專利名稱：pH響應性聚合物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從液體分離至少一種目標化合物的方法，其中通過將所述目標化合物吸附到分離介質中并隨后從該介質中洗脫目標化合物進行分離。用于本發(fā)明方法的介質包括定位到它表面的pH響應性聚合物。本發(fā)明還包括pH響應性聚合物在分離介質制備中的用途。
背景在許多應用中，如在從污染物種中純化液體，和從溶液中分離所需化合物如蛋白質或另一種生物分子中，將目標化合物與溶液中的其它組分分離。隨著生物技術近來的發(fā)展和重組生產(chǎn)的產(chǎn)物用途的增加，更多地需要有效的純化方案。在許多情況下，要求所生產(chǎn)化合物的高純度以保證使用中的安全，而不管所生產(chǎn)化合物是生物分子還是一些其它有機或甚至無機化合物。
由于其多樣性和靈敏性，色譜通常是生物分子和醫(yī)療產(chǎn)品的優(yōu)選純化方法。術語色譜包括一類緊密相關的分離方法，它們都基于使兩個不相互混溶的相接觸的原理。更具體地，將目標化合物引入到流動相中，該流動相與固定相接觸，該固定相典型地是固體基質。然后當目標化合物由流動相攜帶通過系統(tǒng)時，它經(jīng)歷一系列在固定相和流動相之間的相互作用。這些相互作用利用樣品中組分的物理或化學性能的差異。這些相互作用可以根據(jù)一個或多個不同的原理，如電荷、疏水性、親合力等。
疏水性和相關相互作用用于從液體中分離目標化合物的各種應用，如過濾和色譜。在疏水性相互作用色譜(HIC)中，流動相典型地是含水的并且基質由偶合到親水性基質的疏水性基團組成，而在反相色譜(RPC)中，典型地使用有機流動相和極性較低，即更親水的基質。通常通過鹽或其它易溶劑的加入促進在介質和溶質表面之間的相互作用。因此，HIC典型地涉及比RPC更不疏水和更含水的環(huán)境，并且在許多應用中，HIC更適于較大MW蛋白質和其它易脆性物質。然而，在一些應用中，在RPC和HIC基質之間沒有清楚的界線，但在流動相選擇中存在。因此，在這樣的情況下，用于HIC的介質對于RPC也起作用，且反之亦然。
在目標分子和固定相之間的HIC相互作用主要由流動相水合目標分子的能力控制，如由鹽和其它添加劑影響，偶合到穩(wěn)定目標和介質之間相互作用的疏水性相互作用。其它相互作用，如范德華相互作用、電荷-電荷相互作用等可在關于蛋白質截留、結構穩(wěn)定和與不同目標分子的拆分中起次要但顯著的作用。典型地目標分子對HIC介質的吸附在較高的流動相鹽濃度下進行，而洗脫在較低的鹽濃度下進行。鹽梯度通常用于提高在幾種溶質中的選擇性。當運行這樣的梯度時，最疏水的化合物理想地最后洗脫。在蛋白質的情況下，尚未完全理解在蛋白質疏水性和HIC洗脫之間的關系。高度帶電和可溶蛋白質具有疏水性表面區(qū)域，可在HIC中較后洗脫。在蛋白質純化中，由于HIC是其它色譜方法，如凝膠過濾、親合力色譜和離子交換色譜的補充，所以對其興趣日益增長。更具體地，HIC成功地在如下兩個階段使用下游加工的初始階段，如在鹽沉淀之后和在離子交換之前，和后繼階段，如除去在先前加工期間已經(jīng)變性的目標蛋白質。然而，在某些情況下它可能仍然存在缺點。
HIC的一個最顯著缺點在于一些目標蛋白質可在加工期間變性，這也適用于RPC。例如，HIC要求的高鹽濃度緩沖劑可能對敏感性目標化合物，如蛋白質是有害的，在該情況下可促進變性。離液序列高的或蛋白質穩(wěn)定添加劑可用于減輕此缺點，然而它要求脫除它們的另外下游步驟，因此增加工藝的總成本。蛋白質變性也可以由與介質的疏水性相互作用引起和由隨后在洗脫條件下從介質中脫除引起。涉及的機理目前還不清楚，但最簡單地涉及如下事實蛋白質改變構象以適應在流動相和介質之間的界面自由能差異，以及通過與表面基團的疏水性或其它相互作用增強它自身界面自由能的降低。這種變性的問題在于當?shù)鞍踪|從介質洗脫時，它保留此新的構象。
給定以上內容，在色譜和其它分離表面的開發(fā)中存在極大的興趣，該分離表面根據(jù)它們的疏水性在顯示較少變性蛋白質的條件下在蛋白質和其它分子中區(qū)分。
作為包括不帶電疏水性配體的傳統(tǒng)HIC介質的替代選擇，Boschetti等人(Genetic Engineering，vol.20，No.13，7月，2000)提出的方法指出疏水性電荷感應色譜(CIC)用于敏感性生物大分子特別是抗體的分離。市售產(chǎn)品BioSepra MEP HyperCel(LifeTechnologies，Inc.)基于此類相互作用并且包括4-巰基乙基吡啶作為配體。理論上，配體在中性pH下是不帶電的并且通過中等疏水性相互作用結合分子。當pH降低時，配體帶正電荷并且認為疏水性結合由配體電荷基團和蛋白質之間的靜電排斥抗衡。然而，采用該方法可預見到幾個問題。首先，它要求合適pI的目標蛋白質在洗脫pH下是凈正電的。其次，蛋白質在洗脫pH下需要具有顯著的凈正電荷。第三，存在的危險是由于使用的吡啶基團接近7中性pKa，它促進其它穩(wěn)定化相互作用，如π-鍵重疊、螯合、離子交換、陽離子-π，它們會危害它的作用。
作為通常使用的小配體的替代選擇，已經(jīng)提出更大的分子，且更具體而言聚合物作為分離應用中的固定相。
例如，WO 02/30564(Amersham Pharmacia K.K.)公開了用于親合色譜的刺激響應性聚合物。更具體地，這種刺激響應性聚合物，也稱為″智能或響應性聚合物″，當曝露于適當?shù)拇碳r經(jīng)歷它們物化性能的結構和可逆變化。此變化可以是顯著疏水性，如由它們在溶液中的自締合所示，到顯著親水性，即水合的轉化，或反之亦然。最通常和所研究的刺激是溫度變化，而在WO 02/30564中提出的替代刺激是光、磁場、電場和振動。盡管可以帶有一定技術難度地在涉及小總面積的涂覆表面的應用，如用于分析色譜的微柱中使用這后四種刺激，但是難以看到它們可如何成功地用于涉及更大柱和表面的應用。促進目標從分離介質中洗脫所要求的溫度的仔細控制也要求介質周圍的恒定條件，并因此對使用的設備有更高的需求。提出的替代刺激的使用涉及相似的缺點。令人感興趣的是，在WO02/30564中提及通過改變洗脫劑如鹽的組成、無機溶劑、pH等而洗脫可能是不需要的，因為這可能由于加入的化學物質，如鹽、有機溶劑、酸和堿而引起諸如失活、回收率降低等問題。
親合色譜的另一個例子公開于US 5,998,588(華盛頓大學)，它涉及相互作用性分子綴合物，和更具體地涉及可用于調制或″接通或切斷″分子間的親合力或識別相互作用，如受體-配體相互作用和酶-底物相互作用的材料。因此，公開的綴合物是刺激響應性聚合物組分和相互作用性分子的組合。聚合物可以由pH、光或其它刺激的變化調節(jié)。刺激響應性組分在特定的部位偶合到相互作用性分子上以允許其調制，以在相鄰的配體結合部位，例如抗體的抗原-結合部位或酶的活化部位改變配體結合。
聚合物涂料作為固定相的另一個例子發(fā)現(xiàn)于EP 1 081 492(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)，其中公開了由帶電共聚物組成的色譜填料。更具體地，公開的填料具有離子交換功能，可以例如通過共聚聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)與帶正電二甲氨基丙基丙烯酰胺(DMAPAAm)而制備。獲得的填料可用于反相色譜和離子交換色譜兩者。通過改變溫度而改變在固定相表面上親水性/疏水性平衡獲得吸附到這些填料上的物質的洗脫。然而，如上所述，溫度控制涉及某些缺點。例如，溫度的控制典型地要求特殊的設備，如加熱器、浴、溫度計、對于甚至小塔的塔夾套和泵。當這種方法應用于更大的塔時，由于會出現(xiàn)包括在塔夾套之間的流體密封泄漏和相對于塔的長軸及直徑的不均勻溫度分布的相關問題，更加涉及這種設備。在更大的塔中，溫度梯度可導致與凝膠床上傳質和性能相關的混合流和物理性能如粘度的差異。
EP 0 851 768(華盛頓西雅圖大學)建議使用刺激響應性聚合物和相互作用性分子以形成用于測定、親合分離、加工等的部位特異性綴合物。聚合物可以通過pH、溫度、光或其它刺激的變化調節(jié)。相互作用性分子可以是生物分子，如肽、蛋白質、抗體、受體或酶。刺激響應性化合物在特定部位偶合到相互作用性分子上，使得可以調節(jié)刺激響應性組分以在相鄰的結合部位改變配體結合。如上所示，偶合借助親合基團，并且所提供的材料可因此″接通或切斷″親合識別相互作用。更具體地，聚合物對目標化合物親合部位的物理關系由上述改變控制。此外，公開了配體或其它親合物質，采用需要的方式通過將響應性聚合物接枝到這些物質上而改進其基本相互作用。
Tuncel等人(Ali Tuncel，Ender Unsal，Hüseyin Cicek用于DNA吸附的pH敏感性均勻凝膠珠，Journal of Applied PolymerScience，Vol.77，3154-3161，2000)描述了由胺官能化單體N-3-(二甲氨基)丙基甲基丙烯酰胺(DMAPM)的懸浮聚合制造均勻凝膠珠。公開的交聯(lián)凝膠珠顯示pH敏感性，可逆溶脹和去溶脹行為，并建議用于DNA吸附。然而，公開的珠的應用領域受其剛性限制，該剛性對于某些應用，如藥物輸送是足夠的，而對于要求更高流速的應用是較不令人滿意的。例如，通過填充色譜床的液體流動將不可避免地使這些珠倒塌，并因此損害它們的吸附性能。
最后，WO 96/00735(Massey大學)公開了用于純化目標蛋白質或肽的色譜樹脂。更具體地，公開了樹脂-目標絡合物，其中樹脂包括選擇的可離子化配體共價連接到其上的載體基質。配體使樹脂在肽被吸附到樹脂上的pH下是不帶靜電荷的而在肽被解吸的pH下是帶靜電荷的。對不帶電樹脂的吸附由疏水性相互作用獲得，而解吸由電荷排斥獲得。配體可包括胺基團、羧基、組氨酸基、吡啶基、苯胺基團、嗎啉代基團或咪唑基。此外，配體可以通過間隔臂連接到載體上，該間隔臂對于本發(fā)明不是關鍵的，并可以例如衍生自β-丙氨酸、氨基丁酸、氨基己酸等。如果存在間隔物的話，由于其不包含任何可離子化基團，所以它們不能對公開的樹脂的解吸性能有貢獻。因此，在WO 96/00735中公開的配體都是較小的分子，其中每個配體通常表示一個官能團。所以，此樹脂的配體相當不同于以上討論的刺激響應性聚合物。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一個目的是提供與常規(guī)HIC介質相比，具有改進的選擇性和/或分辨率的疏水性相互作用(HIC)分離介質。具體的目的是提供具有這種改進選擇性和/或分辯率同時回收率至少與常規(guī)HIC介質一樣好的這種介質。
本發(fā)明的另一個目的是提供從液體識別或分離至少一種目標化合物的方法，其中通常用于疏水性相互作用色譜(HIC)的相互作用用于將目標化合物吸附到介質，該介質的相對疏水性可以通過流動相pH和/或鹽濃度改變。在此情況下，由涉及通常用作HIC介質的烷烴或苯基配體基表面涂料的蛋白質吸附判斷疏水性。
具體的目的是提供這樣的方法，其中pH控制用于改變相對相互作用，不僅僅用于在引起配體帶電或不帶電的基礎上促進或降低吸附。因此，使用本發(fā)明用于分離的目的，操作者具有另一個變量，即pH，它可用于調節(jié)方法的分辨率。
本發(fā)明的另一個目的是提供色譜方法，該方法與現(xiàn)有技術方法相比在吸附和洗脫條件下在目標化合物的天然結構和活性方面更可能保存整體性。具體的目的是提供用于大分子如蛋白質分離的這種方法。這可根據(jù)本發(fā)明由從液體識別或分離至少一種目標化合物的方法達到，其中疏水性相互作用用于將目標化合物吸附到介質。更具體地，該介質由具有柔性聚合物表面涂層的基質組成，它在吸附和洗脫工藝期間改變相對于目標化合物的構象。這樣的改變受pH以及先前用于HIC的其它刺激，如鹽濃度影響。因此，本方法使得操作者更能控制操作變量，該變量影響非變性或另外改變的目標材料的回收率。
本發(fā)明的具體目的是提供色譜方法，其中疏水性相互作用是用于將目標化合物吸附到介質的主要相互作用，該介質相對于目標化合物的表面疏水性可以例如由pH變化而改變。在此情況下，pH變化不依賴于流動相鹽濃度的顯著變化或流動相改進劑，如改進極性的有機溶劑或聚合物添加劑的使用。本方法可以在流動相關于例如鹽濃度、有機溶劑和聚合物流動相改進劑等的寬范圍內應用。
本發(fā)明的具體目的是提供以上討論的HIC方法，該方法與現(xiàn)有技術相比擴展可能的操作條件同時降低操作成本，并提供與現(xiàn)有技術HIC方法相比對操作設備具有更少負面影響的方法。
本發(fā)明另外的目的是提供色譜方法，其中疏水性相互作用用于將目標化合物吸附到介質，該方法允許在HIC通常采用的中性pH范圍內對具有低極限溶解度的蛋白質和多肽使用HIC。這通過下述方法達到，其中疏水性相互作用涉及在基質表面定位的聚合物的構象以及涉及與pH有關的蛋白質-聚合物相互作用。
本發(fā)明另外的目的是提供色譜方法，其中將蛋白質采用與傳統(tǒng)HIC介質相同的順序洗脫，但其中選擇的蛋白質與介質的相對相互作用，即與其它蛋白質有關的其峰洗脫位置由pH的變化改進。因此，本方法可改進從HIC方法得到的分辨率。
本發(fā)明的另一個目的是提供色譜方法，其中使用生產(chǎn)友好的色譜材料。這可以通過使用顯示表面定位聚合物的基質，而不是特殊的疏水性配體，如通常使用的烷烴或苯基而達到。后者通常需要與使用親水性涂料以改進天然表面親水性有關的生產(chǎn)成本，與配體連接到其上的約束基團有關的生產(chǎn)成本等，它們可以由本方法的使用避免。
本發(fā)明最后的目的是減小影響各種目標化合物如蛋白質的所需分離所需要的介質的范圍。這可以根據(jù)本發(fā)明由分離介質的使用達到，該分離介質的固有表面疏水性可以由pH控制而改變。由于傳統(tǒng)HIC介質的疏水性的固有范圍通常在多于一個表面密度下由帶有不同烷烴基團的介質范圍提供，所以如果降低關于每個應用必須生產(chǎn)和測試的介質范圍，則對于生產(chǎn)者和使用者兩方面均是有利的。
從以下詳細描述顯現(xiàn)本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點。
附圖簡述

圖1顯示涉及四種蛋白質和幾種商業(yè)介質的混合物的典型pH 7鹽梯度疏水性相互作用色譜(HIC)。
圖2顯示如圖1的色譜，但展示幾種其它商業(yè)介質。
圖3a和b分別顯示圖1在pH7和4的色譜，但證明在從pH7到4時pH對商業(yè)介質HIC缺乏有用作用。
圖4a和b說明用于根據(jù)本發(fā)明方法的pH響應性HIC(pHIC)聚合物涂料的典型結構。
圖5顯示在pH4下使用相似于圖1和2的方法獲得的典型鹽梯度HIC結果，但各種pHIC聚合物涂料的組分摩爾比改變。
圖6說明當pH從pH7變化到4時，典型的pHIC聚合物涂覆介質的結果，顯示與常規(guī)HIC介質相比在pH7下改進的分辨率和該分辨率的提高，以及當改變pH時不尋常的選擇性控制。
圖7顯示如圖6的色譜，但色譜涉及單個蛋白質，以顯示與圖3相比提高的分辨率。
圖8支持圖6和7中結果的再現(xiàn)性。
定義術語″表面定位的″表示分子或其它物質在靠近表面的定位。這可以由任何常規(guī)的相互作用，如吸附、共價鍵合等達到。
術語″表面″表示外部，和在多孔材料的情況下基質的內部或孔表面。
術語″基質″在此用于任何一種常規(guī)種類的固體載體，該載體用于識別和分離領域，如用于色譜和過濾。
″分離介質″由以上定義的基質組成，鍵合基團如配體或聚合物連接到該基質上。
術語″疏水性″在此以色譜領域中通常使用的意義使用。在此領域中存在許多公知的定義術語″疏水性″的常用方法，如按照溶解度。
術語″解吸″和″釋放″在此可互換使用。
發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明涉及從液體分離至少一種目標化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)在第一pH下使液體與顯示表面定位pH響應性聚合物的分離介質接觸以吸附目標化合物；和(b)加入第二pH值的洗脫劑，它提供所述pH響應性聚合物的構象變化，以從分離介質釋放所述化合物。
在本方法的一個實施方案中，第二pH值低于第一pH值。在最有利的實施方案中，洗脫劑包括降低pH梯度。由于吸附的強度依賴于聚合物和目標化合物之間的相互作用，所以不同的目標化合物可以從介質由pH梯度，如逐步或線性pH梯度有差別地洗脫。因此，在有利的實施方案中，步驟(b)是至少兩種目標化合物的差別洗脫。在本方法中，每種目標化合物可以洗脫為純或基本純的級分。通常使用的添加劑，如醇、洗滌劑、離液序列高的鹽等可用于洗脫緩沖劑以影響步驟(b)中解吸期間的選擇性，但應當仔細以便不因曝露于高濃度的這種添加劑而使目標化合物變性或失活。
梯度洗脫是色譜領域中的公知技術，并且本領域技術人員可容易地使用常規(guī)酸/堿體系決定合適的梯度。
因此，在此實施方案中，聚合物的物理狀態(tài)由pH變化而改變。依賴于聚合物的性質，其自締合傾向，以及與其疏水性有關的表面對材料更具吸附性的傾向，可以由pH的變化增加或降低。在圖5-8所示的實施例中，當pH降低時它增加。結果是，蛋白質通常從表面洗脫的鹽濃度變得更低，這與當傳統(tǒng)HIC介質表面變得更為疏水性時看到的機理相同，如圖1和2所示。
顯然相反的應當是真實的，即當有利于較少吸附而改變pH時，在介質和蛋白質或其它吸附劑之間存在較不強的相互作用。在此上下文中，應理解的是，由于與pH有關，聚合物的構象傾向影響在吸附和解吸中的pH控制。然而，如本領域技術人員認識到的那樣，在本方法中，目標化合物也可很少程度地經(jīng)歷構象變化，盡管如圖3所示不以足以促進它從基質表面釋放的方式。因此，這種情況也包括在本發(fā)明的范圍內。因此，在本方法中化合物的吸附和釋放主要和優(yōu)選顯著地由pH響應性聚合物的構象變化促進。
如上所述本方法可用于由其吸附分離目標化合物。因此，在本方法的一個實施方案中，吸附的化合物是目標化合物。在另外的實施方案中，本發(fā)明用于從液體中通過其吸附除去不需要的化合物同時允許目標化合物通過。在具體的實施方案中，以上討論的吸附實際上是對能夠令人滿意地分離和/或識別目標化合物的阻滯。
在本方法的另外實施方案中，洗脫劑的電導率不同于步驟(a)的液體的電導率，而第二pH值保持等于或至少基本等于第一pH值。在用于蛋白質分離的最有利實施方案中，洗脫在中性或堿性pH下進行。電導率的變化通常由合適鹽，如通常用于疏水性相互作用色譜的任何一種的加入提供。在有利的實施方案中，洗脫劑包括鹽梯度。由于吸附的強度依賴于聚合物和目標化合物之間的相互作用，不同的目標化合物可以從介質由鹽梯度，如逐步或線性鹽梯度有差別地洗脫。在有利的實施方案中，步驟(b)是至少兩種目標化合物的差別洗脫。在本方法中，每種目標化合物可以洗脫為純或基本純的級分。通常使用的添加劑，如醇、洗滌劑、離液序列高的鹽等可用于洗脫緩沖劑以影響步驟(b)中解吸期間的選擇性，但應當仔細以便不因曝露于高濃度的這種添加劑而使目標化合物變性或失活。梯度洗脫是色譜領域中的公知方法，并且本領域技術人員可容易地決定合適的梯度。
在具體的實施方案中，結合以上討論的pH和鹽梯度洗脫并且兩個原理均用于吸附化合物的洗脫。
總之，在本方法的步驟(a)中，依賴于pH響應性聚合物的性質，本領域技術人員可容易地改變吸附的條件。例如，如公知的那樣，更高的表面張力為將蛋白質吸附到疏水性表面上提供疏溶劑的更優(yōu)選環(huán)境。因此，具有更大摩爾表面張力的鹽的使用會導致諸如蛋白的目標化合物在介質中的保留增加。在HIC中最通常使用的鹽是硫酸銨，然后它不能用于非常堿性的環(huán)境。其它有用的鹽是例如谷氨酸單鈉、胍、硫酸鈉和天冬氨酸鈉，它們有利地以約9.5的pH使用。本方法最有利地在室溫下進行。
在一個實施方案中，目標化合物的吸附由pH響應性聚合物和目標化合物之間的疏水性相互作用提供。因此，形成本施方案基礎的原理在此有時稱為″pH響應性HIC(pHIC)″。在具體的實施方案中，目標化合物的吸附通過由相關種類相互作用補充的疏水性相互作用提供。這種相關相互作用合適地選自電荷-電荷相互作用、范德華相互作用和基于共溶解/共水合的相互作用。在涉及某些情況，例如在某些pH和鹽濃度下的特殊蛋白質的另外實施方案中，相關種類的相互作用占優(yōu)勢。然而，通常，這種其它相互作用與疏水性相互作用相比是次要的。
更具體地，在使用鹽梯度協(xié)助的疏水性相互作用的實施方案中，目標化合物如蛋白質將在步驟(a)中與表面的疏水性、目標化合物的疏水性和洗脫劑的性質相關地被吸附。因此，相互作用主要是疏水性的，因為它們模擬對傳統(tǒng)HIC介質而言常見的相互作用類型，傳統(tǒng)HIC介質通常包括例如由烷烴或芳族疏水性配體涂覆的載體或基質。
因此，其中使用pH響應性聚合物的基于疏水性相互作用色譜(HIC)的本發(fā)明不同于由Boschetti等人建議的以上討論的電荷感應色譜(CIC)，其中(1)涉及的配體是低分子量分子，不是如在本發(fā)明中的聚合物，(2)改變流動相pH以引起配體當結合時是中性的或當不結合時是陽離子的，(3)提供響應pH變化的配體變化構象的不是由Boschetti等人建議的，(4)可感應電荷基團偶合到疏水性配體上使得它實際上表示傳統(tǒng)HIC配體的改進。通過本發(fā)明將避免可以采用CIC方法預見到的一些問題，如由如下因素引起的問題(i)蛋白質電荷基團對于帶電形式的CIC配體的親合力，(ii)電荷-電荷相互作用被與一些HIC緩沖劑有關的較高鹽濃度屏蔽以及(iii)配體密度和介質性能之間的關系。
在本方法的一個實施方案中，改變所述pH響應性聚合物的構象變化到由pH降低引起的較不疏水的構象。在另一個實施方案中，聚合物的構象變化基于聚合物自締合和/或與基質的締合。
本領域技術人員可生產(chǎn)合適的pH響應性聚合物，當pH降低或升高時它會通過在水溶液或其它溶液中較多到較少的疏水性構象。這通常伴隨著自締合，當聚合物在溶液中游離時由它們從溶液出來檢測到自締合。對于在水溶液體系中的溫度響應性聚合物，存在下臨界溶液溫度(LCST)或上臨界溶液溫度(UCST)。pH響應性聚合物的LCST隨pH變化，并且也可以受其它因素，例如離子的離子強度和類型或溶液中其它添加劑的影響。當這種聚合物連接到表面時，它們仍然可顯示這樣的構象改變使得表面相對疏水性像聚合物的那樣變化。因此表面締合聚合物可自締合并響應pH改變構象。
顯示pH響應性聚合物的基質可以是允許pH響應性聚合物偶合的任何有機或無機多孔材料，只要它不顯示可干擾分離工藝的任何電荷。因此，在一個實施方案中，基質由親水性碳水化合物，如交聯(lián)的瓊脂糖組成。在將在以下的試驗部分詳細描述的此情況下，首先將基質材料烯丙基化，優(yōu)選在堿如NaOH存在下，根據(jù)公知方法到合適的程度，并隨后將它胺化以允許聚合物的隨后偶合。在另外的實施方案中，將基質首先烯丙基化并隨后通過將單體接枝到表面上而提供pH響應性聚合物涂層。在此實施方案中，單體直接共聚到表面上。對單體進行選擇能夠制備所需響應性的聚合物。例如，本領域技術人員可容易地使用標準方法制備所需LCST的聚合物涂料。在具體的實施方案中，pH響應性聚合物可以與溫度響應性聚合物結合以提供具體的特性。在進一步的實施方案中，基質自身由接枝技術制備。
在另外的實施方案中，基質是二氧化硅或合成共聚物材料。如要求，將基質如上所述烯丙基化，并隨后胺化。在色譜的上下文中，由于這種基團可另外導致化合物的分離降低，所以最優(yōu)選在使用之前將基質的任何剩余胺基團烷基化。
用于本方法的pH響應性聚合物可以是對pH敏感的任何物質，其中周圍pH的變化引起聚合物線團中的顯著構象變化。對于此類聚合物的一般性綜述，參見例如Chen，G.H.和A.S.Hoffman，″可能用于蛋白質綴合的新溫度響應性和pH響應性共聚物(A new temperature-and pH-responsive copolymer for possible use in proteinconjugation)″，Macromol.Chem.Phys.，196，1251-1259(1995)。在具體的實施方案中，本pH響應性聚合物在pH2-13，如2-12，3-12，4-7或7-10的范圍內是pH響應性的。
簡言之，在此使用的合成pH響應性聚合物典型地基于pH敏感性乙烯基單體，如丙烯酸(AAc)、甲基丙烯酸(MAAc)、馬來酸酐(MAnh)、馬來酸(MAc)、AMPS(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸)、N-乙烯基甲酰胺(NVA)、N-乙烯基乙酰胺(NVA)(最后兩者可以在聚合之后水解成聚乙烯基胺)、甲基丙烯酸氨基乙酯(AEMA)、磷?；一┧狨?PEA)或甲基丙烯酸酯(PEMA)。這樣的pH敏感性聚合物也可以從氨基酸合成為多肽(如聚賴氨酸或聚谷氨酸)或衍生自天然聚合物如蛋白質(如溶菌酶、白蛋白、酪蛋白等)、或多糖(如藻酸、透明質酸、角叉菜膠、殼聚糖、羧甲基纖維素等)或核酸，如DNA。
在一個實施方案中，pH響應性聚合物是共聚單體。在另一個實施方案中，每種pH響應性聚合物由疏水性部分、親水性部分和pH響應性部分組成。pH響應性部分優(yōu)選包括胺，如伯胺、仲胺或叔胺，和/或丙烯酸，它們在某些pKa值下質子化。
在具體的實施方案中，所述pH響應性聚合物包括選自如下基團的pH響應性基團-COOH基團、-OPO(OH)2基團、-SO3-基團、-SO2NH2基團、-RNH2基團、-R2NH基團、和-R3N基團，其中R是C。
在具體的實施方案中，可以設計本pH響應性聚合物以包含一個或多個官能團，它們提供或執(zhí)行聚合物的疏水性特征。本方法中的最優(yōu)選官能團是諸如發(fā)現(xiàn)于不飽和體系，例如發(fā)現(xiàn)于烯烴或芳族體系中的碳碳雙鍵(C＝C)。
用于本方法的pH響應性表面可以由本領域技術人員使用合成有機聚合物化學設計為官能團的單層或多層。通常，在此使用的本pH響應性聚合物可以根據(jù)標準方法合成到約1,000-約250,000道爾頓，如約2,000-約30,000道爾頓的分子量。如技術人員理解的那樣，下限由諸如表面覆蓋和它們如何可以是疏水性的因素確定，而上限由諸如聚合物/擴散效應的因素確定。
如上所示，一種說明性類型的pH響應性聚合物可以從具有一個氨基和一個羧基的氨基酸制備并偶合到多糖基質。此單體容易由自由基聚合而聚合以得到在pH4-8區(qū)域中具有恒定溶脹和在酸性和堿性區(qū)域中具有增加溶脹的基質。偶合聚合物到基質表面的另一種方式是通過表面接枝方法，其中首先合成明確尺寸的pH響應性聚合物并隨后接枝到載體上。生產(chǎn)可逆pH響應性表面的另一種已知方法是″包埋官能化″，它產(chǎn)生復雜的標記聚乙烯低聚物。然后這些低聚物可以與沒有添加劑的HDPE混合。聚合物和官能化低聚物的共溶解產(chǎn)生均相溶液，該溶液可用于生產(chǎn)官能化PE-膜。
在另外的實施方案中，本方法采用諸如下列聚合物聚(N-丙烯?；?N′-丙基哌嗪)(PAcrNPP)、聚(N-丙烯?；?N′-甲基哌嗪)(PAcrNMP)和聚(N-丙烯?；?N′-乙基哌嗪)(PAcrNEP)，它們是對pH和溫度兩者均敏感的水凝膠。N，N-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯[DMEEMA]類聚合物是另一組溫度和pH響應性水凝膠。
在本方法的一個實施方案中，至少一種目標化合物是生物分子，如蛋白質或肽。在此上下文中特別合適的蛋白質的一些具體例子是抗原、纖維素酶、糖蛋白、激素、免疫球蛋白、脂酶、膜蛋白質、核蛋白質、胎盤蛋白質、核糖體蛋白質和血清蛋白質。目標化合物可以在任何液體，通常水溶液中存在，條件是它與吸附工藝相容并且它不以任何方式對pH響應性聚合物或目標化合物有害。在一個實施方案中，液體是發(fā)酵液而目標化合物是其中產(chǎn)生的蛋白質或肽。依賴于pH響應性聚合物的性質，這種發(fā)酵液可以是稀釋或未稀釋的，如粗提取物。
在目前最好的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法是色譜方法。這種色譜可以是制備性的，可以是任何規(guī)模，直到大生產(chǎn)規(guī)模，或分析規(guī)模。因此，在具體的實施方案中，本方法是分析方法。在說明性實施方案中，分離基質是微量滴定板、生物傳感器、生物芯片等。在另外的實施方案中，本發(fā)明用于細胞培養(yǎng)。本方法同樣用于小和大規(guī)模設備。
在另外的實施方案中，本方法是過濾方法。在此情況下，基質可以是任何公知的材料，根據(jù)標準方法以上討論的pH響應性聚合物偶合到該材料上。過濾的一般性原理是技術人員公知的。
在另一方面，本發(fā)明涉及以上定義的pH響應性聚合物在色譜介質制備中的用途。因此，本發(fā)明也包括將合適的共聚物接枝到基質如瓊脂糖上的方法，其中設計共聚物的性能使其在需要的狀況下是pH響應性的。
最后，本發(fā)明也包括pH響應性聚合物通過改變pH以增加或降低表面吸附的用途。一般現(xiàn)象是在溶液中或在表面上的聚合物可以與溶液中或在該表面上定位的蛋白質或其它分子，如大分子或膠體相互作用。這種相互作用可導致聚合物-蛋白質相互作用，如涂覆表面-蛋白質相互作用并且非常依賴于聚合物和其它材料的化學基團。因此希望它們與一系列化學相互作用，例如共水合、疏水性、范德華和氫鍵相互作用有關，并反映其它材料的獨特補充。相互作用可用于差別地控制表面與材料的相互作用。注意這樣的相互作用可促進和穩(wěn)定聚合物的自締合傾向。
更具體地，顯示表面定位pH響應性聚合物的分離基質的本用途從液體的其它組分中分離出一種或多種目標化合物。在最有利的實施方案中，該pH響應性聚合物包括選自如下基團的側掛pH敏感性基團-COOH基團、-OPO(OH)2基團、-SO3-基團、-SO2NH2基團、-RNH2基團、-R2NH基團、和-R3N基團，其中R是C。在具體的實施方案中，該聚合物原位聚合到基質表面上。
因此，本發(fā)明包括下述方法，其中顯示表面定位pH響應性聚合物的分離介質用于從液體的其它組分中分離生物分子。如以上討論的那樣，這種分離可以是色譜方法或過濾方法。本用途是對常規(guī)疏水性相互作用色譜(HIC)或反相色譜(RPC)的有利替代選擇。關于pH響應性聚合物的進一步細節(jié)可以如以上涉及本發(fā)明方法的討論那樣。
最后，本發(fā)明也涉及疏水性相互作用色譜(HIC)介質，該介質由表面定位pH響應性聚合物連接到其上的基質組成，該聚合物顯示HIC配體。在具體的實施方案中，聚合物的pH響應性基團選自-COOH基團、-OPO(OH)2基團、-SO3-基團、SO2NH2基團、-CNH2基團、-C2NH基團、和-C3N基團。關于本介質及其用途的進一步細節(jié)可以如以上涉及本發(fā)明方法所述。
此外，本發(fā)明也包括一種用于分離目標化合物的試劑盒，該試劑盒包括在單獨的隔室中由介質填充的色譜柱，該介質由表面定位pH響應性聚合物連接到其上的基質組成，該聚合物顯示HIC配體；具有第一pH的吸附緩沖劑；具有第二pH的洗脫劑，第二pH低于所述第一pH；及其使用的書面說明書。該說明書可包括如何實施本發(fā)明方法的說明。
附圖詳述圖1顯示涉及各種常規(guī)HIC介質的色譜，從頂部到底部為醚650STM，醚5PWTM，苯基650STM和苯基5PWTM(Tosoh)和苯基HP瓊脂糖TM(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)。介質由它們的配體(苯基或醚基團)指示。在此實施例中，將四種蛋白質(肌紅蛋白、核糖核酸酶A、α-乳清蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A，它們的一些性能在試驗部分列表)加入到0.1M磷酸鈉pH7的緩沖劑中，該緩沖劑包含2M(NH4)2SO4，然后它以梯度運行到0.1M磷酸鈉和0M(NH4)2SO4。采用單一蛋白質的試驗表明它們采用以上給出的典型的″傳統(tǒng)″HIC順序洗脫。似乎(a)蛋白質在柱-峰上均以相同順序洗脫，分辯率變化但相對位置不變，(b)一些介質在四種蛋白質的拆分峰下比其它更好，(c)介質顯現(xiàn)為在不同鹽濃度下洗脫不同的蛋白質，例如當從醚變化到苯基配體涂覆的介質時，頂部到底部肌紅蛋白峰顯現(xiàn)在2M(NH4)2SO4下和然后在大約1M下洗脫。這表明，在保持苯基與乙基的疏水性一致時，苯基涂覆介質具有更強的蛋白質相互作用。
圖2顯示使用相同的蛋白質和條件如圖1進行的″傳統(tǒng)″梯度HIC的色譜，各種瓊脂糖TM介質(都來自Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)從底部向上為1.苯基瓊脂糖TM6FF(低sub)；2.苯基瓊脂糖TM6FF(高sub)；3.丁基瓊脂糖TM6FF；和辛基瓊脂糖TM6FF，其中″sub″表示相對配體密度，它隨介質疏水性增加。市售介質由它們的配體和配體密度表示。單個蛋白質試驗(未顯示)表明四種蛋白質以圖1所示的順序洗脫但(a)蛋白質僅拆分成兩個峰(肌紅蛋白和核糖核酸酶，隨后為α-乳清蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A)，(b)當從在低密度到更高密度的帶有苯基的介質中走過時，峰在較低鹽濃度下洗脫(表明與更疏水性介質表面的更強相互作用)和(c)介質疏水性不僅由配體疏水性也由密度決定。因此，具有最疏水性配體但最低配體密度的辛基介質(8umol/ml凝膠，參見Amersham Biosciences目錄)與蛋白質峰締合，它在丁基(50umol/ml)或苯基低sub(20umol/ml)或高sub(40umol/ml)介質之前洗脫。注意圖1中的苯基-HP介質的配體密度為25u摩爾/ml凝膠。
圖3a顯示相似的pH7梯度HIC研究，該研究涉及與圖1和2中四種蛋白質相同的混合物。各曲線從頂部到底部為rb，myo，a-lac，a-ch和混合物。也單獨顯示了單個蛋白質樣品試驗的結果。圖3b顯示在pH4下的相同蛋白質。注意(a)蛋白質混合物結果在兩個pH下看起來相似，(b)也僅拆分了兩個峰，(c)當從pH7到4時肌紅蛋白和α-乳清蛋白傾向于保留在柱上(例如甚至在更低鹽濃度下顯示更強的相互作用)。
圖4a顯示了研制用于在酸性pH范圍(如4-7)內具有pH HIC(pHIC)響應性的響應性聚合物涂料的通式PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA。它由如下基團組成帶有一些電荷以及疏水性特征的自締合基團″m″，加入以控制pH響應性的基團″n″-在此情況下為用于酸性pH響應性的酸基團，和用于改進HIC(自締合)官能度的另一種″o″。如圖中所示可以改變許多變量以對于任何特定的應用優(yōu)化聚合物，并且除其中直接展示的那些以外許多其它的應用是可能的。一些更顯然的變化是改變基礎基質，改變三種官能團m、n和o的摩爾比，改變基團的類型(例如使n為吡啶基團和o為苯基，利用四種官能團以由兩個可彼此緩沖的基團替代基團n)，改變基團的相對排列。圖4b顯示設計在堿性pH范圍起作用的不同類型的pH響應性聚合物。圖5顯示采用以上圖中所實施的四種蛋白質混合物涉及的″傳統(tǒng)″梯度HIC的色譜，但在pH4下的除外，使用通過用圖4a中的聚合物接枝瓊脂糖TM介質制備的介質(UB878029，U8780321-3)。顯示了采用顯示三種聚合物組分的四個不同摩爾比的介質的結果。注意(a)可以控制摩爾比，(b)色譜行為傾向于隨摩爾比變化并可因此被控制，(c)具有相似摩爾比的聚合物得到相似的HIC色譜。
圖6顯示涉及采用如以上圖中實施的四種蛋白質混合物的″傳統(tǒng)″梯度HIC的色譜，區(qū)別在于根據(jù)本發(fā)明的一個方面在吸附和洗脫兩個步驟中pH從4變化到7，使用一種圖4a中用聚合物涂覆的pH敏感性HIC(pHIC)原型介質(U8780323)。注意(a)在pH7下″pHIC″介質顯示由單個試驗(未顯示)證實的蛋白質正常洗脫順序的典型HIC色譜，(b)四個峰的拆分優(yōu)異或等于圖1和2中顯示的商業(yè)介質結果，(c)當pH從4降低到7時，肌紅蛋白(pI 6.3)峰從最先洗脫移動到最后洗脫并且α-乳清蛋白(pI 5)也移動(見下)，(d)而其它峰，如核糖核酸酶(pI 9.4)和α-胰凝乳蛋白酶原A(pI 9.6)保持相對位置但傾向于在更低鹽濃度下洗脫。觀察″c″說明通過改變pH，操作者可進行單獨的分離(如純化在傳統(tǒng)HIC中傾向于一起洗脫的核糖核酸酶和肌紅蛋白)。觀察″d″說明，類似于圖1和2，峰的右移與增加介質疏水性有關。結果是可以通過降低pH降低介質的有效鹽梯度范圍。故在不同pH值下操作的一種介質也能再現(xiàn)類似于圖1和2中許多不同介質范圍的色譜分離。
圖7顯示與圖6中pH4梯度試驗相關的單個蛋白質色譜(U8780323)。比較四種單個蛋白質的拆分峰與圖3中商業(yè)苯基瓊脂糖TM介質的拆分峰。注意到得到很大改進的峰形狀，和肌紅蛋白和α-乳清蛋白的回收。
圖8顯示采用圖6中顯示的pHIC介質的三個單獨試驗表明了色譜的再現(xiàn)性。采用相似摩爾比(未顯示)的介質的試驗也相似地表明了生產(chǎn)這種介質的再現(xiàn)性(穩(wěn)健性)。
試驗部分提供如下實施例僅用于說明性的目的而不應當解釋為限制由所附權利要求限定的本發(fā)明范圍。因此以下和另外在本說明書中給出的所有參考包括于此作為參考。
材料分離的化合物肌紅蛋白 (SIGMAM-1882)核糖核酸酶A (SIGMA R-5000)α-乳清蛋白 (SIGMA-L-5385)α-胰凝乳蛋白酶原A (SIGMAC-4879)硫酸銨 (Merck 1.01217.1000)硫酸鈉 (Merck 1.06649.1000)O-磷酸 (Merck 1.00573.2500)氫氧化鉀 (Merck 1.05033.1000)洗脫劑硫酸銨 (Merck 1.01217.1000)O-磷酸 (Merck 1.00573.2500)氫氧化鉀 (Merck 1.05033.1000)甘氨酸 (Merck 1.04201.1000)氫氧化鈉 (Merck 1.06469.1000)
硫酸鈉 (Merck 1.06649.1000)合成瓊脂糖TMHP (Amersham Biosciences AB，瑞典)氫氧化鈉(Merck 1.06469.1000)NaBH4(Int.30011700)Na2SO4(Merck 1.06649.1000)AGE (Fatgrden 236093-01)乙醇(Kemetyl 201035488)Hac (Merck 1.00063.1000)NaAc(Prolabo 27650.292)Br2(aq)(Int.)甲酸鈉 (Merck 1.06443.0500)二胺己烷(Fluka 204676)采用p-NPA的PVCL gr. (Int.Lund)DMF (Merck 17134-1)乙酸酐 (M & B A12/64/107-1)滴定HCl (Merck 1.00317.1000)Hac (Merck 1.00063.1000)HNO3AgNO3FTIR乙醇(Kemetyl 201035488)KBr (Aldrich 22.184-4)NMRDMSO(d6) (CIL 2206-27-1)丙酮(d6) (CIL 666-52-4)甲醇(d4) (CIL 811-98-3)氯仿(d) (CIL 865-49-6)DMF (安瓿)UV-VIS緩沖劑pH7 (Merck 1.09439.1000)
緩沖劑10 (Merck 1.09438.1000)緩沖劑pH4 (Merck 1.09435.1000)GPCTHF (Merck 1.09731.1000)PS標準物 (PL LTD)方法儀器疏水性相互作用色譜在裝配UV檢測器的KTATMExplorer 10S(ID 119)(Amersham Biosciences AB，Uppsala，瑞典)上進行。柱子是玻璃的且為HR5/5(18-0383-1)型。
對于凝膠的滴定，使用ABU 93TRIBURETTE(ID 672)(RadiometerCopenhagen)。對于胺基團的滴定，使用5-ml特氟隆管(ID 85)而對于烯丙基類基團的滴定使用1-ml特氟隆管(ID 600)。Perkin-Elmer16PC(系列號145689)用于凝膠的FTIR分析。將由NMR分析的凝膠采用50μl氟隆管測量并采用av500分析。將純聚合物溶解并通過NMR采用av300分析。
重量的所有測量對于≤1g的重量在Metler Toledo(ID 526)上測量，而對于≥1g的重量在Metler PM480(ID 635)上測量(當沒有給出其它信息時)。
作為溫度函數(shù)的聚合物吸光度采用Ultraspec 3000(ID 134)測量。對于GPC在THF中使用Waters712 WISP(ID 648)、Water 410(差示折射計)和PL-ELS 1000(檢測器)。
實施例1胺化烯丙基瓊脂糖TMHP的制備烯丙基-HP的制備將100ml排水的瓊脂糖TMHP放入250ml容器，加入25ml水并啟動攪拌。在50℃下60分鐘之后，加入各種數(shù)量的NaOH、0.2g的NaBH4和6g的Na2SO4并在50℃下連續(xù)攪拌讓這些物質反應16-20小時。
烯丙基-HP的胺化將排水的烯丙基-HP凝膠放入含有50-100ml水的容器中并啟動攪拌。加5g NaAc并加入Br2(aq)直到看出剩余的黃顏色，然后加入NaCOOH直到顏色消失，并用水洗滌凝膠。
制備17g 1，6-二胺己烷、8.8g NaCl，50ml水的溶液并將其加入到冷卻凝膠中。允許反應在50℃下進行16-20小時。
實施例2改性瓊脂糖TMHP-凝膠的分析滴定結果滴定的結果是所期望的。凝膠的烯丙基類濃度與凝膠的氯離子容量一樣隨氫氧化鈉的重量百分比增加而增加(表1)。
表1加入不同數(shù)量NaOH的凝膠的滴定結果

實施例3PVCL-NPA共聚物與胺化凝膠的偶合10ml凝膠的制備用DMF洗滌10ml胺改性瓊脂糖顆粒。將96mg的PVCL-NPA溶于10ml的DMF中并隨后將溶液加入到瓊脂糖顆粒中。讓混合物搖動過夜。向混合物中加入50μl乙酸酐(以乙酰化載體的殘余氨基烷基)，隨后在玻璃過濾器(孔度4)上過濾并用200ml DMF洗滌以除去過量聚合物。
凝膠的評價顯示氨基烷基的乙?；€不夠，所以加入的乙酸酐體積增加到10ml。
實施例4將PNIPAAm-PAA-共-BMA聚合物接枝到烯丙基化凝膠上根據(jù)表2稱量單體和AIBN并將其溶于15ml管形瓶中的二噁烷中。將排水的烯丙基瓊脂糖TMHP加入到管形瓶中并用橡膠隔膜密封容器。Ar(g)鼓泡通過管形瓶五分鐘。然后將管形瓶放入設定到70℃的搖動加熱塊中并使其反應過夜。
表2單體和AIBN的數(shù)量

采用玻璃過濾器過濾凝膠并在圓底燒瓶中回收洗脫的溶液。采用二噁烷洗滌凝膠隨后后乙醇和水洗滌。
將聚合物溶液在乙醚中沉淀并在真空烘箱中干燥。然后將干燥的聚合物溶于THF中并再次沉淀。繼續(xù)此過程直到剩下干燥和絨毛狀的聚合物粉末。
實施例5分析胺基團的滴定改性瓊脂糖的精確胺濃度是未知的，必須由滴定測定。使用的方法(NR 08)涉及·用水、100ml的0.5M HCl并最后用200ml 1mM的HCl洗滌15-20ml凝膠。
·在(5ml)特氟隆管的底部放上濾紙并采用在1mM HCl中的凝膠淤漿填充它。
·將管子連接到水抽吸直到干燥凝膠表面是可見的并隨后再進行約另外30秒。
·除去管子并通過加入水將凝膠轉移到滴定杯中。
·加入2-3滴濃硝酸并開始滴定。
烯丙基的滴定方法(NR 08)涉及·用水-乙醇-水-HAc-水洗滌凝膠。
·采用以上的特氟隆管(ID 600)測量1ml凝膠，通過加入蒸餾水將其轉移到瓶子中并稀釋到10ml的總體積。
·在攪拌下加入Br2(aq)直到顏色一致。
·將燒瓶置于抽吸下直到溶液是無色的。
·用水將燒瓶內的物料轉移到滴定容器中，稀釋到30ml，加入1-2滴濃硝酸并開始用AgNO3滴定。
羧基的滴定在特氟隆管中測量1ml凝膠。將凝膠轉移到含有15ml 1M KCl的滴定燒杯中。在開始滴定之前將pH降低到3以下。用0.1M NaOH進行滴定直到pH為11.5。
由NMR(HR-MAS)分析凝膠采用HR-MAS(磁角旋轉)分析聚合物涂覆的凝膠，此方法能夠利用來自凝膠基質的最小擾動分析所連接的聚合物。
在特氟隆管中測量50μl凝膠并用1ml水洗滌隨后用2×500μlDMSO洗滌。在加入凝膠之前將10μl的TMB放入探針底部。TMB用作內標，它使對比峰積分以進行定量計算成為可能。
由NMR分析純聚合物和單體當1H-NMR以單體或純聚合物(未連接到凝膠上的聚合物)運行時，將10mg樣品溶于0.70ml氘化溶劑中。
UV-VIS采用UV-分光光度計分析較低臨界溶液溫度LCST。制備聚合物在緩沖劑中的1％溶液。使用的緩沖劑溶液是pH為4-7的0.1M磷酸鉀(相同的緩沖劑用于HIC)。將溶液放入1cm樣品池。水用作參比物。采用500nm的光學透射比觀察濁點。測量的溫度間隔是20-75℃并且加熱速率為0.5℃/min。LCST定義為在吸光度對溫度曲線中拐點處的溫度。
GPC將聚合物溶于THF(0.5mg聚合物/ml THF)并在將它們加入到管形瓶中之前過濾溶液。還制備了兩種不同的標準物，將其過濾并加入到管形瓶中，每種標準物包含具有三種不同分子量的PS。然后將管形瓶放入自動旋轉的管形瓶夾具中，設備從該夾具取樣并將它們注入分析系統(tǒng)。
實施例6色譜評價柱的填充采用巴斯德吸移管用聚合物偶合的瓊脂糖TMHP(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)和乙醇(20％b.v.)的淤漿仔細填充柱子直到在柱的頂部僅留下幾毫米空間。加入幾滴乙醇并將柱子密封和連接到HIC設備上。
分離材料蛋白質混合物由四種蛋白質肌紅蛋白1.0mg/ml、核糖核酸酶A 2.0mg/ml、α-乳清蛋白0.8mg/ml和α-胰凝乳蛋白酶原A 0.8mg/ml組成。將蛋白質溶于pH7的2.0M硫酸銨/0.1M磷酸鉀緩沖劑。在冰箱中貯存蛋白質溶液樣品。同樣采用肌紅蛋白1.0mg/ml、核糖核酸酶A 2.0mg/ml、α-乳清蛋白0.8mg/ml和α-胰凝乳蛋白酶原A 0.8對蛋白質進行色譜分析。將蛋白質溶于pH7的2.0M硫酸銨/0.1M磷酸鉀緩沖劑。在冰箱中貯存蛋白質溶液樣品。
依賴于pH范圍使用兩種不同的緩沖劑體系(見表3)。A-緩沖劑具有″鹽析″效應并促進蛋白質-HIC介質相互作用，而B-緩沖劑的較低離子強度促進洗脫。
表3用于HIC研究的緩沖劑

采用從100％A-緩沖劑到100％B-緩沖劑的鹽梯度運行HIC，流量是1ml/min。UV檢測器在215、254和280nm下運行。注射體積是50μl。pH和溫度在每個試驗期間保持恒定。
測試蛋白質的性能用于測試混合物的蛋白質的一些性能(表4)。注意在pH從7到4時，兩種蛋白質(肌紅蛋白和核糖核酸酶)通過它們的等電位pH并改變凈電荷從負到正而其它兩種蛋白質保持它們的凈正電荷。來源蛋白質數(shù)據(jù)銀行(www.rcsb.org/pdb/)。
表4四種不同蛋白質的描述

實施例7聚合物分析的結果NMR結果采用NMR分析測定的數(shù)值(表5)不應當被認為是精確的數(shù)值。峰未被清晰地分開，導致結果的某些不可靠性。通過比較峰組而不是單個峰測定結果，這是優(yōu)選的方式。分離較差的峰可能是由于難以找到使聚合物自由旋轉的良好溶劑。
表5供應商的m∶n值和由NMR測定的值之間的比較

UV-VIS結果根據(jù)理論推測當加入親水性組分時LCST值增加而當共聚單體是疏水性的時LCST值降低。在此情況下與N-異丙基丙烯酰胺相比，丙烯酸更親水而甲基丙烯酸丁酯(BMA)較不親水。
對于此研究LCST定義為由吸光度對溫度曲線中拐點處的溫度表示。
在低pH下LCST值低于32℃，但對于其中不加入BMA的聚合物此數(shù)值也如此。此聚合物事實上具有它們所有的最低LCST值。聚合物的水溶解度不太好，難以得到1％溶液。
另一方面聚合物的濁點是非常pH依賴性的。在pH4和5下LCST值為約25-30℃，但當pH增加到5以上時，觀察LCST在約70℃。在pH7下在所觀察的溫度范圍(20-75℃)中沒有看到LCST。AA中的羧基在pH6和7下帶電荷，增加親水性并因此增加LCST。
可以得出的結論是對于所有研究的PNIPAAm-共-PAA-共-PBMA組合物，在環(huán)境溫度下從7到4改變pH應當導致聚合物結構中的構象變化。聚合物的親水性在大于5的pH下更大并且在pH7下沒有觀察到聚合物溶液的混濁。
GPC結果來自NIPAAM、AA和BMA三元聚合物的GPC的色譜顯示出寬峰并有時為多重峰。這可能意味著在樣品中存在均聚物和共聚物。
表6多分散性

*沒有拆分的多重峰沒有轉移劑的合成聚合物的多分散性高且分子量在不同體系之間非常不同，盡管除單體的進料比以外反應條件相同(表6)。
實施例8HIC評價使用苯基瓊脂糖TMHP介質的對照HCI采用苯基-瓊脂糖TMHP(Phe-HP)介質進行對照研究。對所有的柱使用相同的柱制備方法和色譜方法。
圖3a和b顯示采用Phe-HP介質在pH7和4兩者下對于本文的標準蛋白質混合物和對于單個蛋白質兩者獲得的結果?？梢郧宄乜吹剑趐H7下和在pH4下運行的蛋白質混合物色譜中存在非常小的差異。這種pH響應性的缺乏實際上被視為對傳統(tǒng)HIC介質的正向貢獻。然而在兩種情況下均沒有兩個以上大峰的拆分。也可從單個蛋白質試驗看出，在pH7下第一個峰由肌紅蛋白和核糖核酸酶A組成，而第二個峰由胰凝乳蛋白酶原A(雙峰)和乳清蛋白(非常寬的低″峰″)組成。
改變pH到4仍然留下兩個大的蛋白質混合物峰。單個試驗表明這些仍然分別受核糖核酸酶A、胰凝乳蛋白酶原A影響。肌紅蛋白和乳清蛋白不顯現(xiàn)為被洗脫或可能在非常寬的低″峰″中洗脫。
使用PNIPPAm-共-PAA-共-PBMA的對照HIC用具有不同NIPAAm、AA和BMA進料比的四種凝膠填充柱子并采用蛋白質混合物在pH4-7下運行HIC(表7)。
表7用于HIC評價的柱子

與商業(yè)苯基-HP介質(圖5)相比，所有四種凝膠顯示有前途的HIC介質行為(圖3a和b)。在pH4下，U8780323具有在22min洗脫時間的大峰，此峰也可以在(盡管較小)柱U878029和U8780321中看到，而采用U8780322的色譜完全缺乏此峰。采用相似組成(表7)的兩種介質(0323和029)獲得最好的結果。
可以采用輕稍不同的配方獲得的相似的良好結果表明了結果的再現(xiàn)性。它還表明這種介質生產(chǎn)運行的輕微變化也會得到良好的介質。然而應當注意到，結果顯現(xiàn)為依賴于AA對BMA的適當比例而這應當進一步研究。
選擇柱U8780323用于采用蛋白質混合物(圖6)的進一步評價，使用單獨的蛋白質證實位置。以下顯示單獨的蛋白質色譜(圖7和8)，在表8中給出的平均峰位置按照相對洗脫鹽濃度(硫酸銨)表示。
在U8780323上在pH4-7下運行的HIC的所有色譜中，α-胰凝乳蛋白酶原A顯示雙峰行為，小峰之后為更大的峰。如在引言中所述，這是相當?shù)湫偷摹．斀档蚿H時所有的蛋白質在更低鹽濃度下洗脫(表8和圖6)。這表明如下一些可能性pH響應性聚合物介質可在較低鹽條件下允許HIC。
表8在不同pH下的柱U8780323運行

注以上表示平均峰位置；如正常的那樣，胰凝乳蛋白酶原洗脫在兩個峰中在pH7下蛋白質以預期的順序肌紅蛋白、核糖核酸酶A、α-乳清蛋白和最后α-胰凝乳蛋白酶原A洗脫。在肌紅蛋白和核糖核酸酶A之間的拆分不是令人滿意的，但蛋白質峰拆分與許多商業(yè)介質一樣好。
當pH變化到6時，洗脫時間在一定程度上更長但洗脫的相對順序與pH7的相同。也許存在肌紅蛋白和核糖核酸酶A峰的更多拆分，但α-乳清蛋白(pI 5)峰不如在pH7下尖銳。
在pH5下洗脫的順序改變。在pH7和6下首先洗脫的肌紅蛋白(pI 6.3)現(xiàn)在變?yōu)閮綦姾蔀榧s+8并且變成最后洗脫的蛋白質。α-胰凝乳蛋白酶原A和α-乳清蛋白在幾乎相同的鹽濃度下在肌紅蛋白之前洗脫。核糖核酸酶、α-乳清蛋白和α-胰凝乳蛋白酶原A的相對位置仍然與它們的正常HIC行為(即相對疏水性)一致。
在pH4下肌紅蛋白和α-乳清蛋白(具有酸性pI的兩種蛋白質)在相同濃度(100％B-緩沖劑)下洗脫，在蛋白質混合物中得到一個單一峰。洗脫的順序現(xiàn)在是核糖核酸酶A、α-胰凝乳蛋白酶原(具有堿性pI的兩種蛋白質)然后是α-乳清蛋白和肌紅蛋白(圖7)。
權利要求
1.從液體分離至少一種目標化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)在第一pH下使液體與顯示表面定位pH響應性聚合物的分離介質接觸，以通過疏水性相互作用吸附目標化合物；和(b)加入第二pH值的洗脫劑，它提供所述pH響應性聚合物的構象變化，以從分離介質釋放目標化合物。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中第二pH值低于第一pH值。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中洗脫劑包括降低pH梯度。
4.根據(jù)任何權利要求1的方法，其中洗脫劑的電導率不同于步驟(a)的液體的電導率，而第二pH值保持基本等于第一pH值。
5.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中洗脫劑包括鹽梯度。
6.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中在步驟(a)中，分離介質是不帶電的。
7.根據(jù)權利要求1-5任意一項的方法，其中在步驟(a)中，目標化合物也由pH響應性聚合物和目標化合物之間的另外相互作用吸附，該另外相互作用選自電荷-電荷相互作用、范德華相互作用和基于共溶解/共水合的相互作用。
8.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中在步驟(b)中，分離介質是不帶電的。
9.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中在步驟(b)中，pH響應性聚合物的疏水性不如在步驟(a)中的。
10.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中聚合物的構象變化由聚合物自締合和/或聚合物與介質的締合提供。
11.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中pH響應性聚合物是共聚物。
12.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中每種pH響應性聚合物包括疏水性部分、親水性部分和pH響應性部分。
13.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中pH響應性聚合物包括選自如下基團的側掛pH敏感性基團-COOH基團、-OPO(OH)2基團、-SO3-基團、SO2NH2基團、-CNH2基團、-C2NH基團和-C3N基團。
14.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中目標化合物是生物分子，如蛋白質或肽。
15.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，它是色譜方法。
16.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，它是分析方法。
17.根據(jù)前述權利要求任意一項的方法，其中基質是生物傳感器或生物芯片。
18.根據(jù)權利要求1-14任意一項的方法，它是過濾方法。
19.一種疏水性相互作用色譜(HIC)介質，它由表面定位pH響應性聚合物連接到其上的基質組成，該聚合物顯示HIC配體。
20.根據(jù)權利要求19的介質，其中聚合物的pH響應性基團選自-COOH基團、-OPO(OH)2基團、-SO3-基團、SO2NH2基團、-CNH2基團、-C2NH基團和-C3N基團。
21.一種用于分離目標化合物的試劑盒，該試劑盒包括在單獨的隔室中由介質填充的色譜柱，該介質由表面定位pH響應性聚合物連接到其上的基質組成，該聚合物顯示HIC配體；具有第一pH的吸附緩沖劑；具有第二pH的洗脫劑，第二pH低于所述第一pH；及其使用的書面說明書。
22.根據(jù)權利要求21的試劑盒，其中聚合物的pH響應性基團選自-COOH基團、-OPO(OH)2基團、-SO3-基團、SO2NH2基團、-CNH2基團、-C2NH基團和-C3N基團。
全文摘要
本發(fā)明涉及從液體分離目標化合物的方法，該方法包括在第一pH下使液體與顯示表面定位pH響應性聚合物的分離介質接觸，以通過疏水性相互作用吸附目標化合物；和加入洗脫劑，它具有第二pH并提供所述pH響應性聚合物的構象變化以釋放所述化合物。洗脫有利地通過pH梯度和/或通過鹽梯度進行。
文檔編號B01J20/281GK1761508SQ200480007315
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月18日 優(yōu)先權日2003年3月20日
發(fā)明者J·范阿爾斯泰恩, C·拉松, R·帕爾姆格倫, A·魯?shù)滤固氐绿?申請人:阿默森生物科學有限公司