專利名稱：一種金屬螯合層析填料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及一種層析填料的制備方法。
背景技術(shù)：
金屬螯合層析，又名固定化金屬親合層析(Immobilized Metal Ion AffinityChromatography)，是利用特定金屬離子(如鎳離子、銅離子、鋅離子)和特定氨基酸殘基(如組氨酸、半胱氨酸、色氨酸)之間的特異性配位作用，來選擇性地分離純化蛋白質(zhì)的技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于帶組氨酸標記(His-tag)的基因工程蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、血制品等的實驗室規(guī)模和工業(yè)規(guī)模純化。
目前，金屬螯合層析所用的填料普遍采用葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠結(jié)合亞氨基二乙酸(IDA)或次甲基三乙酸(NTA)來制備。如中國專利第CN1280134A號公開的Sepharose6B-IDA和中國專利第CN1163902A號公開的Sephadex-IDA即是典型的IDA類金屬螯合層析填料，在填料使用壽命、降低非特異吸附等方面均已能滿足目前蛋白質(zhì)純化的需要。但上述填料由于基質(zhì)耐壓能力差，實際使用時線性流速僅為14-40厘米/小時。這延長了純化操作時間，限制了生產(chǎn)效率。由于上述兩專利分別采用Sepharose6B和Sephadex G10、Sephadex G25作為基質(zhì)，使得填料的分子排阻極限只能達到4×106道爾頓(Sepharose6B)和700-5000道爾頓(Sephadex)，大分子蛋白無法進入凝膠內(nèi)部與金屬離子螯合，從而導(dǎo)致在純化大分子蛋白(如以多聚體形式存在的包涵體蛋白)時載量明顯下降。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有金屬螯合層析填料流速低、分子排阻極限低的問題，本發(fā)明提供一種用交聯(lián)結(jié)構(gòu)的4％瓊脂糖凝膠和亞氨基二乙酸制備金屬螯合層析填料的方法，包括下列步驟1)向交聯(lián)結(jié)構(gòu)的4％瓊脂糖凝膠中逐步加入環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉、硼氫化鈉，在20-30℃緩慢攪拌，反應(yīng)2-3小時；隨后升溫至60-65℃繼續(xù)緩慢攪拌，反應(yīng)2-3小時；
2)向經(jīng)步驟1)處理得到的瓊脂糖凝膠中逐步加入碳酸鈉、亞氨基二乙酸、硼氫化鈉，在60-65℃水浴中緩慢攪拌，反應(yīng)10-20小時；3)將經(jīng)步驟2)處理得到的瓊脂糖凝膠依次用20-30℃蒸餾水、10％乙酸、蒸餾水洗滌，加20％乙醇保存，得到金屬螯合層析填料。
本發(fā)明采用交聯(lián)結(jié)構(gòu)的4％瓊脂糖凝膠為填料基質(zhì)，包括Sepharose 4 Fast Flow、Sepharose CL-4B等，上述基質(zhì)能保證填料的高流速，又能提高填料的分子排阻極限。由于上述凝膠瓊脂糖含量為4％，凝膠顆?？讖捷^大，可容許生物大分子通過，故分子排阻極限可達20×106道爾頓，是中國專利第CN1280134A號所公開的基質(zhì)的5倍。同時，由于采用了交聯(lián)結(jié)構(gòu)，凝膠的強度得到保證，線性流速可達26-200厘米/小時(具體流速由基質(zhì)凝膠而定)，較中國專利第CN1280134A號所公開的基質(zhì)提高85％到14倍。上述或類似的瓊脂糖凝膠可從Pharmacia等公司購得。由于交聯(lián)結(jié)構(gòu)的4％瓊脂糖基質(zhì)的孔徑大小、親水性等與現(xiàn)有金屬螯合層析填料所用基質(zhì)不同，需要專門的結(jié)合IDA的工藝，以確保足夠的結(jié)合量和結(jié)合強度。
為達到上述目的，本發(fā)明采用階段升溫的活化方式和60-65℃恒溫接臂工藝。首先，在較低溫度下(20-30℃)向凝膠中逐步添加環(huán)氧氯丙烷，使環(huán)氧氯丙烷逐步擴散入凝膠內(nèi)部，使兩者能充分接觸活化。在此階段，凝膠內(nèi)、外表面的羥基基團與環(huán)氧氯丙烷發(fā)生取代反應(yīng)，形成了凝膠-環(huán)氧丙烷的活性中間體。由于交聯(lián)結(jié)構(gòu)的4％瓊脂糖基質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，此階段活化反應(yīng)并不完全，凝膠上仍存在部分未活化羥基。待環(huán)氧氯丙烷全部添加完畢后升溫至60-65℃繼續(xù)反應(yīng)2-3小時，保證活化完全，特別是讓凝膠孔徑內(nèi)部的羥基也參與反應(yīng)。隨后，在60-65℃條件下進行接臂，通過提高溫度來增強亞氨基二乙酸的分子熱運動，提高其和凝膠-環(huán)氧丙烷活性中間體結(jié)合的效率。在接臂過程中使用的碳酸鈉用于控制pH值堿性范圍內(nèi)。本發(fā)明最優(yōu)的pH范圍在8～11之間，提高pH值有利于增加IDA與凝膠的結(jié)合速率，降低pH值有利于提供溫和的反應(yīng)條件。在整個反應(yīng)過程中使用硼氫化鈉來提供還原性氛圍。
本發(fā)明中，所加入的亞氨基二乙酸與4％瓊脂糖凝膠的質(zhì)量比為1∶7.5-1∶8.5。
接上亞氨基二乙酸的凝膠依次用20-30℃蒸餾水、10％乙酸、蒸餾水洗滌，去除游離的亞氨基二乙酸，加20％乙醇保存，即得到金屬螯合層析填料。使用時取所需體積的填料，裝入層析柱，洗去殘留乙醇后，用2-3倍體積的金屬硫酸鹽溶液(如硫酸鎳等)緩慢流過后，再依次用2倍體積10％乙酸、5倍體積純化緩沖液平衡，即可上樣。吸附于填料上的蛋白質(zhì)可用200mM咪唑洗脫。
本發(fā)明所制備的填料，提高了線性流速，可達到26-200厘米/小時；分子排阻極限增大，達到20×106道爾頓。從而提高了純化大分子蛋白似的載量，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化規(guī)模的蛋白質(zhì)純化。
本發(fā)明中主要的化學反應(yīng)如下，■代表凝膠基質(zhì)1)活化 2)接臂具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述。但以下僅是本發(fā)明的較佳實施例，本發(fā)明的內(nèi)容并不受下列較佳實施例的限制。
實施例1取吸干的Sepharose CL-4B 40g，放入200ml燒杯內(nèi)，加入2M氫氧化鈉20ml、環(huán)氧氯丙烷2ml、硼氫化鈉75mg，充分混合后置于恒溫磁力攪拌器上，恒溫25℃，緩慢攪拌2小時。攪拌期間每隔12分鐘，添加入2M氫氧化鈉2ml、環(huán)氧氯丙烷1ml，總計添加10次，累計添加2M氫氧化鈉20ml、環(huán)氧氯丙烷10ml。之后升溫至65℃，繼續(xù)恒溫緩慢攪拌2小時。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗中，用真空泵抽干活化后的Sepharose CL-4B。再將Sepharose CL-4B轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，加2M碳酸鈉50ml、亞氨基二乙酸5g、硼氫化鈉60mg，充分混合后置于恒溫磁力攪拌器上，恒溫60℃，緩慢攪拌15小時，反應(yīng)體系pH值9。攪拌結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗中，依次用20-30℃蒸餾水5L、10％醋酸500ml洗滌，然后用蒸餾水沖洗至pH中性。此即制備好的Sepharose CL-4B-IDA金屬螯合層析填料。如果不立即使用，則將填料轉(zhuǎn)移至塑料瓶內(nèi)，加入20％酒精保存。
實施例2取吸干的Sepharose 4 Fast Flow 40g，放入200ml燒杯內(nèi)，加入2M氫氧化鈉20ml、環(huán)氧氯丙烷2ml、硼氫化鈉80mg，充分混合后置于恒溫磁力攪拌器上，恒溫30℃，緩慢攪拌3小時。攪拌期間每隔12分鐘，添加入2M氫氧化鈉2ml、環(huán)氧氯丙烷1ml，總計添加10次，累計添加2M氫氧化鈉20ml、環(huán)氧氯丙烷10ml。之后升溫至65℃，繼續(xù)恒溫緩慢攪拌3小時。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗中，用真空泵抽干活化后的Sepharose 4Fast Flow。再將Sepharose 4 Fast Flow轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，加2M碳酸鈉50ml、亞氨基二乙酸5g、硼氫化鈉70mg，充分混合后置于恒溫磁力攪拌器上，恒溫60℃，緩慢攪拌20小時，反應(yīng)體系pH值10。攪拌結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至砂芯漏斗中，依次用20-30℃蒸餾水5L、10％醋酸500ml洗滌，然后用蒸餾水沖洗至pH中性。此即制備好的Sepharose 4 FastFlow-IDA金屬螯合層析填料。如果不立即使用，則將填料轉(zhuǎn)移至塑料瓶內(nèi)，加入20％酒精保存。
實施例3取制備好的金屬螯合層析填料Sepharose 4 Fast Flow-IDA 5ml，轉(zhuǎn)移至內(nèi)徑1.6cm的層析柱內(nèi)，先用10ml磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗去填料內(nèi)殘留乙醇，然后依次用15ml、200mM硫酸鎳、10ml、10％乙酸、50ml磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗柱。將帶有pET32a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α表達后菌體裂解液上樣(pET32a和DH5α均可從Novagen公司購得)，待穿過峰出盡后用200mM咪唑洗脫，流速30厘米/小時，所得洗脫峰為純的帶有His-Tag的硫氧還蛋白。另取同等體積的帶有pET32a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α表達后菌體裂解液，再次上樣，待穿過峰出盡后用200mM咪唑洗脫，流速150厘米/小時，所得洗脫峰為帶有His-Tag的硫氧還蛋白，純度與30厘米/小時純化所得硫氧還蛋白相同。
權(quán)利要求
1.一種金屬螯合層析填料的制備方法，包含下列步驟1)向交聯(lián)結(jié)構(gòu)的4％瓊脂糖凝膠中逐步加入環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉、硼氫化鈉，在20-30℃條件下緩慢攪拌，反應(yīng)2-3小時；隨后升溫至60-65℃繼續(xù)緩慢攪拌，反應(yīng)2-3小時；2)向經(jīng)步驟1)處理得到的瓊脂糖凝膠中逐步加入碳酸鈉、亞氨基二乙酸、硼氫化鈉，在60-65℃水浴中緩慢攪拌，反應(yīng)10-20小時；3)將經(jīng)步驟2)處理得到的瓊脂糖凝膠依次用20-30℃蒸餾水、10％乙酸、蒸餾水洗滌，加20％乙醇保存，得到金屬螯合層析填料。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠為Sepharose4 Fast Flow或Sepharose CL-4B。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中加入的亞氨基二乙酸與4％瓊脂糖凝膠的質(zhì)量比為1∶7.5-1∶8.5。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)反應(yīng)體系中的pH值范圍為8-11。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種金屬螯合層析填料的制備方法，是通過將交聯(lián)結(jié)構(gòu)的4％瓊脂糖凝膠和亞氨基二乙酸結(jié)合而成。所獲得的填料較現(xiàn)有類似產(chǎn)品，在流速和分子排阻極限上具有顯著優(yōu)勢，適合應(yīng)用于工業(yè)化規(guī)模的蛋白質(zhì)純化。
文檔編號B01D15/08GK1525165SQ0311551
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月25日
發(fā)明者黃竹, 翁辰川, 黃 竹 申請人:上海實業(yè)科華生物技術(shù)有限公司