專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于血液凈化治療的免疫吸附柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液凈化治療技術(shù)，特別提供了一種用于血液凈化治療的免疫吸附柱。
背景技術(shù)：
血液免疫吸附治療是近年來(lái)新興的一種臨床醫(yī)療技術(shù)，對(duì)于一些藥物沒(méi)有明顯療效的疑難病癥，如自身免疫系統(tǒng)疾病、器官移殖排異、重癥肝炎、惡性腫瘤、腎病綜合癥、黃疸等進(jìn)行體外免疫吸附血液凈化，往往可以獲得良好的效果。血液免疫吸附治療技術(shù)正被廣泛地應(yīng)用于泌尿、肝臟病、血液、心功能衰竭等多種臨床領(lǐng)域。血液免疫吸附柱的研制和生產(chǎn)也已成為一個(gè)重要的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。
蛋白A是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)產(chǎn)生的一種單肽鏈蛋白質(zhì)，與免疫球蛋白G(IgG)有廣泛的結(jié)合能力，且特異性地結(jié)合IgG的不變區(qū)(Fc)。因此蛋白A對(duì)自身免疫系統(tǒng)疾病中產(chǎn)生的循環(huán)免疫復(fù)合物(Circulating immune complexes)有著特異性相互作用。針對(duì)自身免疫系統(tǒng)疾病引起的體內(nèi)抗體和循環(huán)免疫復(fù)合物的增加，諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫溶血性貧血、免疫血小板減少性紫癜、初級(jí)抗磷脂綜合癥等，目前固載蛋白A的免疫吸附材料已被用于臨床清除上述患者體內(nèi)的抗體和循環(huán)免疫復(fù)合物，相關(guān)的免疫吸附醫(yī)療器械已獲得美國(guó)FDA認(rèn)證，在歐洲也獲得相關(guān)部門(mén)認(rèn)證。
作為吸附配體的蛋白A具有對(duì)IgG作用特異性強(qiáng)，非特異性吸附弱的優(yōu)點(diǎn)。但是，由于蛋白A為生物大分子，容易變性失活且價(jià)格昂貴，因此蛋白A免疫吸附材料制備及保存成本較高，吸附材料的使用壽命較短。同時(shí)增加了患者的治療費(fèi)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于血液凈化治療的免疫吸附柱，該免疫吸附柱在保持較高的吸附量及特異性的同時(shí)，能降低制作成本，提高使用壽命，因而可以大幅度降低免疫吸附治療的費(fèi)用。
本發(fā)明具體提供了一種用于血液凈化治療的免疫吸附柱，其特征在于該免疫吸附柱由分別鍵合了蛋白A和L-組氨酸配體的兩種吸附介質(zhì)按比例混合勻漿裝填構(gòu)成，組成為蛋白A免疫吸附介質(zhì)L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)1∶9～9∶1體積比。
本發(fā)明用于血液凈化治療的免疫吸附柱中，所述吸附介質(zhì)的親和基質(zhì)為Sepharose CL-4B凝膠。
本發(fā)明用于血液凈化治療的免疫吸附柱中，所述鍵合了L-組氨酸配體的吸附介質(zhì)，由基質(zhì)上的環(huán)氧活性基團(tuán)與L-組氨酸中的伯氨基直接反應(yīng)形成。
本發(fā)明用于血液凈化治療的免疫吸附柱中，所述鍵合了L-組氨酸配體的吸附介質(zhì)，由首先在基質(zhì)上連接已二胺間隔臂，然后采用羰基二咪唑法共價(jià)鍵合L-組氨酸形成。
本發(fā)明用于血液凈化治療的免疫吸附柱中，所述鍵合了蛋白A的吸附介質(zhì)，由在環(huán)氧活化的基質(zhì)上先連接雙氨基基團(tuán)，然后采用戊二醛法共價(jià)鍵合蛋白A形成。
L-組氨酸作為氨基酸與蛋白質(zhì)等生物分子之間具有很好的生物兼容性，而且由于組氨酸分子中含有羧基和氨基活性基團(tuán)，更有利于通過(guò)化學(xué)鍵合的手段與親合基質(zhì)相連接。采用L-組氨酸等模擬配體的免疫吸附材料克服了價(jià)格昂貴與蛋白A易變性失活的缺點(diǎn)，制備與治療成本大大低于蛋白A，吸附材料使用壽命得以延長(zhǎng)，同樣具有較高的吸附率、特異性及生物兼容性。只是在非特異性，吸附率方面略遜于蛋白A。
也就是說(shuō)，通過(guò)共價(jià)鍵合的方法，將蛋白A或者組氨酸鍵合在親合基質(zhì)上，均可以用于清除免疫系統(tǒng)疾病患者血液中過(guò)量的IgG。但是二者各有所長(zhǎng)、各有所短。蛋白A配體特異性更強(qiáng)、吸附效率更高、非特異性吸附低于L-組氨酸配體；但是在化學(xué)和物理性質(zhì)穩(wěn)定、配體價(jià)格、優(yōu)化提高配體鍵合量、使用壽命方面，L-組氨酸無(wú)疑優(yōu)于蛋白A。
正是鑒于上述因素，本發(fā)明制備出了將鍵合了蛋白A和組氨酸配體的吸附介質(zhì)以不同的比例混合裝填的血液免疫吸附柱。通過(guò)調(diào)控兩種介質(zhì)的比例，可制備成對(duì)人IgG標(biāo)準(zhǔn)品或人血漿中的IgG與免疫復(fù)合物不同吸附量的血液免疫吸附柱，如以1∶1(體積比)裝填的吸附柱吸附量可達(dá)18mg/mL。利用基體輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)上述被吸附的人IgG的純度，未發(fā)現(xiàn)有其他雜質(zhì)，證明該血液免疫吸附柱有很好的特異性。
總之，本發(fā)明首次將通過(guò)共價(jià)鍵合的蛋白A免疫吸附介質(zhì)與L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)以一定比例混合裝填制備成混合介質(zhì)血液免疫吸附柱。該混合介質(zhì)血液免疫吸附柱很好地綜合了蛋白A與L-組氨酸吸附介質(zhì)的各自優(yōu)勢(shì)，在保持較高的IgG吸附量、很好的生物兼容性及特異性的基礎(chǔ)上，提高了免疫吸附柱的化學(xué)和物理穩(wěn)定性，且大幅度降低了以單純蛋白A免疫吸附的治療成本。即它將蛋白A與組氨酸配體吸附介質(zhì)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的效果。這種混合介質(zhì)的吸附柱不僅制備簡(jiǎn)單，對(duì)IgG的吸附量較高，而且制備成本低、性能相對(duì)穩(wěn)定、使用壽命長(zhǎng)。具有良好的應(yīng)用前景。


圖1.L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)直接法鍵合法制備示意圖；圖2.L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)羰基二咪唑法鍵合法制備示意圖；圖3.蛋白A免疫吸附介質(zhì)制備示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.直接鍵合法制備L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)(1)制備環(huán)氧介質(zhì)的合成用量筒量取Sepharose CL-4B凝膠15mL，分別加入水18mL，2mol/LNaOH 7mL，環(huán)氧氯丙烷5mL，混勻。在40℃反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)中要攪拌，反應(yīng)完成后，再分別用無(wú)水乙醇和水沖洗，濾干。
(2)L-組氨酸親合吸附介質(zhì)的制備在30mL NaHCO3緩沖液中加入1.5mmol L-組氨酸，用NaOH調(diào)節(jié)pH為13。加入環(huán)氧Sepharose CL-4B凝膠與組氨酸的溶液混勻，60℃反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)完成后，分別用無(wú)水乙醇和水沖洗，濾干。
L-組氨酸的鍵合量為12.7mg/g，對(duì)人IgG(分子量160kD)吸附量為12.0mg/g。
直接法鍵合法制備L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)示意圖見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2羰基二咪唑法共價(jià)鍵合L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)(1)環(huán)氧介質(zhì)的合成用量筒量取Sepharose CL-4B凝膠15mL，分別加入水18mL，2mol/LNaOH 7mL，環(huán)氧氯丙烷5mL，混勻。在40℃反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)中要攪拌，反應(yīng)完成后，再分別用無(wú)水乙醇和水沖洗，濾干。
(2)氨基介質(zhì)的合成將上述制備的環(huán)氧凝膠與5mL水，45mL 13g/L己二胺-NaHCO3緩沖液混勻，NaOH調(diào)節(jié)pH為11。80℃反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)中要攪拌。反應(yīng)完成后，分別用無(wú)水乙醇和水沖洗，濾干。
(3)L-組氨酸親合吸附介質(zhì)的合成取一定體積二氧六環(huán)于圓底燒瓶中，加入適量鈉絲及指示劑二苯甲酮，加熱回流至溶液呈深藍(lán)色。然后立即蒸出二氧六環(huán)使用。
使用蒸出的二氧六環(huán)氨基凝膠，然后加入羰基二咪唑室溫下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完成后分別用二氧六環(huán)和25mM Tris-HCl緩沖液沖洗。最后加入25mM Tris-HCl緩沖液與L-組氨酸，調(diào)節(jié)pH為7.4，室溫反應(yīng)8小時(shí)。反應(yīng)完成后，用水沖洗。
L-組氨酸的鍵合量為8.3mg/g，對(duì)人IgG(分子量160kD)吸附量為11.5mg/g。
羰基二咪唑法共價(jià)鍵合L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)示意圖見(jiàn)圖2。
實(shí)施例3蛋白A免疫吸附介質(zhì)的制備(1)環(huán)氧介質(zhì)的合成用量筒量取Sepharose CL-4B凝膠15mL，分別加入水18mL，2mol/LNaOH 7mL，環(huán)氧氯丙烷5mL，混勻。在40℃反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)中要攪拌，反應(yīng)完成后，再分別用無(wú)水乙醇和水沖洗，濾干。
(2)氨基介質(zhì)的合成將上述環(huán)氧凝膠與5mL水，45mL 13g/L己二胺-NaHCO3緩沖液混勻。搖床中50-55℃反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)中要攪拌，反應(yīng)完成后，分別用無(wú)水乙醇和水沖洗，濾干。
(3)醛基介質(zhì)的合成上述氨基凝膠與37mL水，3mL 25％的戊二醛混勻。室溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)中要攪拌，反應(yīng)完成后，分別用水、2mol/L醋酸和水沖洗，最后用0.1mol/L pH8.2的硼酸鹽緩沖液平衡、濾干。
(4)免疫吸附介質(zhì)的合成將上述的醛基凝膠與5mL水混勻，再加入60mg的Protein A溶于25mL0.1mol/L的硼酸鹽緩沖液。室溫反應(yīng)20小時(shí)以上，反應(yīng)中要攪拌，反應(yīng)完成后，濾干。分別加入水5mL和40g/L pH8.2的甘氨酸乙酯緩沖液25mL，混勻。室溫反應(yīng)2小時(shí)進(jìn)行封尾。最后用硼氫化鈉在冰浴下加入，室溫反應(yīng)6-8小時(shí)。反應(yīng)完成后，分別用水、0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液、含1mol/L氯化鈉的0.1mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液和水沖洗，濾干。
蛋白A的鍵合量為4.0mg/g，對(duì)人IgG(分子量160kD)吸附量為25.0mg/g。
蛋白A免疫吸附介質(zhì)的制備示意圖見(jiàn)圖3。
實(shí)施例4混合介質(zhì)的免疫吸附柱對(duì)人IgG的吸附體積比為1∶1的實(shí)施例1L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)與實(shí)施例3蛋白A免疫吸附介質(zhì)混合裝填為混合介質(zhì)吸附柱。
首先用0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液沖洗，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液平衡，然后用泵將人血漿注入protein A凝膠裝柱中，使其達(dá)到飽和吸附，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗去不吸附的蛋白及過(guò)量的人IgG，最后用0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液將吸附的人IgG洗脫下來(lái)，收集洗脫液定容，用吸光光度法測(cè)量人IgG的吸附量。
混合介質(zhì)的免疫吸附柱對(duì)人IgG的吸附量達(dá)到18.0mg/g以上。
實(shí)施例5混合介質(zhì)的免疫吸附柱對(duì)人IgG的吸附體積比為1∶1的實(shí)施例2L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)與實(shí)施例3蛋白A免疫吸附介質(zhì)混合裝填為混合介質(zhì)吸附柱。
首先用0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液沖洗，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液平衡，然后用泵將人血漿注入protein A凝膠裝柱中，使其達(dá)到飽和吸附，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗去不吸附的蛋白及過(guò)量的人IgG，最后用0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液將吸附的人IgG洗脫下來(lái)，收集洗脫液定容，用吸光光度法測(cè)量人IgG的吸附量。
混合介質(zhì)的免疫吸附柱對(duì)人IgG的吸附量達(dá)到18.0mg/g以上。
實(shí)施例6混合介質(zhì)的免疫吸附柱對(duì)人IgG的吸附組氨酸免疫吸附介質(zhì)L-組氨酸的鍵合量為12.7mg/g，對(duì)人IgG(分子量160kD)吸附量為12.0mg/g。
蛋白A免疫吸附介質(zhì)蛋白A的鍵合量為4.0mg/g，對(duì)人IgG(分子量160kD)吸附量為25.0mg/g。
將上述免疫吸附介質(zhì)分別按1∶0.5、1∶1、1∶2裝填為混合介質(zhì)吸附柱。
首先用0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液沖洗，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液平衡，然后用泵將人血漿注入protein A凝膠裝柱中，使其達(dá)到飽和吸附，再用0.02mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗去不吸附的蛋白及過(guò)量的人IgG，最后用0.2mol/L pH2.3的甘氨酸-鹽酸緩沖液將吸附的人IgG洗脫下來(lái)，收集洗脫液定容，用吸光光度法測(cè)量人IgG的吸附量。
不同比例混合介質(zhì)的免疫吸附柱對(duì)人IgG的吸附量見(jiàn)表1。
表1.不同比例混合介質(zhì)的免疫吸附柱對(duì)人IgG的吸附量比較

權(quán)利要求
1.一種用于血液凈化治療的免疫吸附柱，其特征在于該免疫吸附柱由分別鍵合了蛋白A和L-組氨酸配體的兩種吸附介質(zhì)按比例混合勻漿裝填構(gòu)成，組成為蛋白A免疫吸附介質(zhì)∶L-組氨酸免疫吸附介質(zhì)1∶9～9∶1體積比。
2.按照權(quán)利要求1所述用于血液凈化治療的免疫吸附柱，其特征在于所述吸附介質(zhì)的親和基質(zhì)為Sepharose CL-4B凝膠。
3.按照權(quán)利要求1或2所述用于血液凈化治療的免疫吸附柱，其特征在于所述鍵合了L-組氨酸配體的吸附介質(zhì)，由基質(zhì)上的環(huán)氧活性基團(tuán)與L-組氨酸中的伯氨基直接反應(yīng)形成。
4.按照權(quán)利要求1或2所述用于血液凈化治療的免疫吸附柱，其特征在于所述鍵合了L-組氨酸配體的吸附介質(zhì)，由首先在基質(zhì)上連接己二胺間隔臂，然后采用羰基二咪唑法共價(jià)鍵合L-組氨酸形成。
5.按照權(quán)利要求1或2所述用于血液凈化治療的免疫吸附柱，其特征在于所述鍵合了蛋白A的吸附介質(zhì)，由在環(huán)氧活化的基質(zhì)上先連接雙氨基基團(tuán)，然后采用戊二醛法共價(jià)鍵合蛋白A形成。
全文摘要
一種用于血液凈化治療的免疫吸附柱，其特征在于該免疫吸附柱由分別鍵合了蛋白A和L－組氨酸配體的兩種吸附介質(zhì)按比例混合勻漿裝填構(gòu)成，組成為蛋白A免疫吸附介質(zhì)L－組氨酸免疫吸附介質(zhì)1∶9～9∶1體積比。本發(fā)明將蛋白A與組氨酸配體吸附介質(zhì)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的效果。這種混合介質(zhì)的吸附柱不僅制備簡(jiǎn)單，對(duì)IgG的吸附量較高，而且制備成本低、性能相對(duì)穩(wěn)定、使用壽命長(zhǎng)。具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)B01D15/00GK1718254SQ200410020910
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月7日
發(fā)明者鄒漢法, 孔亮, 劉月啟, 唐守萬(wàn) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所