專利名稱：改進(jìn)的分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從全血或體液中除去成分的改進(jìn)。更具體地，本發(fā)明涉及一種方法，其中能夠使血液或體液經(jīng)過剛性并整合的分離基質(zhì)而不會(huì)被其排阻。
炎性過程，如膿毒癥，是導(dǎo)致人類發(fā)病率和死亡率的主要原因。據(jù)估計(jì)，每年僅在美國就發(fā)生400 000～500 000例膿毒癥，導(dǎo)致100 000～175 000人死亡。在德國，已有報(bào)道顯示在加強(qiáng)監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)患者的膿毒癥發(fā)生率已高達(dá)19％。膿毒癥也已成為加強(qiáng)監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)非外傷性疾病患者的主要致死原因。盡管在過去的幾十年中對(duì)嚴(yán)重感染的治療已取得較大進(jìn)展，但膿毒癥的發(fā)病率和致死率仍持續(xù)上升。
根據(jù)感染生物體的類型將膿毒癥分為三個(gè)主要類型。革蘭陰性的膿毒癥最為常見。這些感染的大多數(shù)是由大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌和綠膿假單胞菌引起的。革蘭陽性病原體，如葡萄球菌和鏈球菌，是導(dǎo)致膿毒癥的第二位主要的因素。第三位主要的類型包括真菌。真菌性感染占膿毒癥病例相對(duì)小的百分比，但其能導(dǎo)致高死亡率。
膿毒癥中已被很好確定的機(jī)制涉及革蘭陰性菌的毒性成分，即脂多糖細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)(LPS，內(nèi)毒素)，其由脂肪酸基、磷酸基和糖鏈組成。
已經(jīng)鑒定了針對(duì)內(nèi)毒素的某些宿主反應(yīng)，如局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子的釋放。然而，在強(qiáng)烈刺激的情況下，其從外周血溢出并產(chǎn)生潛在有害效應(yīng)，如誘導(dǎo)器官功能障礙。
感染性休克的關(guān)鍵性介質(zhì)是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素1(IL-1)和白介素17(IL-17)。它們協(xié)同作用產(chǎn)生能導(dǎo)致循環(huán)崩潰和多器官衰竭的生理學(xué)變化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。高濃度的TNF-α確實(shí)可以模擬膿毒癥的癥狀和結(jié)局。
正常情況下，內(nèi)毒素被保持在腸腔中。例如，心肺轉(zhuǎn)流術(shù)期間內(nèi)臟缺血或氧化障礙(dysoxia)的存在導(dǎo)致粘膜屏障瓦解以及內(nèi)毒素從腸腔至門脈循環(huán)的易位(即內(nèi)毒素從腸至循環(huán)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn))。
多種類型的抗生素被廣泛用于預(yù)防和治療感染。然而，在不同的細(xì)菌種類中已經(jīng)發(fā)展出了對(duì)很多常用抗生素的抗生素抗性。這對(duì)于醫(yī)院駐留菌叢是尤為確切，醫(yī)院中生物體處于持續(xù)選擇壓力下從而發(fā)展出抗性。此外，在醫(yī)院中高密度的潛在感染患者和醫(yī)務(wù)人員-至-醫(yī)務(wù)人員和醫(yī)務(wù)人員-至-患者的接觸范圍均有利于抗生素耐藥生物體的播散。所使用的抗生素對(duì)施藥者來說是最經(jīng)濟(jì)，最安全和簡(jiǎn)便的，而其可能不具有抑制特定感染的足夠廣的抗菌譜。由于抗生素能導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)、與其它要藥物交叉作用和導(dǎo)致對(duì)主要器官(例如肝，腎)的直接損害，而具有不同程度的毒性。很多抗生素還改變了正常腸內(nèi)菌叢，這會(huì)導(dǎo)致腹瀉和營養(yǎng)吸收不良。
已知某些抗生素能夠中和內(nèi)毒素的作用，如多粘菌素B。該抗生素結(jié)合內(nèi)毒素的脂質(zhì)A部分并中和其活性。由于其毒性，故多粘菌素未能常規(guī)使用。其只能被給予處于持續(xù)監(jiān)護(hù)且腎功能的監(jiān)測(cè)下的患者。
此外，為了克服抗細(xì)菌成分的主動(dòng)免疫接種的某些固有局限，已經(jīng)將多種技術(shù)用于制備內(nèi)毒素結(jié)合抗體。通過用細(xì)菌免疫人類已經(jīng)制備了大量抗體。為了發(fā)展治療性抗體的更穩(wěn)固的制品，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)目眾多的LPS-反應(yīng)性單克隆抗體。不幸的是，臨床研究并未得出有益結(jié)果。然而，應(yīng)注意到這些試驗(yàn)是在膿毒癥癥狀開始后對(duì)人體實(shí)施的。已得到廣泛確信的是抗內(nèi)毒素抗體治療，在膿毒癥后實(shí)施的，可產(chǎn)生較少有益作用，因?yàn)檫@些抗體不能逆轉(zhuǎn)由內(nèi)毒素啟動(dòng)的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
在JP 06022633中，描述了抗脂質(zhì)抗體的吸附劑，其包括固定在水-不溶性多孔材料上的具有陰離子官能團(tuán)的化合物。該多孔材料可以是瓊脂糖，纖維素，葡聚糖，聚丙烯酰胺，玻璃，硅膠，或苯乙烯-二乙烯基苯共聚物所制備的剛性聚合物，且將該多孔材料作為分離顆粒床填充在分離裝置中。
在從血液中除去成分的嘗試中，制備了不同的吸附材料。WO01/23413中公開了包含固定在固相支持介質(zhì)上的配體的內(nèi)毒素清除吸附劑。優(yōu)選的支持介質(zhì)是珠子的形式。當(dāng)填充在分離裝置中時(shí)，固相支持介質(zhì)的多孔性足以允許血細(xì)胞在珠子間通過。
在WO 00/62836中，吸附材料具有適于從血液中除去β-2微球蛋白的大小和結(jié)構(gòu)。該文獻(xiàn)中的吸附材料可以是具有被修飾以便阻止蛋白質(zhì)和血小板吸附的珠子和孔的表面的大孔合成聚合物。然而，聚合物的獨(dú)立球形珠在載荷約為500g時(shí)會(huì)被機(jī)械性破壞，所述載荷在例如用珠子填充柱時(shí)產(chǎn)生。所述載荷導(dǎo)致超過柱的顯著壓降。
為了減少壓降，EP 464872中制備了吸附劑，其包括具有排阻極限為106～109道爾頓的水-不溶性多孔剛性凝膠顆粒。凝膠床被用于在體外循環(huán)治療中從血液或血漿中選擇性除去脂蛋白。
而且，在WO 01/23413中，清除內(nèi)毒素的多孔支持材料是珠子，其可被填充至容器中，所述珠子具有當(dāng)填充至柱和濾床時(shí)足以提供珠子間必需空間的大小。所述多孔支持材料還可以是微孔過濾空心纖維或平板膜以便將壓降最小化。
在EP 424698中描述了用于清除生物大分子的吸附劑，其包含粒度為50～150微米和排阻極限至少為105道爾頓的多孔球形顆粒載體。將多粘菌素B偶聯(lián)至所述顆粒，隨后將顆粒填充至用于從全血中體外除去內(nèi)毒素的系統(tǒng)中的套筒(cartridge)。
在這些用于從血液中體外除去毒性成分的傳統(tǒng)系統(tǒng)中，首先用液體填充容器或套筒然后導(dǎo)入吸附性多孔珠。在US 6,408,894中公開了一種方法，其提供了珠子的更均勻分布和更致密填塞。該方法包括將液體和珠子的混合物以液體從混合物中擠出和從容器中擠出的方式強(qiáng)行填至容器中。
因此，血細(xì)胞的除去有利于清除存在于血漿中的化合物如上述，例如在WO 00/62836或WO 01/23413中所述。然而，所述技術(shù)包括兩個(gè)分離步驟，所述兩個(gè)步驟均可以促成由于生物不相容性而產(chǎn)生的不利細(xì)胞活化的增高風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明的目的是提供一種從全血或體液中選擇性結(jié)合和分離至少一種成分的新方法，由此消除上述與炎性進(jìn)程相關(guān)的問題。
另一目的是提供這樣一種方法，由此可對(duì)全血實(shí)施選擇性結(jié)合和分離而無需將血液分離為血漿和血細(xì)胞。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供這樣一種方法，其不是大小依賴性的，即血液成分不通過排阻法進(jìn)行分離。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的還在于提供這樣一種方法，由此可在分離裝置中獲得高流速而不會(huì)產(chǎn)生隨時(shí)間的顯著壓降。
而更進(jìn)一步的目的是提供這樣一種方法，即使在高流速下也不需要將血液置于分離裝置中的剪力下而能保持低管壓力以便避免損傷血管。
這些目標(biāo)通過具有權(quán)利要求1的特征的本發(fā)明得以實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的其它優(yōu)勢(shì)將從權(quán)利要求21和從屬權(quán)利要求中顯而易見地得出。
根據(jù)本發(fā)明，提供了從全血或體液中選擇性結(jié)合和分離至少一種成分的方法。能使血液或體液經(jīng)過剛性并整合的分離基質(zhì)而不會(huì)被其排阻，所述基質(zhì)具有孔徑為5微米～500微米的多孔結(jié)構(gòu)以及0.5cm2～10m2的活性表面，其能夠結(jié)合一種或幾種成分。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中基質(zhì)還包括至少一種通過多孔結(jié)構(gòu)的被覆和/或表面修飾的方法而引入的官能團(tuán)。這導(dǎo)致所獲活性表面，單獨(dú)或與其自身的非官能化區(qū)聯(lián)合，能夠結(jié)合全血或體液的至少一種成分。要除去的成分可以是天然的以及非天然的，即與成分結(jié)合的特異性配體，如抗體。
此外，官能團(tuán)，通過多孔結(jié)構(gòu)表面的直接或間接選擇性轉(zhuǎn)化獲得的，已被進(jìn)一步用于配體的固定。然而，多孔結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)的使用可按本發(fā)明的方法進(jìn)行。
孔徑以及骨骼樣多孔結(jié)構(gòu)的表面已被適用于進(jìn)行全血純化的本發(fā)明的分離基質(zhì)中。然而，根據(jù)本發(fā)明的方法還可用于從其它體液以及水溶液中除去成分。本發(fā)明的一個(gè)重要方面是在分離步驟中既不會(huì)有任何成分也不會(huì)有任何溶劑從基質(zhì)排阻。
根據(jù)本發(fā)明，剛性并整合的基質(zhì)應(yīng)具有0.5cm2～10m2的可用面積，而基質(zhì)結(jié)構(gòu)的密度在實(shí)施本發(fā)明方法中是非限制性的。
關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語“剛性”是指基質(zhì)為非撓性的，不能被彎曲或變形，但能抵抗至少0.5巴的壓力。術(shù)語“整合的”是指具有高表面積的基質(zhì)是一個(gè)整體。
本發(fā)明方法中基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)由金屬，無機(jī)氧化物，碳，玻璃，陶瓷，合成聚合物，和/或天然聚合物，或其混合物制成。具有明確孔徑和高表面積的多孔固體金屬結(jié)構(gòu)可通過使用制備均一大小的孔的嚴(yán)格控制的燒結(jié)過程來制備。
不同的聚合物已經(jīng)制備成具有多孔結(jié)構(gòu)、具有所需孔徑以及對(duì)于基質(zhì)的高表面積的經(jīng)模塑的或擠出的多孔材料。它們還被發(fā)泡制備。例如，從異氰酸鹽和多種其它有機(jī)化合物制備的聚氨基甲酸酯具有活性氫原子，其已經(jīng)用于制備聚加成反應(yīng)產(chǎn)物。該活性氫可來自雙功能性或多功能性化合物，如多元醇、多胺。與水的反應(yīng)可產(chǎn)生能用于特定配體共價(jià)固定的伯胺。
已使用了廣泛類型的金屬和合金，如不銹鋼、鎳、鈦、莫內(nèi)爾合金、鉻鎳鐵合金、哈斯特洛伊合金和其它特殊金屬材料。高表面積無機(jī)氧化物，尤其是氧化鋁和氧化鋯，其已用制備具有確定孔結(jié)構(gòu)的陶瓷材料的相同技術(shù)進(jìn)行使用。而且，可購買具有適宜孔徑的所述陶瓷以及熱壓結(jié)的玻璃。
還使用了其它天然剛性材料，如無定形硅，例如沸石，和火山巖。
天然材料及其雜化物(可用作本發(fā)明方法中的基質(zhì)材料)是多糖，如纖維素，和其它聚合糖類材料。其它適宜的天然聚合材料是聚氨基酸，還可以是包括合成氨基酸、聚乳酸、聚乙醇酸及其與乳酸的共聚物的那些。
關(guān)于這一點(diǎn)術(shù)語雜化物包括所述天然材料的衍生物，例如纖維素雙乙酸鹽，其優(yōu)選是多糖衍生物。
用于本發(fā)明中所使用基質(zhì)的適宜的合成聚合物是聚烯烴，如聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚甲基戊烯和乙烯乙酸乙烯共聚物；乙烯聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯縮醛和聚乙烯吡咯酮；含氟聚合物、如聚四氟乙烯、氟化乙烯-丙烯共聚物、聚氯氟乙烯、聚氟乙烯和聚偏1，1-二氟乙烯；聚丙烯酸酯、如聚甲基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸酯、聚丙烯腈、和聚甲基丙烯酸酯；聚酰胺，如聚丙烯酰胺；聚酰亞胺，如聚乙烯亞胺；聚苯乙烯及其共聚物，如聚苯乙烯和丙烯腈-丁二烯-苯乙烯聚合物；硅橡膠；多元酯或聚醚；聚碳酸酯；聚氨基甲酸酯；聚-磺酸酯；聚乙二醇；聚環(huán)氧烷如聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷；及其共聚物或雜化物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少一種官能團(tuán)引入剛性并整合的分離基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)上。官能團(tuán)可以是不同類型的，即陰離子類型、陽離子類型或非離子性類型。多孔結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)已用于共價(jià)結(jié)合物質(zhì)如肽/蛋白質(zhì)和膽汁酸(例如脫氧膽酸)，抗體及其片段以及其它生物分子和具有選擇性結(jié)合內(nèi)毒素和/或促炎癥介質(zhì)的物質(zhì)。
表面修飾，即間接方式的表面官能化，可通過電沉積，電蒸發(fā)，等離子體化學(xué)沉積，從離子等離子體流的沉積，或化學(xué)氣相沉積(例如等離子體聚合，等離子體增強(qiáng)的表面聚合體沉積)的方法實(shí)施。表面修飾方法本身是已知的且可見于N.Inagaki，1996，Technomic Publishing，Lancaster，USA“Plasma surface modification and plasmapolymerization”。已經(jīng)通過這些方法處理不同的三維基質(zhì)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了活性表面非常均質(zhì)的修飾。
丙烯酸性或烯丙基性雙鍵的雙官能單體的和極性基團(tuán)如OH、NH2、CN和COOH的聚合已經(jīng)用于制備具有高密度官能團(tuán)的等離子體聚合物。例如，無機(jī)和有機(jī)表面的表面官能化已經(jīng)在烯丙基化合物，如丙烯胺的等離子體環(huán)境中實(shí)施。
在NH3、O2或CO2等離子體環(huán)境中的有機(jī)聚合表面也是可能的，所述等離子體環(huán)境或者產(chǎn)生官能團(tuán)＝NH、-NH2、＝CN、-OH、或者-COOH。所使用氣體的其它實(shí)例是本領(lǐng)域眾所周知的。
等離子體化學(xué)過程也已與經(jīng)典的化學(xué)合成聯(lián)合，而顯著增強(qiáng)了表面修飾對(duì)聚合物的選擇性。一種方法是在共存等離子體官能團(tuán)的化學(xué)聯(lián)合之后即應(yīng)用特定等離子體氣體表面官能化。
引入官能團(tuán)的另一方式是通過直接官能化的方法，即用聚合材料被覆表面。關(guān)于這一點(diǎn)已經(jīng)將合成或天然聚合物被覆在高表面金屬、無機(jī)氧化物、碳、玻璃、陶瓷，以及其它適宜的合成聚合物，和/或天然聚合物，或其混合物上。
很多上述聚合物，尤其是那些無官能團(tuán)的聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯等，需要進(jìn)一步的處理以便改變其表面特性。由此，聚合物表面的等離子體或電暈處理，如上述，將產(chǎn)生非常獨(dú)特的官能團(tuán)，象羥基、羰基、羧基、氨基和亞氨基等，其可共價(jià)附著于表面。
所述被覆還可以通過含有官能團(tuán)的聚合物質(zhì)的附著和吸附的方式而實(shí)施。所述物質(zhì)的實(shí)例是聚賴氨酸、聚精氨酸、和聚乙烯亞胺。
通過例如使用等離子體技術(shù)，可在多孔表面上獲得聚乙烯亞胺樣物質(zhì)。當(dāng)分離基質(zhì)用于根據(jù)本發(fā)明的方法中從全血或體液中選擇性結(jié)合和分離至少一種成分時(shí)，蛋白質(zhì)性血液成分的親水區(qū)和疏水區(qū)可與處理的表面發(fā)生相互作用以便除去所要除去的成分。在官能化后，當(dāng)用于選擇性結(jié)合和分離的基質(zhì)表面包含聚烯烴，例如聚乙烯或聚丙烯時(shí)，氨基的正電荷也可用于靜電相互作用而疏水區(qū)用于疏水作用。將該過程用在本發(fā)明方法中從而選擇性結(jié)合例如脂多糖的不同區(qū)域。
聚合物和金屬，具有例如反應(yīng)性羥基，也可通過硅烷化而被官能化。
由此，已經(jīng)將多種不同的官能團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)于高表面多孔基質(zhì)結(jié)構(gòu)。在直接和/或間接官能化后，多孔結(jié)構(gòu)可具有親水區(qū)以及疏水區(qū)，其可與不同的血液成分相互作用。由此，在制備用在根據(jù)本發(fā)明的方法中的表面時(shí)，使用了興趣物質(zhì)的特性。
優(yōu)選地，活性表面的官能團(tuán)是巰基、羧化物、胺、醛、酮、羥基、鹵素、肼類和活性氫。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體以共價(jià)的方式與高表面多孔結(jié)構(gòu)的至少一種官能團(tuán)偶聯(lián)。關(guān)于這一點(diǎn)，配體是具有對(duì)要從全血或體液中除去的成分高親和力的物質(zhì)。由此，所述配體用于增強(qiáng)吸附特性和結(jié)合效能。
配體可以是蛋白質(zhì)，優(yōu)選是重組蛋白質(zhì)、肽、抗體或其片段、糖類例如多糖、激素、抗氧化劑、糖蛋白、脂蛋白、脂質(zhì)、脂溶性維生素例如維生素E、膽汁酸、活性染料、尿囊素、尿酸、或多粘菌素，或其組合。
適宜的膽汁酸是脫氧膽酸，其是內(nèi)源性疏水性物質(zhì)。所述膽汁酸可或借助間隔臂與官能團(tuán)直接偶聯(lián)，或借助大分子偶聯(lián)，然后按根據(jù)本發(fā)明的方法用于從血液、體液和水溶液中除去內(nèi)毒素。
關(guān)于這一點(diǎn)，間隔臂是能夠?qū)⑴潴w連接于多孔結(jié)構(gòu)表面的分子，大或小。
例如，如果在本發(fā)明方法中分離基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)包括具有附加氨基的聚烯烴，該基團(tuán)可含有與其偶聯(lián)的白蛋白和依次與該大分子偶聯(lián)的至少一種膽汁酸部分。
由此，本發(fā)明還涉及固定在支持物上的膽汁酸部分用于從包含相同內(nèi)容的水溶液中去除成分的新用途。優(yōu)選地，膽汁酸部分是脫氧膽酸部分。
由此，固定膽汁酸部分的適宜的固體支持物是具有孔徑為5微米～500微米，優(yōu)選70微米～170微米，以及活性表面為0.5cm2～10m2的多孔結(jié)構(gòu)的剛性并整合分離基質(zhì)。
本發(fā)明方法中的基質(zhì)的配體還優(yōu)選是白蛋白或用重組方法制備的白蛋白，其可用于替代血清白蛋白、多粘菌素B(即疏水性結(jié)構(gòu)上的帶電荷的基團(tuán))或脫氧膽酸。
由此，配體還可以以根據(jù)本發(fā)明的方法中的間隔臂而發(fā)揮作用。例如，其還可首先將人重組蛋白質(zhì)或另一大分子(例如透明質(zhì)酸)共價(jià)附著于多孔結(jié)構(gòu)，其能允許隨后的特異性針對(duì)要被除去成分的配體的結(jié)合。
如必須，交聯(lián)臂可在至少一種官能團(tuán)和配體間以共價(jià)方式偶聯(lián)。關(guān)于這一點(diǎn)，交聯(lián)臂是將配體共價(jià)結(jié)合于支持性多孔結(jié)構(gòu)的元件，當(dāng)將配體連接在多孔結(jié)構(gòu)自身的遠(yuǎn)側(cè)時(shí)，該元件是間隔臂。所述分子間隔臂是本領(lǐng)域已知的。將其引入以便通過提供對(duì)配體更好的可用性從而增加對(duì)要從全血或體液中結(jié)合和分離的成分的親和力。通過引入這些分子間隔臂還能增加多孔基質(zhì)結(jié)構(gòu)表面的生物相容性。
交聯(lián)臂/間隔臂可單獨(dú)包括零長(zhǎng)度交聯(lián)臂或與介入性交聯(lián)臂組合，獲得的最終復(fù)合物通過將結(jié)構(gòu)加入交聯(lián)物質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)的特性而結(jié)合在一起。這些介入性交聯(lián)臂可以是同雙官能性(例如二醛)、異雙官能性(例如氨基酸)或三官能性交聯(lián)類型。
間隔臂的主要目的是增加所使用的特定配體的生物利用度。
間隔臂可以是例如硅烷、二異氰酸酯、乙醇酸酯、聚乙二醇、琥珀酰亞胺試劑、二肼、己二酸、二氨、氨基酸、多或寡氨基酸、聚氨基酸、肽、或蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是人重組蛋白質(zhì)。
交聯(lián)臂的官能團(tuán)被設(shè)計(jì)為與氨基(Lys，Arg)，與巰基(Cys)，或與羧基(Asp，Glu)反應(yīng)，以便例證少數(shù)實(shí)例。
關(guān)于反應(yīng)基團(tuán)化學(xué)這一點(diǎn)，可參照Bioconjugate Techniques，GregT Hermanson，Academic Press，USA 1996。
由此，本發(fā)明方法中的活性多孔基質(zhì)表面能夠單獨(dú)或與多孔結(jié)構(gòu)的可用表面的非官能化區(qū)聯(lián)合除去例如內(nèi)毒素?；钚员砻孢€可用作共價(jià)固定化學(xué)試劑，如生物分子象氨基酸，多肽和抗體的工具以便選擇性增強(qiáng)所述特定成分的消除。
分離基質(zhì)，意在從全血或體液中選擇性除去至少一種成分，可用具有依賴于預(yù)期應(yīng)用的特定孔徑和/或特定孔徑范圍的多孔結(jié)構(gòu)制備。優(yōu)選地，該多孔結(jié)構(gòu)應(yīng)允許血細(xì)胞通過。由此，特定類型的血細(xì)胞也可通過本發(fā)明方法而從全血中除去。所述細(xì)胞為存在疾患的細(xì)胞或具有特定表面受體的細(xì)胞，例如活化的吞噬細(xì)胞。
用于特殊用途的金屬結(jié)構(gòu)可以是磁性的。磁性基質(zhì)可以例如通過被覆熱壓結(jié)磁體和聚合物，例如聚乙烯而獲得。然后實(shí)施細(xì)胞的有效去除而使得抗體，具有磁性葡聚糖鐵標(biāo)記，附著于血液中的特定細(xì)胞。
孔徑應(yīng)為5微米～500微米，優(yōu)選70微米～170微米，最優(yōu)選80微米～100微米，因此可保持高流速而不會(huì)發(fā)生細(xì)胞性損傷或細(xì)胞性排阻。由此，采用根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)施的分離不基于成分的任何大小分布。事實(shí)上，全血或體液的所有成分均可通過本發(fā)明方法進(jìn)行清除。
在除去一個(gè)或多個(gè)原發(fā)毒性效應(yīng)物，即內(nèi)毒素之后，可除去進(jìn)一步的繼發(fā)毒性效應(yīng)物。繼發(fā)效應(yīng)物可以是細(xì)胞因子(例如TNF-α)，白介素(例如Il-1)，活性氧和氮根，等。
當(dāng)實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法時(shí)，一種或幾種分離基質(zhì)被保護(hù)在罩內(nèi)，所述罩可具有根據(jù)應(yīng)用而不同的形狀和可變化的和/或不同的入口和出口。然后可將所述裝置用于內(nèi)毒素清除和/或細(xì)胞因子清除和/或細(xì)胞因子中和。這可以通過將血液或其它體液經(jīng)過裝置，體內(nèi)、并行或體外應(yīng)用的，而得以實(shí)現(xiàn)，而不會(huì)發(fā)生液體被其中的剛性并整合的分離基質(zhì)排阻。多孔結(jié)構(gòu)的活性表面，其上的官能團(tuán)和/或特異性配體然后選擇性地從液體中結(jié)合和分離至少一種成分。該裝置還適用于從水溶液中除去內(nèi)毒素。
本發(fā)明方法的重要特征是可以提供給感染性休克的所有方面，即原發(fā)以及繼發(fā)毒性效應(yīng)物可通過本發(fā)明方法而被除去。
關(guān)于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法可以參照

圖1。裝置1包含罩2，將裝置的罩(或套筒)整合至閉式循環(huán)中，其中全血或體液通過泵的方式進(jìn)行循環(huán)。在罩2中，排列至少一種分離基質(zhì)5a，5b，…，每種分離基質(zhì)被預(yù)期能從全血或體液中除去一種成分。罩2具有入口3和出口4，其位置并不重要只要在分離基質(zhì)和罩中能獲得足夠的流量即可。優(yōu)選地，將泵置于入口3的上游。
以這種方式，可獲得能夠保持5ml/小時(shí)～6 000ml/分鐘的流速而無顯著壓降的裝置。當(dāng)體外應(yīng)用時(shí)，即使在非常高的流速下仍能獲得從泵至管不超過300mmHg的管壓力。
剛性的整合的分離基質(zhì)可被制成用于本發(fā)明方法的不同的形狀。例如，其可被設(shè)計(jì)為盤、桿、筒、環(huán)、球、管、空心管、平板或其它模塑的形狀。
因?yàn)槊總€(gè)基質(zhì)中的流量依賴于其孔隙率，故可控制血液或體液中的成分與活性表面的接觸時(shí)間。此外，通過改變孔隙率和分離裝置中各分離基質(zhì)的構(gòu)型可在分離裝置中產(chǎn)生所需流量梯度。
圖2和圖3中顯示了裝置的不同圖式實(shí)施方式，其可在實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法時(shí)使用。箭頭指示獨(dú)立的分離基質(zhì)和其罩內(nèi)的血液或體液流，大箭頭表示具有比小箭頭更高的流速。在不同構(gòu)型的這些實(shí)例中，分離基質(zhì)可具有相同或不同孔隙率，具有或不具有相同或不同類型的官能團(tuán)或配體，以便從血液或體液中除去一種或幾種成分。
分離基質(zhì)優(yōu)選與罩(每個(gè)均具有入口3和出口4)結(jié)合以便確保無液體或其中的成分被阻止進(jìn)入基質(zhì)或基質(zhì)，即被其排阻。在圖2(a)和(b)中，給出罩2內(nèi)一個(gè)分離基質(zhì)5的實(shí)例，該基質(zhì)具有不同的構(gòu)型。圖2(c)和(d)中顯示了罩2內(nèi)兩個(gè)分離基質(zhì)5a，5b的實(shí)例。在圖2(c)的裝置中，在分離基質(zhì)5a的外周的不可透過性被覆6，如實(shí)用的皮，確保應(yīng)用于該裝置的所有材料將經(jīng)過該整個(gè)基質(zhì)。在圖2(d)的裝置中，另一方面，部分應(yīng)用的材料在分離基質(zhì)5a中的停留時(shí)間將短于在分離基質(zhì)5b中的停留時(shí)間，反之亦然。
圖3中每個(gè)裝置包括若干分離基質(zhì)5a-5g。圖3中(a)隔斷壁7確保流動(dòng)通過所有基質(zhì)。分離基質(zhì)可相對(duì)其縱向而旁側(cè)或橫向放置，如圖3(b)和(c)分別所示。圖3中(d)裝置包括不同大小的分離基質(zhì)。
總之，本發(fā)明方法可與體內(nèi)、并行或體外使用的或獨(dú)立的裝置進(jìn)行使用，由此所述裝置能夠降低循環(huán)內(nèi)毒素和可能的有害的前炎性介質(zhì)，尤其是TNF-α，IL-1和IL-17，優(yōu)選在血液中。其還可能從其它水溶液中選擇性除去內(nèi)毒素。所述成分被認(rèn)為通過附著的方式而結(jié)合于剛性并整合的分離基質(zhì)的活性表面。
實(shí)施例參照下述精心選擇以便涵蓋本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步描述和例證本發(fā)明。因此，下述實(shí)施例不應(yīng)被理解為在任何形式上限制本發(fā)明。
表面修飾實(shí)施例1.
對(duì)于孔隙率為350微米以及活性表面為10cm2的多孔聚乙烯(Porex Technologies，Germany)基質(zhì)的表面，通過使用O2以等離子體增強(qiáng)的化學(xué)氣相沉積法(Plasma Science，USA，Type PS 0350 PlasmaSurface Treatment System)進(jìn)行修飾。
通過染料試驗(yàn)測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上羥基的形成，其親水性得以證實(shí)。
實(shí)施例2.
對(duì)于孔隙率為100微米以及活性表面為20cm2的多孔聚乙烯(Porex Technologies，Germany)基質(zhì)的表面，通過使用CO2以等離子體增強(qiáng)的化學(xué)氣相沉積法(Plasma Science，USA，Type PS 0350Plasma Surface Treatment System)進(jìn)行修飾。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上羥基的形成和量通過轉(zhuǎn)化為異羥肟酸而進(jìn)行測(cè)定。關(guān)于這一點(diǎn)，所有異羥肟酸與三氯化鐵在酸溶液中呈現(xiàn)紅色或紫色，如Feigel等；Microchemie 1518，1934中所述。
實(shí)施例3.
對(duì)于孔隙率為170微米以及活性表面為0.04m2的多孔聚乙烯(Porex Technologies，Germany)基質(zhì)的表面，通過使用丙烯胺以等離子體聚合法(Plasma Science，USA，Type PS 0350 Plasma SurfaceTreatment System)進(jìn)行修飾。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量通過磺酸三硝基甲苯(TNBS)測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例4.
對(duì)于孔隙率為70微米以及活性表面為0.26m2的多孔聚乙烯(Porex Technologies，Germany)基質(zhì)的表面，通過使用丙烯酸以等離子體聚合法(Plasma Science，USA，Type PS 0350 Plasma SurfaceTreatment System)進(jìn)行修飾。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上羥基的量按實(shí)施例2中所述進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例5.
對(duì)于孔隙率為5微米以及活性表面為0.9m2的多孔聚乙烯(PorexTechnologies，Germany)基質(zhì)的表面，通過使用NH3以等離子體聚合法(Plasma Science，USA，Type PS 0350 Plasma Surface TreatmentSystem)進(jìn)行修飾。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量按實(shí)施例3中所述進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例6.
對(duì)于孔隙率為10微米以及活性表面為100cm2的多孔聚四氟乙烯，PTFE(W.L.Gore & Associates Inc.，USA)基質(zhì)的表面，通過使用NH3以等離子體增強(qiáng)的化學(xué)氣相沉積法(Plasma Science，USA，Type PS0350 Plasma Surface Treatment System)進(jìn)行修飾。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量按實(shí)施例3中所述進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例7.
對(duì)于孔隙率為10微米以及活性表面為300cm2的多孔，聚苯乙烯(Dow Chemical，USA)基質(zhì)的表面，通過使用CO2以等離子體增強(qiáng)的化學(xué)氣相沉積法(Plasma Science，USA，Type PS 0350 Plasma SurfaceTreatment System)進(jìn)行修飾。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上羥基的量按實(shí)施例2中所述進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例8.
對(duì)于孔隙率為80微米以及活性表面為100cm2的多孔聚氨基甲酸酯(Polymers Unlimited，Sweden)基質(zhì)的表面，在95％乙醇中通過2％Aldehydic Alkoxy Silane溶液，Art No.(PSX 1050，UnitedChemical Technologies Inc.，USA)的方法進(jìn)行修飾。用乙酸將溶液的pH調(diào)整至pH 5.5，然后用溶液灌注經(jīng)過基質(zhì)，將其在室溫下溫育過夜并最后用0.9％生理鹽水洗滌。
所獲基質(zhì)的醛官能度通過用對(duì)苯二胺由過氧化氫的氧化的催化加速使用進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)苯二胺在酸溶液中由過氧化氫的氧化的催化加速作用進(jìn)行評(píng)價(jià)已知為Bandrowski氏堿。
實(shí)施例9.
對(duì)于孔隙率為200微米以及活性表面為0.5m2的多孔聚硅氧烷(Nusil，F(xiàn)rance)基質(zhì)的表面，在95％乙醇中通過2％胺-硅烷溶液(ArtNo.0750，United Chemical Technologies Inc.，USA)的方法進(jìn)行修飾。將溶液灌注經(jīng)過基質(zhì)，將其在室溫下溫育過夜并最后用0.9％生理鹽水洗滌。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量按實(shí)施例3中所述進(jìn)行測(cè)定。
通過共價(jià)結(jié)合方法的被覆實(shí)施例10.
將聚賴氨酸(200mg)溶于10ml的50mM碳酸鈉溶液中然后將孔隙率為100微米的多孔聚碳酸酯(MicroPore Plastics，USA)基質(zhì)浸入溶液中并保持于4℃24小時(shí)以便獲得聚賴氨酸和聚碳酸酯基質(zhì)間的共價(jià)結(jié)合。最后用過量蒸餾水洗滌多孔基質(zhì)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量按實(shí)施例3中所述進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例11.
根據(jù)實(shí)施例4所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)用1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳二亞胺甲基-對(duì)-甲苯磺酸鹽(WCCM)(Aldrich)的水溶液以5ml/分鐘的流速在閉路中于室溫下灌注6小時(shí)。然后其用水沖洗并最后加入聚乙烯亞胺溶液(Sigma)(10mg/ml，pH7.0)然后將基質(zhì)溫育過夜。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量按實(shí)施例3中所述進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例12.
根據(jù)實(shí)施例3所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)在0.2M磷酸鹽緩沖液，pH7.5中通過使用1.0％戊二醛而進(jìn)行結(jié)合，然后以1ml/分鐘的流速于室溫灌注6小時(shí)。然后在與透明質(zhì)酸溶液(2mg/ml)于室溫溫育16小時(shí)前用緩沖液洗滌基質(zhì)。最后沖洗掉過量的透明質(zhì)酸。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上透明質(zhì)酸含量采用阿辛藍(lán)(Sigma)進(jìn)行證實(shí)和測(cè)定。
通過附著方法的被覆實(shí)施例13.
具有70微米孔隙率和0.18m2的活性表面的多孔聚乙烯(PorexTechnologies，Germany)基質(zhì)用2mg/ml透明質(zhì)酸溶液(BioHyos，Sweden，12·106Da)pH3.3(用0.1M HCl調(diào)整的)以1ml/分鐘的流速在閉路中于室溫下灌注16小時(shí)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上透明質(zhì)酸含量按實(shí)施例12進(jìn)行確定證實(shí)。
實(shí)施例14.
將具有70微米孔隙率和7.0m2活性表面的多孔聚乙烯(PorexTechnologies，Germany)基質(zhì)置于玻璃管中。用在350ml水中且以0.1M HCl調(diào)整至pH3.3的0.13％聚賴氨酸(Sigma)溶液填充所述具有多孔基質(zhì)的管。然后將聚賴氨酸溶液用其濾過基質(zhì)以＜5ml/分鐘的流速在室溫下經(jīng)過管再循環(huán)16小時(shí)。最后用反滲水沖洗多孔基質(zhì)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量按實(shí)施例3進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例15.
將具有70微米孔隙率和3.4m2的活性表面的多孔聚乙烯(PorexTechnologies，Germany)基質(zhì)置于玻璃管中。用在350ml反滲水中且以0.1M HCl調(diào)整至pH3.3的0.2％RecombuminTM(重組人血清白蛋白，Hoechst-Pharma，USA)溶液填充所述具有多孔基質(zhì)的管。
然后將RecombuminTM溶液用其濾過基質(zhì)通過使用泵以＜5ml/分鐘的流速在室溫下經(jīng)過管再循環(huán)16小時(shí)。最后用反滲水沖洗多孔基質(zhì)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上表面蛋白質(zhì)的含量通過使用考馬斯亮藍(lán)(BioRad，USA)進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例16.
根據(jù)實(shí)施例4所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)用聚乙烯亞胺(Sigma)溶液，10mg/ml，以5ml/分鐘的流速在閉路中灌注過夜。然后，用水沖洗多孔基質(zhì)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上伯胺的量按實(shí)施例3中所述進(jìn)行測(cè)定。
配體的直接結(jié)合實(shí)施例17.
通過使用WCCM水溶液將根據(jù)實(shí)施例5所獲多孔聚乙烯基質(zhì)與脫氧膽酸鹽(DOC)結(jié)合。將300ml 40％二-甲酸甲酯(DMF)(Sigma)在水中的溶液(包含1mmol去氧膽酸鈉)攪拌加入多孔聚碳酸酯，同時(shí)用0.3M HCl將pH調(diào)整至pH4.8。然后在10分鐘的時(shí)間內(nèi)，加入在DMF∶水(1∶1.8)中6mM WCCM的溶液。通過加入0.3M HCl將懸液在pH4.8保持3小時(shí)。
使用膽汁酸試劑盒(Sigma)測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的DOC含量。
實(shí)施例18.
根據(jù)實(shí)施例3所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)通過使用12％的戊二醛的0.15M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)于室溫24小時(shí)而進(jìn)行結(jié)合。用0.15M磷酸鹽緩沖液洗滌基質(zhì)然后以1mg/ml的濃度加入抗CD14抗體(DAKO，Denmark)然后8℃溫育24小時(shí)。隨后實(shí)施氰基硼氫化鈉還原以便制備穩(wěn)定的仲胺鍵。
通過在多孔基質(zhì)溫育前和后的抗體緩沖溶液的UV光譜學(xué)方法而間接地測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的抗體含量。
實(shí)施例19.
用0.15M磷酸鹽緩沖液洗滌根據(jù)實(shí)施例8所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)然后以1mg/ml的濃度加入重組IL-1受體(Kineret，Amgen，USA)然后8℃溫育24小時(shí)。隨后實(shí)施氰基硼氫化鈉還原以便制備穩(wěn)定的仲胺鍵。
通過在多孔基質(zhì)溫育前和后的IL-1受體緩沖溶液的UV光譜學(xué)方法而間接地測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的IL-1受體含量。
實(shí)施例20.
根據(jù)實(shí)施例5所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)通過使用1.0％戊二醛和0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)而進(jìn)行結(jié)合。將基質(zhì)用該溶液溫育3小時(shí)。在用磷酸鹽緩沖液洗滌后，將基質(zhì)溫育在硫酸多粘菌素B(Sigma)溶液(1mg/ml)中，經(jīng)再循環(huán)過夜。最后用0.1 M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌基質(zhì)。
實(shí)施例21.
根據(jù)實(shí)施例2所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)與0.1M 2-(N-嗎啉代)甲磺酸(MES)緩沖液(Sigma)(pH4.8)中濃度為5mg/ml重組TNF-α受體(Enbrel，Wyeth，UK)結(jié)合。然后加入30mg/ml WCCM的水溶液，然后將基質(zhì)于8℃溫育過夜。最后用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌基質(zhì)。
通過在多孔基質(zhì)溫育前和后的TNF-α受體緩沖溶液的UV光譜學(xué)方法而間接地測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的TNF-α受體含量。
實(shí)施例22.
根據(jù)實(shí)施例3所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)與抗-人TNF-α抗體(Sigma)通過使用于0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中1.0％的戊二醛進(jìn)行結(jié)合。將基質(zhì)與TNF-α抗體緩沖溶液溫育3小時(shí)。在用磷酸鹽緩沖液洗滌多孔基質(zhì)后，磷酸鹽緩沖液中的抗人TNF-α抗體(1mg/ml)被加入，然后以1ml/分鐘的流速經(jīng)再循環(huán)于室溫溫育6小時(shí)。最后用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌基質(zhì)。
通過在多孔基質(zhì)溫育前和后的TNF-α抗體緩沖溶液的UV光譜學(xué)方法而間接地測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的TNF-α抗體含量。
實(shí)施例23.
根據(jù)實(shí)施例5所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)與0.1M MES緩沖液(pH4.8)濃度為2mg/ml人殺菌性透過性增加的蛋白質(zhì)(BPI)(Wieslab，Sweden)進(jìn)行結(jié)合。將WCCM水溶液以15mg/ml的濃度加入該基質(zhì)，然后將基質(zhì)于8℃溫育過夜。最后用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌基質(zhì)。
通過在多孔基質(zhì)溫育前和后的BPI緩沖溶液的UV光譜學(xué)方法而間接地測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的BPI含量。
實(shí)施例24.
根據(jù)實(shí)施例15所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)在濃度為1mg/ml的DOC的0.1M MES緩沖液(pH4.8)的溶液中進(jìn)行溫育。然后加入WCCM的水溶液，然后將基質(zhì)于8℃溫育過夜。最后用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌基質(zhì)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的DOC含量如實(shí)施例17進(jìn)行測(cè)定。
使用間隔臂的配體結(jié)合實(shí)施例25.
根據(jù)實(shí)施例3所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)使用1.2％戊二醛的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)于室溫下活化24小時(shí)。用緩沖液洗滌基質(zhì)，然后在1，6-二氨基己烷(DAH)(Sigma)的50mg/ml 0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溫育24小時(shí)。此后，在溶液中加入10mg/ml氰基硼氫化鈉(Sigma)。用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌多孔基質(zhì)，然后溫育于DOC(1mg/ml)的0.1M MES緩沖液(pH4.8)溶液中。然后加入WCCM的水溶液，然后將基質(zhì)于8℃溫育過夜。最后用0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.4洗滌基質(zhì)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的DOC含量如實(shí)施例17進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例26.
根據(jù)實(shí)施例5所獲的多孔聚乙烯基質(zhì)用1.2％戊二醛的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)于室溫活化24小時(shí)。
用緩沖液洗滌基質(zhì)，然后用濃度為10mg/ml的己二酸二酰肼(Aldrich)的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溫育24小時(shí)。然后在溶液中加入10mg/ml氰基硼氫化鈉(Sigma)。
用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌多孔基質(zhì)，然后用濃度為1mg/ml的DOC的0.1M MES緩沖液(pH4.8)溶液進(jìn)行溫育。然后加入WCCM的水溶液，然后將基質(zhì)于8℃溫育過夜。最后用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌基質(zhì)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的DOC含量如實(shí)施例17進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例27.
通過使用WCCM水溶液將根據(jù)實(shí)施例10所獲基質(zhì)與DOC結(jié)合。將300ml 40％DMF(Sigma)的水溶液(包含1mmol去氧膽酸鈉)在攪拌時(shí)加入多孔聚碳酸酯基質(zhì)。用0.3M HCl將懸液的pH調(diào)整為4.8。在10分鐘的時(shí)間內(nèi)加入在DMF∶水(1∶1.8)中6mM WCCM的溶液然后通過周期性加入0.3M HCl而將懸液在pH4.8保持3小時(shí)。然后將其保持于室溫24小時(shí)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的DOC含量如實(shí)施例17進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例28.
根據(jù)實(shí)施例14所獲基質(zhì)用1.2％戊二醛的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)于室溫活化10小時(shí)，然后用過量緩沖液沖洗。將濃度為10mg/ml的聚乙烯亞胺(Sigma)的0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH8.0)，導(dǎo)入多孔基質(zhì)中，然后將基質(zhì)與該溶液溫育16小時(shí)。
然后用緩沖液洗滌基質(zhì)并通過使用WCCM水溶液與DOC結(jié)合。將300ml于水中的40％DMF(Sigma)溶液(包含1mmol去氧膽酸鈉)經(jīng)攪拌加入多孔基質(zhì)。用0.3M HCl將懸液的pH調(diào)整為4.8。在10分鐘的時(shí)間內(nèi)加入6mM WCCM的DMF∶水(1∶1.8)的溶液。然后通過周期性加入0.3M HCl而將懸液于pH4.8保持3小時(shí)。然后將其保持在室溫24小時(shí)。
所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的DOC含量如實(shí)施例17進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)施例29.
根據(jù)實(shí)施例3所獲多孔聚乙烯基質(zhì)用1.2％戊二醛的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)于室溫活化24小時(shí)。然后用緩沖液洗滌基質(zhì)，然后用濃度為50mg/ml的1，6-二氨基己烷(DAH)(Sigma)的0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)溫育24小時(shí)。然后用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌多孔基質(zhì)，并于8℃作為懸液在濃度為10mg/ml的TNF-α受體(Enbrel，Wyeth，UK)的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溶液中溫育12小時(shí)。然后將濃度為10mg/ml的氰基硼氫化鈉溶液(Sigma)加入懸液。最后用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)洗滌基質(zhì)。
通過在多孔基質(zhì)溫育前和后的TNF-α受體緩沖溶液的UV光譜學(xué)方法而間接地測(cè)定所獲基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)表面上的TNF-α受體含量。
選擇性結(jié)合和分離血液成分通過將全血經(jīng)過成形為盤且活性表面為0.02m2的基質(zhì)的濾器而實(shí)施細(xì)胞分離。
用如圖4所示的檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)施內(nèi)毒素和細(xì)胞因子的去除。容器8，用直至2升全血或血漿填充的，與泵9相連，壓力監(jiān)控器10和具有直至40個(gè)基質(zhì)板的過濾裝置1，即提供直至7m2的活性表面，所述基質(zhì)具有70～130微米的孔隙率。
細(xì)胞分離實(shí)施例30.
具有100微米孔隙率的包含聚乙烯和磁性鐵氧體(80％FeO，20％BaO2，Porex Technologies，Germany)混合物的磁性多孔基質(zhì)，用于通過使用特異性標(biāo)記的抗CD45+抗體(MACS Antibody Microbeads；Miltenyi Biotec，Germany)而從全血中分離白細(xì)胞。在用所述抗體磁性標(biāo)記白細(xì)胞后，將血液經(jīng)過多孔基質(zhì)。
自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器實(shí)施白細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)，其在分離后顯示出血液中白細(xì)胞減少90％。
實(shí)施例31.
將孔隙率為200微米和活性表面為0.2m2的多孔纖維素雙乙酸鹽(Tenite，Eastman Chemicals，USA)基質(zhì)的表面，用于分離人吞噬性血細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。在EDTA真空容器(vacutainer)管(B&D，UK)中收集人全血然后將血液經(jīng)過多孔基質(zhì)。
收集的血液中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量分別減少50％和35％，如通過使用Türks試劑在Bürkner腔中差異的細(xì)胞計(jì)數(shù)而在顯微鏡下所確定的。
細(xì)胞因子的除去實(shí)施例32.
根據(jù)實(shí)施例22所獲基質(zhì)，其已經(jīng)用內(nèi)毒素除去性基團(tuán)，用作圖4所示檢測(cè)系統(tǒng)中的多孔盤。
在將抗TNF-α和戊二醛的多克隆抗體固定在多孔聚合物結(jié)構(gòu)上的氨基上后研究從全血中清除TNF-α。通過將LPS加入血液而誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生，然后將活化的全血灌注裝置中的固定的濾器。
全血中TNF-α的量(圖5)被通過酶免疫分析法(Enzymimmuno-assay，Milenia Biotec GmbH，Germany)而確定為前(◆)和后(■)裝置以便研究TNF-α由濾盤的攝取。如所示，可獲得TNF-α在全血中病理濃度的顯著的降低。
內(nèi)毒素的除去實(shí)施例33.
根據(jù)實(shí)施例25所獲的基質(zhì)，即等離子體修飾的聚乙烯基質(zhì)，其上具有借助間隔臂二氨基己烷而固定在其上的DOC，其首先經(jīng)由戊二醛而偶聯(lián)于基質(zhì)然后通過使用碳二亞胺而偶聯(lián)于脫氧膽酸。將所獲基質(zhì)用作如圖4所示的系統(tǒng)的濾器裝置中的多孔盤。
按照與實(shí)施例32相似的方式實(shí)施從血漿中除去LPS。
血漿中LPS的量通過鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物測(cè)定法(LimulusAmebocyte Lysate assay)(Endochrome-K，Charles River LaboratoriesInc.USA)在經(jīng)濾器裝置的再循環(huán)期間以不同的時(shí)間間隔大批測(cè)定。
圖6中顯示了內(nèi)毒素(pg/ml)的量隨時(shí)間減少。在再循環(huán)2小時(shí)后內(nèi)毒素載荷從初始的75pg/ml降至檢測(cè)極限15pg/ml。
實(shí)施例34.
將根據(jù)實(shí)施例3所獲的基質(zhì)(非固定化氨基)和實(shí)施例17(固定化DOC)分別用作多孔盤并參照其消除LPS的能力進(jìn)行比較。實(shí)施與實(shí)施例33相似的再循環(huán)實(shí)驗(yàn)，差別在于將LPS溶于蒸餾水中。
按圖4中所示測(cè)定LPS從水溶液中的消除，而再循環(huán)以0.22ml/分鐘的流速流經(jīng)10ml裝置中的每個(gè)濾器。
下述表1中以再循環(huán)120分鐘后占初始LPS濃度百分?jǐn)?shù)給出來自實(shí)施例3和實(shí)施例17的兩種基質(zhì)分別清除LPS的值。
表1.
血漿(實(shí)施例34)和水(實(shí)施例35)間消除程度的差異可用蛋白質(zhì)，LPS和配體的競(jìng)爭(zhēng)相互作用進(jìn)行解釋。
聯(lián)合除去實(shí)施例35.
將根據(jù)實(shí)施例19和實(shí)施例29所獲基質(zhì)分別用于TNF-α和IL-1的聯(lián)合除去。
具有不同特異性的兩種基質(zhì)在如圖4所示的兩種濾器裝置的閉環(huán)試驗(yàn)系統(tǒng)中串聯(lián)連接。將容器中的全血保持在37℃，通過加入LPS而活化，然后導(dǎo)入系統(tǒng)。從容器和濾器出口同時(shí)以不同的時(shí)間間隔進(jìn)行取樣以進(jìn)行細(xì)胞因子分析。
兩種基質(zhì)的結(jié)果均顯示細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的濃度分別降低了70％和55％。
下述表2總結(jié)了本發(fā)明方法用于從全血或體液中選擇性結(jié)合和分離不同成分的多適用性和可觀效能。為此目的，使用不同的多孔基質(zhì)作為具有或不具有間隔臂時(shí)附著配體的支持。由此，固定方法分別用戊二醛通過使用兩種末端-NH2和用具有一個(gè)末端-NH2和一個(gè)末端-OH或-COOH的1-乙基-3(3-二甲胺基丙胺)碳二亞胺進(jìn)行實(shí)施。
還使用了經(jīng)由醛或氨基官能性硅烷偶聯(lián)劑而用于氨基、抗體、酶、肽、蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的硅烷化，醛基自發(fā)地與胺、肽和蛋白質(zhì)反應(yīng)。
表2
表2.(續(xù))
縮寫B(tài)PI＝殺菌透性增加的蛋白質(zhì)；DAH＝1，6-二氨基-己烷；DOC＝脫氧膽酸；EDC＝1-乙基-3(3-二甲胺基丙胺)碳二亞胺；GDA＝戊二醛；HA＝透明質(zhì)酸；IL-1＝白介素-1；PEI＝聚乙烯亞胺；Recombumin＝重組人血清白蛋白；Sil.ald.＝醛官能性硅烷偶聯(lián)劑；Sil.-NH2＝氨基官能性硅烷偶聯(lián)劑；TNF-α＝腫瘤壞死因子-α。
權(quán)利要求
1.一種從全血或體液中選擇性結(jié)合和分離至少一種成分的方法，其中使所述血液或體液經(jīng)過剛性并整合的分離基質(zhì)而不會(huì)被其排阻，所述基質(zhì)具有孔徑為5微米～500微米的多孔結(jié)構(gòu)以及0.5cm2～10m2的活性表面，其能夠結(jié)合所述至少一種成分。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)還包括至少一種通過所述多孔結(jié)構(gòu)的被覆和/或表面修飾的方法而引入的官能團(tuán)，所述至少一種官能團(tuán)單獨(dú)或與所述多孔結(jié)構(gòu)的非官能化區(qū)聯(lián)合能夠結(jié)合所述至少一種成分。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)由金屬、無機(jī)氧化物、碳、玻璃、陶瓷、合成聚合物和/或天然聚合物，或其混合物制成。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述金屬是磁性的。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述合成或天然聚合物被覆在所述金屬、高表面積無機(jī)氧化物、碳、玻璃、陶瓷、合成聚合物，和/或天然聚合物，或其混合物上。
6.權(quán)利要求3或5的方法，其中所述合成聚合物選自下組，包括聚烯烴、乙烯類聚合物、含氟聚合物、聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚酰亞胺、聚亞胺、聚苯乙烯及其共聚物、硅橡膠、聚酯、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚磺酸酯、聚乙二醇、聚醚、或聚環(huán)氧烷、或其共聚物或其雜化物。
7.權(quán)利要求的方法3或5，其中所述天然聚合物選自下組，包括多糖、多糖類、聚氨基酸、聚乳酸、或聚乙醇酸、或其共聚物或其雜化物。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所述表面修飾通過電沉積、電蒸發(fā)、等離子體化學(xué)沉積、離子等離子體流的沉積、等離子體聚合、等離子體增強(qiáng)的表面聚合體沉積、或化學(xué)蒸汽沉積的方法實(shí)施。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔結(jié)構(gòu)通過燒結(jié)、擠出模塑或發(fā)泡的方法獲得。
10.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種官能團(tuán)選自下組，包括巰基、羧化物、胺、醛、酮、羥基、鹵素、酰肼、或活性氫。
11.權(quán)利要求2的方法，其中配體以共價(jià)方式與所述至少一種官能團(tuán)偶聯(lián)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述配體選自下組，包括蛋白質(zhì)、肽、抗體或其片段、糖類、多糖、激素、抗氧化劑、糖蛋白、脂蛋白、脂質(zhì)、脂溶性維生素、膽汁酸、活性染料、尿囊素、尿酸、或多粘菌素、或其組合。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中交聯(lián)臂在所述至少一種官能團(tuán)和所述配體間共價(jià)偶聯(lián)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述交聯(lián)臂選自下組，包括同基雙功能性、異基雙功能性和三功能性交聯(lián)臂。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述交聯(lián)臂作為間隔臂在所述至少一種官能團(tuán)和所述配體間共價(jià)偶聯(lián)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述間隔臂選自下組，包括硅烷、二異氰酸酯、乙醇酸酯、聚乙二醇、琥珀酰亞胺試劑、二肼、己二酸、二氨、氨基酸、氨基酸低聚物、聚氨基酸、肽、和蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述分離基質(zhì)的形狀為盤、桿、筒、環(huán)、球、管、或空心管。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其在包含罩(2)，入口(3)，出口(4)，和所述至少一種分離基質(zhì)(5a，5b，...)的裝置(1)中實(shí)施。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述裝置含有若干分離基質(zhì)(5a，5b，...)，每一基質(zhì)均選擇性地和分離性地從全血或體液中除去至少一種成分。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中經(jīng)過所述裝置的流速為5ml/小時(shí)～6000ml/分鐘。
21.固定在支持物上的膽汁酸部分用于從含有相同成分的水溶液中除去成分的用途。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述膽汁酸部分是脫氧膽酸部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從全血或體液中選擇性結(jié)合和分離至少一種成分的方法，由此能夠使血液或體液經(jīng)過剛性并整合的分離基質(zhì)而不會(huì)被其排阻。所述基質(zhì)具有孔徑為5微米～500微米的多孔結(jié)構(gòu)以及0.5cm
文檔編號(hào)B01D39/20GK1649667SQ03809335
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2003年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月25日
發(fā)明者B·約翰遜, L·勒瓊戈蘭 申請(qǐng)人:阿爾特克醫(yī)藥股份公司