專利名稱：：一種構(gòu)建t載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種構(gòu)建載體的方法，特別涉及一種構(gòu)建T載體的方法。
背景技術(shù)：
：PCR(polymerasechainreaction)是分子生物學(xué)中的常規(guī)實驗技術(shù)。絕大多數(shù)情況下需要將PCR擴增產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上，以便對PCR產(chǎn)物進行測序、體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯等操作?？寺CR產(chǎn)物的方法有很多種，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所謂TA克隆就是將3’端具有單個A尾巴的PCR產(chǎn)物克隆到3’端具有單個T尾巴的T載體上。TA克隆的理論依據(jù)是在PCR擴增過程中，由于Taq聚合酶具有不依賴于模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性而在PCR產(chǎn)物的3’末端添加單個脫氧核苷酸，并且偏好添加四種脫氧核苷酸中的脫氧腺苷酸(A)(Clark，J.M.，1988.Novelnon-templatednucleotideadditionreactionscatalyzedprokaryoticandeucaryoticDNApolymerase.NucleicAcidsRes.16，9677-9686；Cha，J.，Bishai，W.，Chandrasegaran，S.，1993.NewvectorsfordirectcloningofPCRproducts.Gene136，369-370；Schutte，B.C.，Ranade，K.，Pruessner，J.，Dracopoli，N.，1997.OptimizedconditionsforcloningPCRproductsintoanXcmIT-vector.BioTechniques22，40-42)，使得50％以上的PCR產(chǎn)物的3’末端具有單個脫氧腺苷酸，即3’端A尾巴(Ichihara，Y.，Kurosawa，Y.，1993.ConstructionofnewTvectorsfordirectcloningofPCRproducts.Gene130，153-154)。目前，T載體的制備方法有3種。第一種方法是利用產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶將環(huán)狀質(zhì)粒酶切成線狀質(zhì)粒，然后利用末端轉(zhuǎn)移酶將單個雙脫氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到線狀載體的3’端(Holton，T.A.，Graham，M.W.，1991.AsimpleandefficientmethodfordirectcloningofPCRproductsusingddT-tailedvectors.NucleicAcidsRes.19，1156)。第二種方法是利用Taq酶的不依賴于模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性將單個脫氧胸腺核苷酸(dTTP)添加到線狀載體的3’端(Marchuk，D.，Drumm，M.，Saulino，A.，Collins，F(xiàn).S.，1991.ConstructionofT-vectors，arapidandgeneralsystemfordirectcloningofunmodifiedPCRproducts.NucleicAcidsRes.19，1154)。第三種方法是在質(zhì)粒載體的多克隆位點中引入特定的酶切位點，用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生3’端具有單個T突出的線性T載體。前兩種方法在制備T載體過程中存在加尾效率較低以及線性質(zhì)粒在加尾過程中其兩端的序列有時會被部分刪除等問題(Shuman，S.，1994.NovelapproachtomolecularcloningandpolynucleotidesynthesisusingvacciniaDNAtopoisomerase.J.Biol.Chem.265，32678-32684)。與前兩種方法相比，第三種方法更快捷、更高效以及更穩(wěn)定。理論上，可以用來制備T載體的內(nèi)切酶包括XcmI(Jo，C.，Jo，S.A.，2001.AsimplemethodtoconstructTvectorsusingXcmIcassettesamplifiedbynonspecificPCR.Plasmid45，37-40；Arashi，N.，Miwa，M.，Shibata，H.，1999.XcmIsite-containingvectorfordirectcloningandinvitrotranscriptionforPCRproduct.Mol.Biotechnol.12，281-283)、AhdI/Eam1105I/EclHKI/AspEI/NruGI/BspOVI(Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.ConstructionoftwopGEM-7Zf(+)phagemidT-tailvectorsusingAhdI-restrictionendonucleasesitesfordirectcloningofPCRproducts.Plasmid48，160-163；Ichihara，Y.，Kurosawa，Y.，1993.ConstructionofnewTvectorsfordirectcloningofPCRproducts.Gene130，153-154)、BfiI/BmrI、HphI/AsuHPI(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，Smith，L.M.，1991.AuniversalmethodforthedirectcloningofPCRamplifiednucleicacid.Bio/Technology9，657-663)、MboII/NcuI，BfuI/BciVI，HpyAV/Hin4II。其中XcmI和AhdI及其同裂酶在制備T載體中得到廣泛應(yīng)用。其它內(nèi)切酶要么因為太昂貴，要么因為在普通的克隆載體上有太多的識別位點，因而在制備T載體中的應(yīng)用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆載體中，例如pUC18、pBlueScriptSK載體等，都不具有XcmI酶切位點，但在Amp抗性基因中含有一個AhdI及其同裂酶的酶切位點，因而在這些載體的多克隆位點引入XcmI位點更方便一些，這就是為什么更多人采用XcmI制備T載體(美國專利文獻US005487993A；中國專利文獻CN1142279C，CN1344795A以及CN1362521A)。如果要引入AhdI及其同裂酶的酶切位點，則必須通過定點突變的方法沉默Amp抗性基因中相應(yīng)的酶切位點。盡管如此，利用AhdI及其同裂酶制備T載體比起XcmI更有優(yōu)勢，表現(xiàn)在如下幾個方面。第一，AhdI有5種同裂酶，其中的4種同裂酶已經(jīng)商品化，因而加上AhdI有5種內(nèi)切酶可供選用，而XcmI沒有同裂酶(RobertsR.J.，T.Vincze，J.Posfai，andD.Macelis.2003.REBASErestrictionenzymesandmethyltransferases.NucleicAcidsRes.31418-420)。第二，AhdI內(nèi)切酶的性能要優(yōu)于XcmI(Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.ConstructionoftwopGEM-7Zf(+)phagemidT-tailvectorsusingAhdI-restrictionendonucleasesitesfordirectcloningofPCRproducts.Plasmid48，160-163)，且AhdI的市場銷售價遠低于XcmI(見《NEB產(chǎn)品目錄及技術(shù)資料》，2003-2004年度)。第三，AhdI及其同裂酶識別11bp的序列，而XcmI識別15bp的序列，因而引入(例如在PCR引物中引入)AhdI及其同裂酶識別序列更容易些。無論是使用XcmI還是使用AhdI及其同裂酶構(gòu)建T載體均存在一個潛在的問題部分酶切的前T載體混雜在T載體中會導(dǎo)致非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，Smith，L.M.，1991.AuniversalmethodforthedirectcloningofPCRamplifiednucleicacid.Bio/Technology9，657-663；Harrison，J.，Molly，P.L.，Clark，S.J.，1994.DirectcloningofpolymerasechainreactionproductsinanXcmIT-vector.Anal.Biochem.216，235-236)。目前，解決這一問題最有效的方法是在前T載體的兩個XcmI或兩個AhdI酶切位點之間引入足夠長的間隔DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后將完全酶切的質(zhì)粒和部分酶切的質(zhì)粒分開(Testori，A.，Sollitti，P.，1996.CloningunmodifiedPCRproductsusingengineeredXcmIrestrictionsitesinaportablecassette.MethodsMol.Biol.67，89-100；Jo，C.，Jo，S.A.，2001.AsimplemethodtoconstructTvectorsusingXcmIcassettesamplifiedbynonspecificPCR.Plasmid45，37-40；Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.ConstructionoftwopGEM-7Zf(+)phagemidT-tailvectorsusingAhdI-restrictionendonucleasesitesfordirectcloningofPCRproducts.Plasmid48，160-163)。然而，引入間隔DNA后帶來的一個新問題是由于環(huán)型質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳中比起分子量相當?shù)木€型質(zhì)粒移動得快，因而，未被酶切的環(huán)型質(zhì)粒(前T載體，帶有間隔DNA)往往與分子量小于自身的T載體(不帶有間隔DNA)混雜，最終造成非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高。pBlueScriptIISK(+/-)載體(GenBankAccessionNo.X52330)是由pUC載體派生而來的噬菌粒載體(phagemid或phasmid)，除了含有一個Amp抗性基因及一個lacZ基因作為篩選標記外，在多克隆位點的兩側(cè)存在T3和T7噬菌體的啟動子，同時具有一個單鏈噬菌體f1的復(fù)制起點(pBlueScriptIISK(+)和pBlueScriptIISK(-)的唯一區(qū)別是兩者f1的反向相反)。ccdB基因(GenBankAccessionNo.AP001918)位于F質(zhì)粒上，它和ccdA基因一起構(gòu)成F質(zhì)粒的ccd(controlofcelldeath)位點。ccd位點通過殺死不含F(xiàn)質(zhì)粒的大腸桿菌細胞達到穩(wěn)定F質(zhì)粒的作用。CcdB蛋白干擾大腸桿菌的DNA促旋酶，因而抑制大多數(shù)大腸桿菌菌株(例如DH5α，JM109，DH10B，TOP10)的生長(Bernard，P.，andCouturier，M.，1992.CellKillingbytheFPlasmidCcdBProteinInvolvesPoisoningofDNA-TopoisomeraseIIComplexes.J.Mol.Biol.226，735-745)。但是大腸桿菌DB3.1菌株中促旋酶的A亞基基因發(fā)生了一處突變，突變后的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效應(yīng)，因而含有ccdB基因的質(zhì)?？梢栽贒B3.1菌株中增殖(Miki，T.，Park，J.A.，Nagao，K.，Murayama，N.，andHoriuchi，T.，1992.ControlofSegregationofChromosomalDNAbySexFactorFinEscherichiacoli.MutantsofDNAGyraseSubunitASuppressletD(ccdB)ProductGrowthInhibition.J.Mol.Biol.225，39-52)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種制備具有較高TA克隆效率的T載體方法。本發(fā)明所提供的制備T載體的方法，包括以下步驟1)制備含有XcmI盒或AhdI盒的前T載體；所述XcmI盒包括間隔DNA序列、緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個XcmI酶切位點序列，所述AhdI盒包括所述間隔DNA序列、緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個AhdI酶切位點序列；2)用XcmI或XcmI的同裂酶，或AhdI或AhdI的同裂酶酶切步驟1)中的前T載體，得到T載體；其中，所述步驟1)中的間隔DNA序列為ccdB基因序列。所述ccdB基因序列可為ccdB基因全序列(GenBankAccessionNo.AP001918)，也可為ccdB基因的開放閱讀框。所述XcmI盒還包括連接于所述各一個XcmI酶切位點序列的除XcmI酶切位點序列外的酶切位點序列；所述AhdI盒還包括連接于所述各一個AhdI酶切位點序列的除AhdI酶切位點序列外的酶切位點序列。用于制備所述前T載體的出發(fā)載體可為基因工程領(lǐng)域中的環(huán)狀質(zhì)粒載體，優(yōu)選為pBlueScriptIISK或pUC18或pUC19或pUC118或pUC119或pGEM系列等，尤其優(yōu)選為pBlueScriptIISK(-)。當用于制備所述前T載體的出發(fā)載體為pBlueScriptIISK(-)時，所述pBlueScriptIISK(-)中的Amp抗性基因的AhdI酶切位點被沉默。其中，pBlueScriptIISK(-)中的Amp抗性基因的AhdI酶切位點可通過突變方法沉默，如通過定點突變的方法，將自Amp抗性基因的5′端第783位堿基G突變?yōu)镃。可在Amp抗性基因的AhdI酶切位點被沉默的pBlueScriptIISK(-)中的多克隆位點引入所述AhdI盒；其中，優(yōu)選為在所述多克隆位點的SalI酶切位點和XbaI酶切位點之間或KpnI酶切位點和SacI酶切位點之間或EcoRI酶切位點和EcoRI酶切位點之間或EagI酶切位點和EagI酶切位點之間引入所述AhdI盒。所述AhdI盒優(yōu)選為具有如序列表中序列1、序列2、序列3或序列4所示的核苷酸序列。序列表中的序列1由343個堿基組成；序列表中的序列2由343個堿基組成；序列表中的序列3由343個堿基組成；序列表中的序列4由373個堿基組成。所述前T載體優(yōu)選為pSK01或pSK02或pSK03或pSK04；所述T載體優(yōu)選為pSK01-T(其物理圖譜如圖2所示)或pSK02-T(其物理圖譜如圖3所示)或pSK03-T(其物理圖譜如圖4所示)或pSK04-T(其物理圖譜如圖5所示)。所述AhdI的同裂酶包括Eam1105I/EclHKI/AspEI/NruGI/BspOVI。本發(fā)明制備T載體的方法中的前T載體的XcmI盒或AhdI盒采用ccdB基因作為間隔DNA，使得間隔DNA同時具有間隔兩個XcmI或AhdI酶切位點和作為負選標記的雙重作用。以ccdB基因作為間隔DNA的前T載體可以在DB3.1菌株中增殖，當將T載體與PCR產(chǎn)物等組成的連接體系轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌菌株(例如DH5α，JM109，DH10B，TOP10)時，混雜到T載體中的前T載體(包括未酶切的環(huán)型質(zhì)粒及部分酶切的線型質(zhì)粒經(jīng)連接而成的環(huán)型質(zhì)粒)會殺死大腸桿菌細胞。這樣，TA克隆過程中由前T載體造成的非重組轉(zhuǎn)化子本底過高的問題得到徹底解決。此外，一小部分T載體的T尾巴由于種種原因(例如AhdI及其同裂酶以及連接酶等殘存的核酸外切酶活性、反復(fù)凍融等)會被去除，去除T尾巴的T載體經(jīng)自身連接產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子是組成非重組轉(zhuǎn)化子本底的另一個來源。當本發(fā)明的出發(fā)載體為pBlueScriptIISK(-)時，通過精確設(shè)計AhdI盒使得上述來源的非重組轉(zhuǎn)化子具有完整的lacZ讀碼框，從而可以經(jīng)藍白斑篩選去除這種非重組轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的制備T載體的方法可最大限度地降低T載體中混雜的未酶切的環(huán)型質(zhì)粒和部分酶切的線型質(zhì)粒。用本發(fā)明方法構(gòu)建的pSKxx系列前T載體(包括pSK01、pSK02、pSK03和pSK04)以及由這些前T載體制備而來的pSKxx-T系列T載體(包括pSK01-T、pSK02-T、pSK03-T和pSK04-T)是基于pBlueScriptIISK(-)構(gòu)建而成。這些載體具有如下幾個方面的特點1、具有pBlueScriptIISK(-)載體的全部特性。除了含有一個Amp抗性基因及一個lacZ基因作為篩選標記外，在多克隆位點的兩側(cè)存在T3和T7噬菌體的啟動子，同時具有一個單鏈噬菌體f1的復(fù)制起點。2、利用定點突變的方法沉默了pBlueScriptIISK(-)載體中Amp抗性基因的AhdI酶切位點。沉默AhdI酶切位點的載體命名為pSKΔAhd。Amp抗性基因中發(fā)生定點突變前后的堿基(框中的堿基)如下突變前的序列突變后的序列3、pSKxx系列前T載體是在pSKΔAhd的多克隆位點中引入AhdI盒構(gòu)建而成。AhdI盒的核心序列如下(陰影部分顯示AhdI酶切位點，框中部分代表ccdB基因序列，N為A或T或C或G，“^”表示酶切割的具體位點)4、AhdI盒中的ccdB基因具有間隔DNA和負選標記的雙重作用。ccdB作為間隔DNA是指ccdB基因序列將兩個AhdI酶切位點間隔開，ccdB基因作為負選標記基因是指含有ccdB基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到普通大腸桿菌菌株細胞后將殺死大腸桿菌細胞。AhdI盒中的ccdB基因可以有三種形式第一種形式是ccdB基因與其前面的lacZ讀碼框融合，在lacZ啟動子驅(qū)動下表達產(chǎn)生融合CcdB蛋白；第二種形式是ccdB基因的前面帶有核糖體結(jié)合位點(RBS)序列，在lacZ啟動子驅(qū)動下表達產(chǎn)生CcdB蛋白；第三種形式是ccdB基因的前面帶有自身啟動子及RBS序列，在lacZ啟動子和其自身啟動子的雙重驅(qū)動下表達產(chǎn)生CcdB蛋白。5、使用AhdI內(nèi)切酶或其同裂酶(Eam1105I/EclHKI/AspEI/NruG/BspOVI)酶切pSKxx系列前T載體，酶切體系經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收的大片段即是相應(yīng)的T載體。4種T載體的區(qū)別在于多克隆位點中酶切位點的種類及數(shù)量不同。其中，pSK02-T具有最少的酶切位點，可以減少高GC含量及回文結(jié)構(gòu)對體外轉(zhuǎn)錄的影響，因此pSK02-T尤其適合于對插入片段進行體外轉(zhuǎn)錄。pSK03-T保留了pBlueScriptIISK(-)載體的全部酶切位點，因此可以選擇更多的內(nèi)切酶從T載體上釋放插入片段。此外，由于額外引入了一個EcoRI酶切位點，因此可以用EcoRI單酶切從T載體上釋放插入片段。pSK04-T載體的TA克隆位點兩側(cè)引入了更多成對的內(nèi)切酶位點，因此可以用更多的內(nèi)切酶單酶切鑒定陽性克隆或釋放插入片段，其中的NotI酶切位點屬于稀有的酶切位點，插入片段中含有該酶切位點的幾率很低。6、當制備的pSKxx-T(包括pSK01-T、pSK02-T、pSK03-T和pSK04-T)系列T載體中的一小部分由于種種原因(例如AhdI及其同裂酶以及連接酶等殘存的核酸外切酶活性、反復(fù)凍融等)其T尾巴被去除時，這些失去T尾巴的質(zhì)粒經(jīng)自身連接后可以形成完整的lacZ讀碼框，因而可以通過藍白斑篩選的方法排除這些非重組轉(zhuǎn)化子。采用本發(fā)明的方法制備的T載體進行TA克隆時由于徹底解決了非重組轉(zhuǎn)化子本底過高的問題，因此大大提高了T載體的質(zhì)量和穩(wěn)定性。用本發(fā)明方法制備的pSKxx-T系列T載體具有更優(yōu)良的產(chǎn)品特性。實驗證明本發(fā)明的T載體分別克隆1.8kb和0.68kb的PCR產(chǎn)物的TA克隆效率在95％以上。本發(fā)明的制備T載體的方法將在基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。圖1A為前T載體pSK01中AhdI盒的結(jié)構(gòu)示意1B為前T載體pSK02中AhdI盒的結(jié)構(gòu)示意1C為前T載體pSK03中AhdI盒的結(jié)構(gòu)示意1D為前T載體pSK04中AhdI盒的結(jié)構(gòu)示意2為pSK01-T的物理圖譜圖3為pSK02-T的物理圖譜圖4為pSK03-T的物理圖譜圖5為pSK04-T的物理圖譜具體實施方式實施例1、pSKΔAhd的構(gòu)建利用定點突變的方法沉默pBlueScriptSK(-)載體中Amp抗性基因的AhdI酶切位點，得到pSKΔAhd，其具體的構(gòu)建方法如下在PCR引物中引入突變的堿基，以pBluescriptIISK(-)載體為模板，用PfuDNA聚合酶進行PCR擴增。其中，PCR擴增引物為(加框的C為引入的突變位點(在原始序列中為G)，陰影部分為突變破壞后的AhdI酶切位點)AmpF5’-CTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGG-3’；AmpRPCR擴增的反應(yīng)體系為50μL反應(yīng)體系中含5UPfu，0.2mmol/LdNTPs，1×Pfubuffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR擴增的循環(huán)程序為94℃預(yù)變性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，5min)×30，72℃最后延伸5min。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收PCR擴增產(chǎn)物。之后，建立如下連接反應(yīng)10μL連接體系中含3U連接酶(Promega)，1×連接Buffer，約50ngPCR產(chǎn)物。4℃連接16小時。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH10B)后，經(jīng)藍白斑及Amp抗性篩選后得到陽性克隆，隨機挑取6個陽性克隆，逐一測序，獲得AhdI酶切位點被破壞的pBluescriptIISK(-)載體，命名為pSKΔAhd。其中，Amp抗性基因中發(fā)生定點突變前后的堿基(框中的堿基)如下突變前的序列突變后的序列測序引物為Amp185’-AATAGACTGGATGGAGGC-3’。實施例2、在pSKΔAhd的多克隆位點中引入AhdI盒構(gòu)建前T載體以質(zhì)粒pENTR1A(購自Invitrogen公司)為模板，用CcdB01F和CcdB01R引物進行PCR擴增。PCR擴增的反應(yīng)體系為50μL反應(yīng)體系中含5UPfu，0.2mmol/LdNTPs，1×Pfubuffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR擴增的循環(huán)程序為94℃預(yù)變性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，1.5min)×30，72℃最后延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，將回收的PCR產(chǎn)物和pSKΔAhd質(zhì)粒分別用5alI和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。將酶切后的PCR產(chǎn)物與酶切后的pSKΔAhd載體建立如下連接反應(yīng)體系10μL連接體系中含3U連接酶(Promega)，1×連接Buffer，約50ng質(zhì)粒，約50ngPCR產(chǎn)物。4℃連接16小時以上。連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DB3.1菌株(Invitrogen)。經(jīng)Amp抗性篩選得到陽性菌落，陽性菌落經(jīng)測序鑒定得到前T載體pSK01。pSK02的構(gòu)建過程除所用的PCR擴增引物是CcdB02F和CcdB02R以及所得到的PCR擴增產(chǎn)物和pSKΔAhd分別用SacI和KpnI雙酶切外，其它步驟與pSK01同。pSK03的構(gòu)建過程與pSK01和pSK02的構(gòu)建基本類似，所不同的是用CcdB03F和CcdB03R引物進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物和pSKΔAhd質(zhì)粒分別用EcoRI酶切，酶切后的pSKΔAhd質(zhì)粒在與酶切后的PCR產(chǎn)物進行連接前用堿性磷酸酯酶處理去除5’-磷酸以防止自身環(huán)化。連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DB3.1大腸桿菌，用M13-47和ccdBR引物進行菌落PCR擴增，鑒定以正向插入(與lacZ讀碼框方向一致)的陽性克隆，得到pSK03。pSK04的構(gòu)建過程分為兩步。第一步，以含EGFP基因的pENT-NL質(zhì)粒(http//deepgreen.stanford.edu/cellimagingsite/html/vectors.html)為模板，用EGFPF和EGFPR為引物進行PCR擴增。PCR擴增的反應(yīng)體系為50μL反應(yīng)體系中含5UPfu，0.2mmol/LdNTPs，1×Pfubuffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR擴增的循環(huán)程序為94℃預(yù)變性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，2min)×30，72℃最后延伸5min。酶切后的PCR產(chǎn)物和pSKΔAhd建立如下連接反應(yīng)體系10μL連接體系中含3U連接酶(Promega)，1×連接Buffer，約50ng質(zhì)粒，50ngPCR產(chǎn)物。4℃連接16小時。連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)Amp抗性篩選得到陽性菌落，陽性菌落經(jīng)測序鑒定后，得到中間載體pSKEGFP。第二步，以質(zhì)粒pENTR1A為模板，用CcdB04F和CcdB04R引物進行PCR擴增。PCR擴增的反應(yīng)體系為50μL反應(yīng)體系中含5UPfu，0.2mmol/LdNTPs，1×Pfubuffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR擴增的循環(huán)程序為94℃預(yù)變性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，1.5min)×30，72℃最后延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，將回收的PCR產(chǎn)物和pSKEGFP分別用NotI酶切，酶切后的pSKEGFP用堿性磷酸酯酶處理后與酶切后的PCR產(chǎn)物將酶切后的PCR產(chǎn)物與酶切后的pSKΔAhd載體按TaKaRa公司的DNALigationKitVer.2說明書建立連接反應(yīng)10μL連接體系中含5μLSolutionI，50ng質(zhì)粒，50ngPCR產(chǎn)物。連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DB3.1菌株(Invitrogen)，用M13-47和ccdBR引物進行菌落PCR，鑒定以正向插入(與lacZ讀碼框方向一致)的陽性克隆，得到pSK04。用于構(gòu)建上述前T載體(pSK01、02、03和04)的引物序列如下(左邊方框中的序列為酶切位點，中間陰影中的序列為AhdI酶切位點，右邊方框中的序列為來自ccdB或EGFP基因的序列)CcdB01FCcdB01RCcdB02FCcdB02RCcdB03FCcdB03REGFPFEGFPRCcdB04FCcdB04RM13-475’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’CcdBR5’-TCAGCCACTTCTTCCCCGATAACG-3’前T載體pSK01、pSK02、pSK03和pSK04中的AhdI盒的結(jié)構(gòu)如圖1A-圖1D所示，圖1A-圖1D中，兩邊方框中的序列為酶切位點，陰影中的序列分別為兩個AhdI酶切位點，中間方框中的部分代表ccdB基因序列，“^”表示酶切割的具體位點。圖1A中兩邊方框中的序列分別為SalI和XbaI酶切位點，圖1B中兩邊方框中的序列分別為SacI和KpnI酶切位點，圖1C中兩邊方框中的序列均為EcoRI酶切位點，圖1D中左方框中的序列包含SacI-EcoRI-SacII-NotI-EagI酶切位點，右方框中的序列包含EagI-NotI-SacII-EcoRI-KpnI酶切位點。圖1A-1C中兩邊方框中的酶切位點以及圖1D中左邊方框中的第一個酶切位點和右邊方框中的最后一個酶切位點分別對應(yīng)于pBlueScriptSK(-)質(zhì)粒上的酶切位點。實施例3、pSKxx-T系列T載體的制備及TA克隆效率分析1、制備T載體用AhdI分別酶切前T載體pSK01、02、03和04，酶切反應(yīng)體系如下20μL酶切體系中含3UAhdI內(nèi)切酶(購自NEB公司)，1×NEBuffer4，大約1μg質(zhì)粒。37℃酶切3小時后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后分別切膠回收大片段。切膠回收純化的大片段即是相應(yīng)的T載體。pSK01-T、pSK02-T、pSK03-T和pSK04-T的物理圖譜分別如圖2、圖3、圖4和圖5所示。2、測試TA克隆效率用TaqDNA聚合酶分別以NCEDF和NCEDR為引物PCR擴增擬南芥NCED3(1.8kb，GenBankAccessionNo.AT3G14440)和以DREBF和DREBR為引物PCR擴增DREB1A(680bp，GenBankAccessionNo.At4g25480)基因片段。引物序列如下NCEDF5’-AACGGATCCATGGCTTCTTTCACGGCAACGGC-3’NCEDR5’-AACGAGCTCTCACACGACCTGCTTCGCCAAATC-3’DREBF5’-AAGGATCCTTCTGATCAATGAACTCATTTTCTG-3’DREBR5’-AACACGTGGTTTTAATAACTCCATAACGATACG-3’PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。建立8個連接反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下10μL連接體系中含3U連接酶(Promega)，1×連接Buffer，大約50ng的T載體和大約92ng的NCED3或35ng的DREB1A，4℃連接16小時以上。連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，并進行藍白斑篩選。每個連接體系分別隨機挑選30個白斑進行菌落PCR鑒定，計算陽性克隆所占的百分比。結(jié)果表明，pSK01、02、03和04與DREB1A建立的連接反應(yīng)的TA克隆效率均為100％(30/30)；pSK01、02、03和04與NCED3建立的連接反應(yīng)的TA克隆效率分別為100％(30/30)、100％(30/30)、96％(29/30)和96％(29/30)。8個連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的藍斑數(shù)量與總菌落數(shù)的比值均低于5％。這些結(jié)果表明，本發(fā)明制備的T載體具有很高的TA克隆效率。序列表<160>4<210>1<211>343<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1tctagaggactttaggtcgatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgtta60tcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatagtgat120ccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggt180gcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctc240cgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccat300taacctgatgttctggggaatataggaccaaaagtccgtcgac343<210>2<211>343<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2gagctcggactttaggtcgatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgtta60tcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatagtgat120ccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggt180gcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctc240cgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccat300taacctgatgttctggggaatataggaccaaaagtccggtacc343<210>3<211>343<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3gaattcggactttaggtcgatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgtta60tcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatagtgat120ccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggt180gcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctc240cgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccat300taacctgatgttctggggaatataggaccaaaagtccgaattc343<210>4<211>373<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4gagctcgaattcccgcggccgcgactttaggtcgatgcagtttaaggtttacacctataa60aagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgg120gcgacggatagtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtga180actttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggc240cagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatga300catcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataggaccaaaagtcgcggccgcg360ggaattcggtacc37權(quán)利要求1.一種制備T載體的方法，包括以下步驟1)制備含有XcmI盒或AhdI盒的前T載體；所述XcmI盒包括間隔DNA序列、緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個XcmI酶切位點序列，所述AhdI盒包括所述間隔DNA序列、緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個AhdI酶切位點序列；2)用XcmI或XcmI的同裂酶，或AhdI或AhdI的同裂酶酶切步驟1)中的前T載體，得到T載體；其特征在于所述步驟1)中的間隔DNA序列為ccdB基因序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述XcmI盒還包括連接于所述各一個XcmI酶切位點序列的除XcmI酶切位點序列外的酶切位點序列；所述AhdI盒還包括連接于所述各一個AhdI酶切位點序列的除AhdI酶切位點序列外的酶切位點序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于用于制備所述前T載體的出發(fā)載體為環(huán)狀質(zhì)粒載體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述出發(fā)載體為pBlueScriptIISK或pUC18或pUC19或或pUC118或pUC119或pGEM系列，優(yōu)選為pBlueScriptIISK(-)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述出發(fā)載體為pBlueScriptIISK(-)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述pBlueScriptIISK(-)中的Amp抗性基因的AhdI酶切位點被沉默。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于在所述pBlueScriptIISK(-)中的多克隆位點引入所述AhdI盒。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于在所述多克隆位點的SalI酶切位點和XbaI酶切位點之間或KpnI酶切位點和SacI酶切位點之間或EcoRI酶切位點和EcoRI酶切位點之間或EagI酶切位點和EagI酶切位點之間引入所述AhdI盒。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述AhdI盒具有序列表中序列1、序列2、序列3或序列4的核苷酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述前T載體為pSK01或pSK02或pSK03或pSK04；所述T載體為pSK01-T或pSK02-T或pSK03-T或pSK04-T。全文摘要本發(fā)明公開了一種制備T載體的方法，其目的是提供一種制備具有較高TA克隆效率的T載體。本發(fā)明的制備T載體的方法，包括以下步驟1)制備含有XcmI盒或AhdI盒的前T載體；所述XcmI盒包括間隔DNA序列、緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個XcmI酶切位點序列，所述AhdI盒包括所述間隔DNA序列、緊密連接于所述間隔DNA序列兩側(cè)的各一個AhdI酶切位點序列；2)用XcmI或XcmI的同裂酶，或AhdI或AhdI的同裂酶酶切步驟1)中的前T載體，得到T載體；其中，所述步驟1)中的間隔DNA序列為ccdB基因序列。本發(fā)明的制備T載體的方法將在基因工程領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。文檔編號C12N15/66GK1590549SQ20041004790公開日2005年3月9日申請日期2004年6月10日優(yōu)先權(quán)日2004年6月10日發(fā)明者陳其軍,王學(xué)臣,周海夢申請人:清華大學(xué)