引物和ALD-FN引物的混合溶液進(jìn)行評(píng)價(jià)。與上述實(shí)施例同樣通過凝膠電泳對(duì)生成DNA量進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果表明在任一情況下通過PCR反應(yīng)生成的DNA量大致相同。這表明本實(shí)施例中的引物混合溶液幾乎沒有抑制擴(kuò)增反應(yīng)本身。即，本實(shí)施例的引物由于可以直接使用以往的條件，所以從以往方式的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的過渡容易。另外，也同樣適用于其他的擴(kuò)增法。
在本工序中，對(duì)在上述工序中制備的生成DNA進(jìn)行檢測?？梢允褂酶鞣N檢測方法裝置，但在本實(shí)施例中，就通過毛細(xì)管電泳裝置實(shí)施SSCP解析的情況進(jìn)行說明。
作為毛細(xì)管電泳裝置使用Applied Biosystems公司ABI PRISM(TM)3100 Genetic Analyzer。使用獨(dú)自制作的內(nèi)徑75μm、檢測長度36cm的毛細(xì)管，填充將同一公司生產(chǎn)的GeneScan聚合物自濃縮制備的聚合物后，進(jìn)行電泳檢測。
在上述擴(kuò)增反應(yīng)工序中，在含有使用正向引物混合溶液制備的PCR生成DNA的反應(yīng)液3μL中混合適量含有眾所周知的標(biāo)記片段標(biāo)志(已知堿基長度的寡聚物)的甲酰胺37μL，于94℃下進(jìn)行2分鐘熱變性。然后，進(jìn)行冰冷，作為毛細(xì)管電泳用樣品液。含有生成DNA的反應(yīng)液不稀釋直接使用。電泳條件，毛細(xì)管的控制溫度為18℃、樣品注入條件為12KV、5秒鐘、于12KV下進(jìn)行50分鐘的電泳分離。另外，進(jìn)行解析的信號(hào)強(qiáng)度以在標(biāo)準(zhǔn)條件下得到的電泳數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，獨(dú)自對(duì)背景、振幅進(jìn)行變更后使用。
圖6示出了一例本實(shí)施例的電泳結(jié)果，橫軸表示電泳時(shí)間，縱軸表示檢測熒光強(qiáng)度。33分鐘位置的峰是片段標(biāo)志的峰，電泳時(shí)間接近39分鐘和接近41分鐘出現(xiàn)的峰是PCR擴(kuò)增的生成DNA的峰。模板是基因組DNA，由于來自父親和母親兩者的靶核酸被擴(kuò)增，可出現(xiàn)2個(gè)峰。通過對(duì)這2個(gè)峰進(jìn)行解析，可以進(jìn)行診斷等。另外，不限于此，通過測定解析各種電泳樣品的峰，可以獲得基因的有無、多型信息等。
另外，圖5示出了使用ALD-FF引物和ALD-FN引物的濃度比為1∶50的正向引物混合溶液進(jìn)行時(shí)的電泳結(jié)果。在與圖6同樣的位置得到信號(hào)峰。生成DNA的峰面積比圖6約大2倍。
另外，為了比較，將在以往條件下的反應(yīng)液3μL用與上述同樣步驟進(jìn)行電泳后，進(jìn)行測定。結(jié)果，引人注目的生成DNA的峰的熒光強(qiáng)度過強(qiáng)，使檢測器的信號(hào)強(qiáng)度過量，不能進(jìn)行正確測定。向樣品反應(yīng)液3μL中加稀釋液297μL后進(jìn)行混合稀釋，用移液管取該溶液3μL，再按照上述步驟進(jìn)行測定，可以得到幾乎同樣的電泳測定結(jié)果，獲得同樣的解析結(jié)果。
就象上述擴(kuò)增反應(yīng)工序所述那樣，在將ALD-FF引物和ALD-FN引物配制成1∶1至1∶10000濃度比的正向引物混合溶液中進(jìn)行時(shí)，生成DNA量無論哪一種情況幾乎都相同(與以往方法都相同)。對(duì)于使用改變了混合比的正向引物混合溶液的反應(yīng)液，電泳測定的結(jié)果、泳動(dòng)峰的大小隨著混合比率變化而增減。特別是在將ALD-FF引物和ALD-FN引物配制成1∶10至1∶500濃度比時(shí)，確認(rèn)濃度比與峰面積強(qiáng)度大致成比例。因此，最好是將ALD-FF引物和ALD-FN引物在1∶1至1∶10000的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，使用根據(jù)檢測器靈敏度調(diào)整到恰當(dāng)?shù)膹?qiáng)度水平的正向引物混合溶液。此時(shí)可以不進(jìn)行稀釋工序而移至檢測工序，系統(tǒng)可以簡化，裝置變得簡便。
另外，標(biāo)記引物比沒有標(biāo)記引物價(jià)格高。在本實(shí)施例中，根據(jù)檢測裝置的靈敏度，由于標(biāo)記引物(此時(shí)為ALD-FF引物)的使用量減少，所以從整體上可以控制試劑成本。
按照本實(shí)施例，可以對(duì)PCR等擴(kuò)增反應(yīng)后的反應(yīng)液不進(jìn)行稀釋，而直接實(shí)施檢測工序。因此，操作變得容易，在構(gòu)建自動(dòng)化裝置時(shí)，系統(tǒng)可以簡化，裝置變得更簡便，成本降低。
另外，根據(jù)檢測裝置的靈敏度可以減少價(jià)格高的標(biāo)記引物的使用量。因此，所以從整體上可以控制試劑成本，減少運(yùn)行成本。
還有，在上述實(shí)施例中，作為標(biāo)記物雖然使用了熒光體FAM，但標(biāo)記物不限定于該物質(zhì)。可以使用各種熒光體、以及化學(xué)發(fā)光體、生物發(fā)光體、磷光體、放射性同位素、微粒子等各種標(biāo)記，可以獲得同樣的效果。
另外，作為修飾基團(tuán)可以使用磷酸基、氨基、巰基、生物素、地高辛配基等，無論哪一種修飾基團(tuán)都容易附加熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
關(guān)于核酸擴(kuò)增法，不限定于本實(shí)施例的PCR法，可以運(yùn)用各種方法，都可以獲得同樣的效果。如RCR(修復(fù)連鎖反應(yīng))法、TAS法、3SR法、NASBA法、SPSR法、LAT法、SDA法等，只要是使用上述寡聚物的混合物進(jìn)行的方法并沒有特別限定。
在進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)還進(jìn)行其他反應(yīng)(例如RT-PCR)時(shí)，將標(biāo)記引物和沒有標(biāo)記引物的混合量比以1∶1～1∶10000、最好是以1∶10～1∶500比例混合，使用其總量適合于反應(yīng)的濃度的引物混合物進(jìn)行反應(yīng)。這樣一來，生成核酸中的發(fā)光強(qiáng)度或放射活性就適合檢測或分析了。
引物混合溶液的ALD-FF引物與ALD-FN引物的比與分離峰的面積強(qiáng)度大致成比例，通過用ALD-FF引物和ALD-FN引物的比除面積強(qiáng)度，也可以算出生成核酸的總量。
作為對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)后的生成DNA中的標(biāo)記物進(jìn)行計(jì)測的方法，除了上述之外，可以使用平板凝膠的凝膠電泳的檢測裝置等，一邊對(duì)生成核酸進(jìn)行分離，一邊進(jìn)行檢測的裝置。另外，如果使用眾所周知的熒光偏光測定、時(shí)間分解磷光檢測能量共振等均一檢測法等，也可以使用熒光光度計(jì)、反應(yīng)板閱讀儀等。另外，也可以進(jìn)行除去未反應(yīng)寡聚物的工序。
實(shí)施例2對(duì)基于使用本發(fā)明的標(biāo)記/沒有標(biāo)記的混合引物的方法的核酸處理裝置(系統(tǒng))進(jìn)行說明。
裝置構(gòu)成主要由圖2所示那樣提取部、擴(kuò)增部、以及檢測部構(gòu)成。
提取部是由檢體提取作為模板的核酸的機(jī)構(gòu)。是具有與在實(shí)施例1中說明的由檢體提取模板DNA的提取工序同樣的功能的自動(dòng)化單元。例如，由具有特開2000-166556號(hào)記載的構(gòu)成的機(jī)構(gòu)部、控制部等構(gòu)成。
擴(kuò)增部是使用本發(fā)明的標(biāo)記/沒有標(biāo)記的混合引物，例如使用實(shí)施例1說明的正向引物混合溶液對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的機(jī)構(gòu)。由對(duì)以正向引物混合溶液為主的實(shí)施例1的擴(kuò)增反應(yīng)工序中所述試劑溶液進(jìn)行保管，擴(kuò)增用的溫度循環(huán)儀、與提取部的機(jī)構(gòu)部同樣的試劑·吸引用分注嘴、分注用吸頭、分注用吸頭夾、反應(yīng)容器、吸頭去除桿、xyz移到用臂等構(gòu)成。也可以挪用上述提取部的單元。
所謂檢測部是進(jìn)行生成核酸的檢測和分析的機(jī)構(gòu)。
以下根據(jù)附圖對(duì)實(shí)施方式進(jìn)行說明。雖然做成了分割為提取部以及擴(kuò)增部單元和檢測單元的裝置構(gòu)成，也可以是將兩方做在一起的構(gòu)成。
對(duì)提取部和擴(kuò)增部單元進(jìn)行說明。圖7是提取·擴(kuò)增部100的外觀圖，圖8是提取·擴(kuò)增部100的平面圖，圖9是吸頭向噴嘴的裝卸動(dòng)作說明圖。
基本的動(dòng)作詳細(xì)說明，可根據(jù)特開2000-166556。
注射器10、32控制液體的吸引和吐出。注射器10、32分別借助于配管、噴嘴架17，配管、噴嘴架34，分別獨(dú)立地與噴嘴36、39連接。而噴嘴36、液體吸排用可動(dòng)噴嘴39分別被固定在噴嘴架17、34上，噴嘴架17、34是以可分別向臂16、33的Y方向(圖7的臂16、33的縱向)、Z方向(與圖7的臂16、33的縱向垂直方向)移到的狀態(tài)被固定。
臂16、33是可以分別獨(dú)立地在X方向(與上述Y方向以及Z方向兩方垂直的方向)移動(dòng)，通過使在Z方向的位置相互有差別，可以在X方向相互重疊。由于重疊，通過噴嘴架17、34和臂16、33的動(dòng)作組合，可以使噴嘴在裝置平面狀的必要部分移動(dòng)。
這些正向注射器、臂、噴嘴架等的動(dòng)作受控制操作部控制。
分注用的吸頭架14(圖7、圖8)可以收納分注吸頭15，在裝置上可以設(shè)置多個(gè)(圖中，有14a、14b、14c、14d的4個(gè)吸頭)相同的吸頭架14。另外，在反應(yīng)容器臺(tái)23上可以設(shè)置48個(gè)反應(yīng)容器24。在純化品臺(tái)25的下部設(shè)置保冷機(jī)構(gòu)(圖中沒有示出)，可以對(duì)純化品臺(tái)25進(jìn)行保冷。
另外，在裝置上可以對(duì)洗滌液瓶19、洗脫液瓶20、稀釋液瓶21、結(jié)合促進(jìn)劑瓶22、擴(kuò)增反應(yīng)試劑容器200各設(shè)置一個(gè)瓶。在核酸捕捉吸頭臺(tái)30中可以設(shè)置48個(gè)分注吸頭31。另外，在洗脫液瓶20、結(jié)合促進(jìn)劑瓶22的底部設(shè)置加溫機(jī)構(gòu)(圖中沒有圖示)，可以對(duì)瓶進(jìn)行加溫。還有，擴(kuò)增反應(yīng)用試劑容器200被收在冷卻單元201內(nèi)，可以被冷卻。
還有，在裝置上設(shè)置了擴(kuò)增反應(yīng)用的溫度循環(huán)儀202。
在進(jìn)行吸頭裝卸時(shí)，通過控制臂16和噴嘴架17的動(dòng)作，可以使噴嘴36向吸頭架14上的目的分注吸頭15的上方移動(dòng)。然后，將噴嘴架17向下方移動(dòng)，使分注吸頭15的所定位置與噴嘴36接觸。通過接觸，可以自動(dòng)地將分注吸頭裝配到噴嘴36的前端。通過對(duì)噴嘴39、噴嘴架34、臂33進(jìn)行與上述同樣的控制，可以將核酸捕捉吸頭裝配到噴嘴39的前端。
吸頭的拆卸，通過對(duì)臂16和噴嘴架17進(jìn)行動(dòng)作控制，使用去吸頭桿27進(jìn)行。對(duì)于噴嘴架34、臂33也同樣進(jìn)行。
受液器11、28可以接受來自噴嘴36、39的吐出液，接受的液體以廢液送走。洗滌部18可以通過流水的噴出對(duì)借助于噴嘴36裝配到噴嘴架17上的分注吸頭15進(jìn)行清洗。
核酸捕捉吸頭31使用特開2000-166556所述的吸頭。下面對(duì)該情況含有靶核酸的檢體的核酸進(jìn)行捕捉、回收、擴(kuò)增的動(dòng)作進(jìn)行說明。
首先，通過控制臂16和噴嘴架17的動(dòng)作，通過所定動(dòng)作將分注吸頭15裝配到噴嘴36上。然后，通過控制臂16和噴嘴架17，以及注射器10的動(dòng)作將所定量的結(jié)合促進(jìn)劑由結(jié)合促進(jìn)劑瓶22吸到分注吸頭15中，再吸所定量的空氣。然后將分注吸頭15移到洗滌臺(tái)18，對(duì)分注吸頭15的外壁進(jìn)行流水清洗。
分注吸頭15的外壁清洗后，將噴嘴架17移動(dòng)到檢體臺(tái)12上的所定檢體13的位置。通過控制注射器10的動(dòng)作，將所定量的檢體吸到分注吸頭15中。分注吸頭15的檢體吸引后，將噴嘴架17移動(dòng)到反應(yīng)容器臺(tái)23上，將分注吸頭15內(nèi)的檢體都吐出到臺(tái)23的所定反應(yīng)容器24中。
將檢體吐出到反應(yīng)容器24后，再通過分注吸頭15對(duì)反應(yīng)容器24內(nèi)的檢體進(jìn)行吸吐，將檢體與結(jié)合促進(jìn)劑混合。檢體與結(jié)合促進(jìn)劑混合后，將噴嘴架17移動(dòng)到吸頭去除桿27的位置，通過上述的所定動(dòng)作將分注吸頭15從噴嘴36卸下。
通過控制臂33和噴嘴架34的動(dòng)作，按照所定動(dòng)作將核酸捕捉吸頭31裝配到噴嘴39上。然后將噴嘴架34移到反應(yīng)容器臺(tái)23上的加有上述混合液(檢體與結(jié)合促進(jìn)劑的混合液)的反應(yīng)容器24。然后通過控制注射器32的動(dòng)作，將上述混合液吸到核酸捕捉吸頭31的內(nèi)部。
反復(fù)進(jìn)行所定次數(shù)的吸吐后，將反應(yīng)容器24內(nèi)的混合液吸到核酸捕捉吸頭31內(nèi)，通過臂33、噴嘴架34的動(dòng)作控制，將吸頭31移動(dòng)到廢液口29。然后，通過注射器32的控制將核酸捕捉吸頭31內(nèi)的混合液吐出到廢液口29?；旌弦和鲁龅綇U液口29后，通過臂33、噴嘴架34的動(dòng)作控制將吸頭31移動(dòng)到受液器28。
通過控制臂16和噴嘴架17的動(dòng)作，將分注吸頭15裝配到噴嘴36后，通過控制臂16和噴嘴架17以及注射器10的動(dòng)作，從洗滌液瓶19吸所定量的洗滌液。然后，使噴嘴架17動(dòng)作，將洗滌液吐到反應(yīng)容器臺(tái)23上的所定反應(yīng)容器24上。
洗滌液吐出后，通過控制臂16和噴嘴架17的動(dòng)作，將噴嘴架17移動(dòng)到吸頭去除桿27的位置，通過所定動(dòng)作將分注吸頭15從噴嘴36上卸下。
噴嘴架17移動(dòng)后，通過控制臂33、噴嘴架34的動(dòng)作，將核酸捕捉吸頭31移動(dòng)到加有洗滌液的反應(yīng)容器臺(tái)23上的所定的反應(yīng)容器24。通過注射器32的動(dòng)作，向核酸捕捉吸頭31內(nèi)吸洗滌液。洗滌液吸引后，通過注射器32的動(dòng)作，反復(fù)進(jìn)行所定次數(shù)的吸吐后，通過洗滌液將固相38洗滌。反復(fù)進(jìn)行所定次數(shù)的吸吐后，將反應(yīng)容器24內(nèi)的洗滌液吸到核酸捕捉吸頭31內(nèi)。然后，通過控制臂33、噴嘴架34的動(dòng)作，將核酸捕捉吸頭31移動(dòng)到廢液口29，通過注射器32的動(dòng)作將核酸捕捉吸頭31內(nèi)的洗滌液吐出。洗滌液吐出后，通過控制臂33、噴嘴架34的動(dòng)作，將核酸捕捉吸頭31移動(dòng)到受液器28。
根據(jù)需要，上述核酸清洗工序可以反復(fù)進(jìn)行所定次數(shù)。然后，也可以直接重復(fù)上述核酸清洗工序，將反復(fù)多次的洗滌液吸到分注吸頭15中，將需要量吐出到反應(yīng)容器24中。然后，洗滌液吐出后，移到受液器11的位置，核酸捕捉吸頭31的清洗操作后，再通過分注吸頭15將需要量的清洗液吐出到反應(yīng)容器24中，可以更有效地重復(fù)上述核酸清洗工序。
然后，通過控制通過控制臂16、噴嘴架17的動(dòng)作，將分注吸頭15裝配到噴嘴36上后，通過臂16和噴嘴架17以及注射器10的動(dòng)作，從洗脫液瓶20中吸所定量的洗脫液，使噴嘴架17將洗脫液吐出到反應(yīng)容器臺(tái)23上所定的反應(yīng)容器24中。
洗脫液吐出后，通過控制臂16和噴嘴架17的動(dòng)作，將噴嘴架17移動(dòng)到吸頭去除桿27的位置，通過所定動(dòng)作將分注吸頭15從噴嘴36上卸下。
噴嘴架17移動(dòng)后，通過控制臂33、噴嘴架34的動(dòng)作，將核酸捕捉吸頭31移動(dòng)到加有洗脫液的反應(yīng)容器臺(tái)23上的所定的反應(yīng)容器24。然后通過注射器32的動(dòng)作，將洗脫液吸到核酸捕捉吸頭31內(nèi)。洗脫液吸引后，通過注射器32的動(dòng)作反復(fù)進(jìn)行所定次數(shù)的吸吐，使固相38與洗脫液接觸。
反復(fù)進(jìn)行所定次數(shù)的吸吐后，將反應(yīng)容器24內(nèi)的洗脫液吸到核酸捕捉吸頭31內(nèi)。然后，通過控制臂33、噴嘴架34的動(dòng)作，將核酸捕捉吸頭31移動(dòng)到收納在純化品臺(tái)25的所定純化品收納容器26。通過注射器32的動(dòng)作將核酸捕捉吸頭31內(nèi)的洗脫液吐出到收容容器26中。洗脫液吐出后，通過控制臂33、噴嘴架34的動(dòng)作，將核酸捕捉吸頭31移動(dòng)到受液器28。根據(jù)需要，上述洗脫工序可以反復(fù)進(jìn)行所定次數(shù)。此時(shí)，也可以直接重復(fù)上述洗脫工序，也可以將反復(fù)多次的洗脫液吸到分注吸頭15中，將需要量吐出到反應(yīng)容器24中。然后，洗脫液吐出后，將分注吸頭15移到受液器11的位置。核酸捕捉吸頭31的吸吐操作后，再通過分注吸頭15將需要量的洗脫液吐出到反應(yīng)容器24中，可以更有效地重復(fù)上述洗脫工序。
上述工序結(jié)束后，通過控制臂33和噴嘴架34的動(dòng)作，將噴嘴架34移動(dòng)到吸頭去除桿27的位置，通過所定動(dòng)作將分注吸頭31從噴嘴39上卸下。然后移動(dòng)到右端。
在上述工序中，從檢體可以得到基因組DNA溶液。
以下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
在擴(kuò)增反應(yīng)用試劑容器200中加入實(shí)施例1所述的擴(kuò)增反應(yīng)用的預(yù)混合的試劑溶液(dNTP、MgCl2、Tsp緩沖液、滅菌水、Tsp DNA聚合酶、正向引物混合溶液、反向引物溶液等預(yù)混合液)。
對(duì)使用純化品收納容器26內(nèi)的基因組DNA溶液，用于對(duì)其中含有的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的動(dòng)作進(jìn)行說明。通過控制臂16和噴嘴架17的動(dòng)作，將吸頭架14d上的分注吸頭15通過所定動(dòng)作裝配到噴嘴36。然后，通過控制臂16和噴嘴架17以及注射器10的動(dòng)作，從擴(kuò)增反應(yīng)用試劑溶液200將所定量的擴(kuò)增反應(yīng)用的預(yù)混合的試劑溶液吸到分注吸頭15中。然后，使噴嘴架17移動(dòng)到溫度循環(huán)儀202上，將分注吸頭15內(nèi)的溶液吐到所定的擴(kuò)增用容器203中。還有，進(jìn)行同樣操作，從純化品收納容器26將必要量的基因組DNA溶液移到所定的擴(kuò)增用容器203中。進(jìn)行混合。然后在所定的條件下進(jìn)行PCR等擴(kuò)增動(dòng)作。而擴(kuò)增用容器203的蓋以及溫度循環(huán)儀的蓋的開閉動(dòng)作的說明也就省略了。
利用上述工序可以進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增。
然后，將甲酰胺與擴(kuò)增反應(yīng)后的溶液(一部分)混合，于94℃下進(jìn)行2分鐘熱變性后，通過眾所周知的檢測裝置進(jìn)行測定。例如，通過毛細(xì)管分析電泳裝置進(jìn)行測定。
另外，在本實(shí)施例中，在擴(kuò)增時(shí)可以使用擴(kuò)增反應(yīng)用的預(yù)混合的試劑溶液，例如也可以將各個(gè)試劑分別保管。另外，也可以做成將標(biāo)記引物和沒有標(biāo)記引物分別保管，獲得檢測裝置的信息后，決定擴(kuò)增時(shí)混合比率后，進(jìn)行混合，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的構(gòu)成。此時(shí)，在裝置單元內(nèi)準(zhǔn)備必要數(shù)目的容器保管場所，進(jìn)行分注動(dòng)作。
通過本實(shí)施例，由于可以省去稀釋工序，所以裝置構(gòu)成變得簡單。
發(fā)明的效果可以減少核酸擴(kuò)增中的標(biāo)記或修飾的寡聚物的使用量。因此預(yù)計(jì)可以降低核酸擴(kuò)增處理、以及核酸分析處理的成本降低和使工序簡化。
序列表<110>株式會(huì)社日立高新技術(shù)<120>核酸的擴(kuò)增方法及其裝置<130>PH-1502-PCT<140>
<141>
<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1GGGCTTGACT TTCCAACACG 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2
GGGCTTGACT TTCCAACACG 20<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列<400>3TCTAGCCTCA ATCCTCATAC 20
權(quán)利要求
1.核酸擴(kuò)增方法，是至少使用以下的寡聚物的混合物、含有靶核酸的核酸、以及擴(kuò)增試劑，生產(chǎn)含有該靶核酸相關(guān)序列的生成核酸的核酸擴(kuò)增方法；可以與靶核酸中含有的任意特定序列雜交、被發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記的、或附加修飾基團(tuán)的寡聚物A；可與上述特定序列雜交、沒有被與寡聚物A同樣物質(zhì)標(biāo)記、或沒有附加在聚合物A中附加的上述修飾基團(tuán)的寡聚物B。
2.權(quán)利要求1所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，上述寡聚物A與上述寡聚物B的混合比率為1∶1～1∶10000。
3.權(quán)利要求2所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，上述寡聚物A與上述寡聚物B的混合比率為1∶10～1∶500。
4.權(quán)利要求1所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，上述發(fā)光體是熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
5.權(quán)利要求1所述的核酸擴(kuò)增方法，其中，附加上述修飾基團(tuán)的寡聚物A是被生物素化、磷酸化、氨基化、地高辛配基化、或巰基化的寡聚物。
6.寡聚物的試劑盒，是含有以下寡聚物，可以生產(chǎn)含有該靶核酸相關(guān)序列的生成核酸的寡聚物的試劑盒；可以與靶核酸中含有的任意特定序列雜交、被發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記的、或附加修飾基團(tuán)的寡聚物A；可與上述特定序列雜交、沒有被標(biāo)記寡聚物A的上述發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記，或沒有附加在聚合物A中附加的上述修飾基團(tuán)的寡聚物B。
7.權(quán)利要求6所述的寡聚物的試劑盒，其中，上述寡聚物A與上述寡聚物B的存在比率為1∶1～1∶10000。
8.權(quán)利要求6所述的寡聚物的試劑盒，其中，上述寡聚物A與上述寡聚物B的存在比率為1∶10～1∶500。
9.權(quán)利要求6所述的寡聚物的試劑盒，其中，上述發(fā)光體是熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。
10.權(quán)利要求6所述的聚合物的試劑盒，其中，附加上述修飾基團(tuán)的寡聚物A是被生物素化、磷酸化、氨基化、地高辛配基化、或巰基化的寡聚物。
11.核酸分析方法，包括以下工序至少使用以下寡聚物的混合物、含有靶核酸的核酸、以及使用擴(kuò)增試劑，生產(chǎn)含有該靶核酸相關(guān)序列的生成核酸的擴(kuò)增工序；(A)可以與靶核酸中含有的任意特定序列雜交、被發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記的、或附加修飾基團(tuán)的寡聚物A；(B)可與上述特定序列雜交、沒有被標(biāo)記寡聚物A的上述發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記，或沒有附加在聚合物A中附加的上述修飾基團(tuán)的寡聚物B；當(dāng)寡聚物A附加上述修飾基團(tuán)時(shí)，在該修飾基團(tuán)結(jié)合發(fā)光體的結(jié)合工序；對(duì)上述發(fā)光體或放射性同位素進(jìn)行檢測的檢測工序。
12.權(quán)利要求11所述的分析方法，是含有以下工序的方法根據(jù)被檢測的發(fā)光體或放射性同位素的量，算出生成核酸的量的演算工序。
13.權(quán)利要求12所述的分析方法，其中，上述演算工序根據(jù)上述寡聚物A和上述寡聚物B的混合比率，算出生成核酸的量。
14.權(quán)利要求11所述的分析方法，其中，在上述擴(kuò)增工序結(jié)束時(shí)或上述結(jié)合工序結(jié)束時(shí)含有生成核酸的反應(yīng)液中的發(fā)光體、或放射性同位素標(biāo)記的靶核酸的濃度處于在上述檢測工序中使用的檢測裝置的可測定范圍。
15.生成核酸的生產(chǎn)裝置，是含有靶核酸相關(guān)序列的生成核酸的生產(chǎn)裝置，包括以下結(jié)構(gòu)保持可以與核酸中含有的任意特定序列雜交、被發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記的、或附加修飾基團(tuán)的寡聚物A的保持容器A；保持可與上述特定序列雜交、沒有被標(biāo)記寡聚物A的上述發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記，或沒有附加在聚合物A中附加的上述修飾基團(tuán)的寡聚物B的保持容器B；可以保持至少含有上述寡聚物A、上述寡聚物B、擴(kuò)增試劑、以及含有靶核酸的核酸的水溶液的核酸擴(kuò)增容器；向上述核酸擴(kuò)增容器供給所定量的上述寡聚物A和所定量的上述寡聚物B的供給機(jī)構(gòu)。
16.權(quán)利要求15所述的生產(chǎn)裝置，其中，上述寡聚物A與上述寡聚物B的供給比率為1∶1～1∶10000。
17.權(quán)利要求16所述的生產(chǎn)裝置，其中上述寡聚物A與上述寡聚物B的供給比率為1∶10～1∶500。
18.檢測靶核酸的核酸分析裝置，包括以下構(gòu)成可以保持含有以下寡聚物、擴(kuò)增試劑、以及含有靶核酸的核酸的，可以生產(chǎn)含有上述靶核酸相關(guān)序列的生成核酸的核酸擴(kuò)增容器；(A)可以與靶核酸中含有的任意特定序列雜交、被發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記的、或附加修飾基團(tuán)的寡聚物A；(B)可與上述特定序列雜交、沒有被標(biāo)記寡聚物A的上述發(fā)光體或放射性同位素標(biāo)記，或沒有附加在聚合物A中附加的上述修飾基團(tuán)的寡聚物B；對(duì)上述發(fā)光體或放射性同位素、或與上述修飾基團(tuán)結(jié)合的發(fā)光體進(jìn)行檢測的檢測工序。
19.權(quán)利要求18所述的核酸分析裝置，包含以下構(gòu)成表示依賴于根據(jù)被檢測的發(fā)光體的量算出的上述生成核酸量的信息的表示機(jī)構(gòu)。
20.權(quán)利要求19所述的核酸分析裝置，其中，上述表示機(jī)構(gòu)是根據(jù)寡聚物A與寡聚物B的混合率，算出上述生成核酸的量的裝置。
全文摘要
本發(fā)明通過減少核酸擴(kuò)增中的標(biāo)記或修飾的寡聚物的使用量，降低了成本，而且不需要稀釋到檢測裝置的測定范圍內(nèi)的操作等就可進(jìn)行檢測。為了達(dá)到該目的，本發(fā)明提供由提取靶核酸的提取工序、將用發(fā)光體或修飾基團(tuán)標(biāo)記的寡聚物和與具有上述標(biāo)記的寡聚物相同堿基序列，且沒有用發(fā)光體或修飾基團(tuán)標(biāo)記的寡聚物混合的混合工序、使用上述標(biāo)記的寡聚物和沒有標(biāo)記的寡聚物的混合物對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增工序、在使用由修飾基團(tuán)標(biāo)記的寡聚物時(shí)，向上述被修飾基團(tuán)標(biāo)記的寡聚物和其擴(kuò)增物附加發(fā)光體的工序、以及通過光檢測器對(duì)上述擴(kuò)增的靶核酸進(jìn)行測定的檢測工序構(gòu)成的核酸測定方法。
文檔編號(hào)B01L7/00GK1694966SQ0282937
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2002年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月13日
發(fā)明者神田隆之, 福薗真一, 高橋智 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立高新技術(shù)