專利名稱：核酸擴(kuò)增裝置及核酸擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用PCR法的核酸擴(kuò)增裝置及核酸擴(kuò)增方法，更具體涉及在內(nèi)部具有至少一條流路，在該流路中導(dǎo)入至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液，通過(guò)被固定在該流路內(nèi)的核酸合成酶進(jìn)行核酸的擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增裝置及核酸擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法被廣泛應(yīng)用于微量的模板DNA的高效的復(fù)制·擴(kuò)增。PCR法是通過(guò)多次重復(fù)以下的循環(huán)來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)DNA的方法，其1個(gè)循環(huán)包括將作為模板的雙鏈DNA熱變性成單鏈DNA的步驟；在得到的單鏈模板DNA上分別與互補(bǔ)的引物退火的步驟；通過(guò)具有耐熱性的DNA聚合酶作用，由引物進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成，從而合成雙鏈DNA的步驟。
上述各步驟通過(guò)控制反應(yīng)液的溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行，通常，作為模板的雙鏈DNA熱變性成單鏈DNA在約94℃下進(jìn)行，在單鏈DNA上將引物退火在約55℃下進(jìn)行，通過(guò)DNA聚合酶的互補(bǔ)鏈的合成在約72℃下進(jìn)行。
以往，作為自動(dòng)執(zhí)行PCR法的裝置，已知有通過(guò)以下方法進(jìn)行反應(yīng)的裝置將含有模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶等的反應(yīng)液加入Eppendorf型試管中，將該試管插入設(shè)置于鋁制部件上的孔中，用加熱器和冷卻器改變?cè)撲X部件的溫度。
然而，上述PCR法需要在高精度的溫度控制下進(jìn)行熱循環(huán)，如上述的分批式的反應(yīng)中隨著規(guī)模的增大，反應(yīng)體系的熱的波動(dòng)變得顯著，所以規(guī)模的提升存在極限。
因此，作為在高精度的溫度控制下進(jìn)行熱循環(huán)、而且可以提升擴(kuò)增量的PCR法，在下述專利文獻(xiàn)1和下述非專利文獻(xiàn)1中揭示了流式PCR法。該流式PCR法是通過(guò)向設(shè)置有加熱部和冷卻部的流路輸入含有DNA聚合酶、模板DNA、引物DNA、dNTP等的反應(yīng)液來(lái)進(jìn)行熱循環(huán)，從而進(jìn)行PCR的方法。
此外，下述專利文獻(xiàn)2中揭示了以下的核酸序列的擴(kuò)增方法，它是用于擴(kuò)增核酸序列的方法，其特征在于，包含(a)將作為模板的核酸通過(guò)DNA聚合酶和與該核酸的堿基序列實(shí)際互補(bǔ)的至少1種引物進(jìn)行處理，合成與該模板互補(bǔ)的引物延伸鏈的步驟；其中，該引物是含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合體寡聚核苷酸引物，為了用核酸內(nèi)切酶剪切，該核糖核苷酸配置在該引物的3’末端或3’末端一側(cè)；(b)將(a)步驟中得到的雙鏈核酸的引物延伸鏈的含有核糖核苷酸的部位用核酸內(nèi)切酶剪切的步驟；和(c)自(b)步驟中得到的被切去引物延伸鏈的雙鏈核酸的引物部分的3’端，通過(guò)具有鏈轉(zhuǎn)移活性的DNA聚合酶使與模板互補(bǔ)的核酸序列延伸，從而進(jìn)行鏈轉(zhuǎn)移的步驟。若采用該方法(ICAN法)，可以不進(jìn)行熱循環(huán)而擴(kuò)增DNA，所以可以使用不具有耐熱性的酶，而且沒(méi)有熱的波動(dòng)引起的反應(yīng)規(guī)模的限制。
專利文獻(xiàn)1日本專利特開(kāi)平6-30776號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2日本專利特開(kāi)2003-70490號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1《Science》(1998年)280號(hào)5366卷，1046-1048頁(yè)(Kopp MU，Mello AJ，Manz A.著)發(fā)明的揭示本發(fā)明要解決的問(wèn)題然而，上述分批式的PCR法、上述專利文獻(xiàn)1和上述非專利文獻(xiàn)1所述的PCR法在使雙鏈模板DNA變性為單鏈DNA時(shí)需要加熱，因此需要使用具有耐熱性的特殊的DNA聚合酶，存在無(wú)法使用普遍存在的不具有耐熱性的DNA聚合酶的缺點(diǎn)。
此外，上述專利文獻(xiàn)2所揭示的方法中，使用RNA和DNA的嵌合體引物作為引物，需要使用在DNA雙鏈解鏈的同時(shí)合成DNA的exo-Bca DNA聚合酶和剪切在嵌合體引物上新延伸的DNA與嵌合體引物RNA的連接點(diǎn)的核糖核酸酶H等特殊的酶，所以存在成本升高的缺點(diǎn)。
另外，上述以往的方法中反應(yīng)生成物中混有DNA聚合酶等核酸合成酶，因此不僅擴(kuò)增的DNA的純化麻煩，而且昂貴的核酸合成酶幾乎無(wú)法再利用。
因此，本發(fā)明的目的在于提供不僅是使用具有耐熱性的核酸合成酶、即使使用不具有耐熱性的核酸合成酶也可以連續(xù)、高效地進(jìn)行PCR，核酸合成酶可以再利用、連續(xù)地使用，而且擴(kuò)增的核酸的分離·純化容易，還可以提升規(guī)模的核酸擴(kuò)增裝置及核酸擴(kuò)增方法。
解決課題的方法為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置是在內(nèi)部具有至少一條流路，在該流路中流過(guò)至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液，在該流路內(nèi)擴(kuò)增核酸的核酸擴(kuò)增裝置；其特征在于，所述流路同時(shí)具有變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域，所述變性區(qū)域內(nèi)進(jìn)行使所述作為模板的核酸的分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈解鏈的變性反應(yīng)，所述復(fù)性區(qū)域內(nèi)使所述雙鏈解鏈的作為模板的核酸和所述作為引物的核酸形成雙鏈，核酸合成酶被固定于所述復(fù)性區(qū)域。
若采用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置，則在具有上述變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域的至少一條的流路內(nèi)導(dǎo)入至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液進(jìn)行核酸合成反應(yīng)時(shí)，被固定在上述復(fù)性區(qū)域的上述核酸合成酶不會(huì)受到使作為模板的核酸解鏈而變性成單鏈狀態(tài)時(shí)的加熱等的影響，所以核酸合成酶的失活受到抑制，即使使用不具有耐熱性的核酸合成酶也可以連續(xù)地進(jìn)行PCR。此外，上述核酸合成酶是固定的，所以不僅可以容易地進(jìn)行擴(kuò)增了的核酸的分離·純化，而且上述核酸合成酶可以再利用、連續(xù)地使用，反應(yīng)規(guī)模的提升也是容易的。本發(fā)明中，提到核酸的情況下，其含義包含天然型和非天然型的兩類(lèi)核酸。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置中，較好是具有可以加熱上述變性區(qū)域、并且將上述復(fù)性區(qū)域保持在比上述變性區(qū)域低的溫度的溫度控制部件。若采用這種方式，可以連續(xù)、高效地進(jìn)行由以下步驟構(gòu)成的一系列的PCR循環(huán)通過(guò)加熱使具有在分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈的作為模板的核酸解鏈，變性為單鏈狀態(tài)的步驟；在所述比變性區(qū)域的溫度低的環(huán)境下，在得到的該雙鏈解鏈了的作為模板的核酸和分別互補(bǔ)的引物之間形成雙鏈的步驟；在所述比變性區(qū)域的溫度低的環(huán)境下，使其與核酸合成酶作用，由引物進(jìn)行互補(bǔ)鏈合成的步驟。
此外，較好是所述核酸合成酶被固定在珠粒上，該珠粒至少被填充在所述復(fù)性區(qū)域內(nèi)。若采用這種方式，可以使固定的核酸合成酶與反應(yīng)液高效地接觸，所以能夠提高反應(yīng)效率。
或者，上述核酸合成酶也可以至少被固定在所述復(fù)性區(qū)域的內(nèi)壁表面。若采用這種方式，可以簡(jiǎn)單地形成固定化核酸合成酶的流路。即，形成這樣的流路時(shí)，首先可以使核酸合成酶固定化在流路的整個(gè)表面而形成整個(gè)流路，通過(guò)這種方式，即使變性區(qū)域的酶失活，復(fù)性區(qū)域的酶仍保持活性狀態(tài)，所以可以容易地形成所需的流路。
另外，在上述流路內(nèi)較好是交互地設(shè)置上述變性區(qū)域和上述復(fù)性區(qū)域。若采用這種方式，則可以進(jìn)行多次PCR循環(huán)，所以能夠高效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置中，上述核酸合成酶可以使用在30～40℃的溫度具有最適溫度的酶。若采用這種方式，則可以擴(kuò)大核酸合成酶使用的選擇范圍，選擇以往的PCR中無(wú)法使用的較經(jīng)濟(jì)的酶。此外，還可以同時(shí)使用除一般的核酸合成酶外的其他的酶。因此，通過(guò)同時(shí)使用以往進(jìn)行PCR時(shí)難以同時(shí)使用的酶、例如糾正合成了的核酸的錯(cuò)配的酶等，可比以往的PCR提高擴(kuò)增的可靠性。
此外，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置中，上述流路可以具有循環(huán)流路，而且該循環(huán)流路具有上述復(fù)性區(qū)域和上述變性區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
在這里，循環(huán)流路是指用于使反應(yīng)液循環(huán)、并交替通過(guò)該循環(huán)流路內(nèi)的變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域的流路，是上述流路在規(guī)定的位置分支、該分支的流路再互相連接的、具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的流路或者上述流路的整體具有一個(gè)或多個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的流路，利用該環(huán)狀結(jié)構(gòu)的流路流動(dòng)液體的一部分或全部流過(guò)環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行循環(huán)。
若采用這種方式，則可以在使作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物等在指定區(qū)域內(nèi)循環(huán)的同時(shí)，反復(fù)流過(guò)變性區(qū)域、復(fù)性區(qū)域，所以能夠防止模板用盡，并積極地再利用反應(yīng)液，因此可以減低運(yùn)行成本。
另外，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置較好是具有控制反應(yīng)液流向的供液裝置，該供液裝置控制反應(yīng)液的流向周期性地逆轉(zhuǎn)。若采用這種方式，則可以使用各種在有限的容積內(nèi)供液的供液裝置，能夠使供液裝置的簡(jiǎn)化變得容易，以適應(yīng)裝置的小型化。
此外，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法是用于在至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液中擴(kuò)增作為模板的核酸的方法，其特征在于，包含(a)在指定區(qū)域內(nèi)使所述作為模板的核酸的分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈解鏈的變性步驟；(b)在與步驟(a)不同的區(qū)域，步驟(a)中得到的該雙鏈解鏈了的作為模板的核酸和所述作為引物的核酸之間形成雙鏈的復(fù)性步驟；(c)在步驟(b)中和/或后，使被固定于包括進(jìn)行步驟(b)的區(qū)域在內(nèi)的區(qū)域的、保持活性狀態(tài)的核酸合成酶與反應(yīng)液接觸的步驟。
若采用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法，則可以在不同的區(qū)域分別進(jìn)行上述變性步驟和上述復(fù)性步驟，上述被固定于包括進(jìn)行復(fù)性步驟的區(qū)域在內(nèi)的區(qū)域的核酸合成酶不會(huì)受到使作為模板的核酸變性時(shí)的加熱等的影響，所以核酸合成酶的失活受到抑制，即使使用不具有耐熱性的核酸合成酶也可以連續(xù)地進(jìn)行PCR。此外，上述核酸合成酶是固定的，所以不僅可以容易地進(jìn)行擴(kuò)增了的核酸的分離·純化，而且上述核酸合成酶可以再利用、連續(xù)地使用，反應(yīng)規(guī)模的提升也是容易的。
發(fā)明的效果若采用本發(fā)明，則在具有使核酸的分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈解鏈而變性為單鏈狀態(tài)的區(qū)域以及使該雙鏈解鏈了的核酸再次形成雙鏈的復(fù)性區(qū)域的流路中，導(dǎo)入至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液進(jìn)行核酸合成反應(yīng)時(shí)，上述被固定于復(fù)性區(qū)域的核酸合成酶不會(huì)受到使作為模板的核酸變性時(shí)的加熱等的影響，所以核酸合成酶的失活受到抑制，即使使用不具有耐熱性的核酸合成酶也可以連續(xù)地進(jìn)行PCR。此外，上述核酸合成酶是固定的，所以不僅可以容易地進(jìn)行擴(kuò)增了的核酸的分離·純化，而且上述核酸合成酶可以再利用、連續(xù)地使用，反應(yīng)規(guī)模的提升也是容易的。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明[

圖1]本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的一種實(shí)施方式的示意圖。
上述核酸擴(kuò)增裝置的流路的部分模式圖。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的另一種實(shí)施方式的示意圖。
上述核酸擴(kuò)增裝置的循環(huán)流路的模式圖。
上述用于形成變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域的變性用溫度控制部件和復(fù)性用溫度控制部件的說(shuō)明圖。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的又一種實(shí)施方式的示意圖。
同一核酸擴(kuò)增裝置中固定化在毛細(xì)管內(nèi)的核酸合成酶的模式圖。
本發(fā)明的實(shí)施例中所用的核酸擴(kuò)增裝置的流路的1個(gè)單元的模式圖。
通過(guò)同一核酸擴(kuò)增裝置擴(kuò)增核酸、并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果的照片。
符號(hào)的說(shuō)明1、1a～1g 基板2 流路2a 注入孔2b 取出孔2c 分支流路3 珠粒填充部3a 寬徑部4 珠粒5 核酸合成酶6 固定化核酸合成酶10、20、50 核酸擴(kuò)增裝置
11～13、13a外部供液裝置14 第1反應(yīng)液槽15 第2反應(yīng)液槽16 反應(yīng)液槽31、32 恒溫槽33、52 溫度控制裝置34、39 變性用溫度控制部件35、40 復(fù)性用溫度控制部件36、37 攪拌機(jī)38 隔板51 毛細(xì)管A 變性用溫度區(qū)域B 復(fù)性用溫度區(qū)域?qū)嵤┌l(fā)明的最佳方式首先，對(duì)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行說(shuō)明。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中，通過(guò)向至少一條流路內(nèi)導(dǎo)入至少含有作為模板的核酸(以下簡(jiǎn)稱模板)、作為引物的核酸(以下簡(jiǎn)稱引物)、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液，在所述流路內(nèi)進(jìn)行所述模板的變性、變性了的所述模板和所述引物的退火、使用核酸合成酶的核酸的合成；所述流路中設(shè)置進(jìn)行使形成了雙鏈的所述作為模板的核酸的變性反應(yīng)的變性區(qū)域和在進(jìn)行成為單鏈狀態(tài)的所述作為模板的核酸與所述引物的退火反應(yīng)的同時(shí)通過(guò)核酸合成酶進(jìn)行核酸合成反應(yīng)的復(fù)性區(qū)域，所述復(fù)性區(qū)域的流路的至少一部分中固定核酸合成酶。模板的變性是指使形成雙鏈的核酸解鏈，成為單鏈的狀態(tài)。
上述變性區(qū)域設(shè)定為模板變性所需的環(huán)境，例如設(shè)定為1)設(shè)定在核酸的解鏈溫度以上、2)設(shè)定為堿性·酸性、3)不含有陽(yáng)離子、4)混入氫鍵抑制劑(例如尿素和胍鹽等)等的環(huán)境。
本發(fā)明中，為了重復(fù)進(jìn)行核酸的變性和復(fù)性，在上述條件中，較好是可重復(fù)設(shè)定地設(shè)定在核酸的解鏈溫度以上或設(shè)定為堿性·酸性，設(shè)定在核酸的解鏈溫度以上是效率最高的，所以特別好。例如，模板的變性在核酸的解鏈溫度以上加熱而進(jìn)行時(shí)，根據(jù)模板的長(zhǎng)度和序列不同，不能一概而論，例如數(shù)百堿基對(duì)的模板的情況下可以加熱至90～99℃、較好是92～97℃。
由于難以賦予核酸合成酶耐堿性，所以以往的PCR法中，沒(méi)有使用堿性環(huán)境作為模板的變性條件，但本發(fā)明中，可以將固定核酸合成酶的區(qū)域設(shè)定為中性環(huán)境，如果這樣設(shè)定為中性環(huán)境，則也可以將變性區(qū)域設(shè)定為堿性環(huán)境進(jìn)行模板的變性。
另一方面，上述復(fù)性區(qū)域設(shè)定為核酸復(fù)性所需的環(huán)境，例如設(shè)定為滿足1)設(shè)定在核酸的解鏈溫度以下(以不加熱或冷卻作為手段)、2)設(shè)定為弱酸性～弱堿性(pH7±3左右)、3)含有適當(dāng)?shù)年?yáng)離子、4)不含有氫鍵抑制劑(例如尿素和胍鹽等)等所有條件的環(huán)境。例如，由于進(jìn)行核酸復(fù)性時(shí)的溫度條件根據(jù)模板和引物的解鏈溫度而不同，所以不能一概而論，例如使用15～30堿基對(duì)的引物時(shí)為30～70℃，本發(fā)明中特別好為30～40℃。核酸復(fù)性是指互相互補(bǔ)的單鏈核酸形成雙鏈，在進(jìn)行PCR的環(huán)境下的核酸復(fù)性實(shí)際是指模板和引物的退火。
本發(fā)明中，通過(guò)向上述流路中導(dǎo)入的反應(yīng)液移動(dòng)到上述變性區(qū)域，該反應(yīng)液暴露于上述變性區(qū)域所設(shè)定的環(huán)境，此外，通過(guò)移動(dòng)到上述復(fù)性區(qū)域，該反應(yīng)液暴露于上述復(fù)性區(qū)域所設(shè)定的環(huán)境。
此外，本發(fā)明中，上述變性區(qū)域較好是通過(guò)在該流路的外部設(shè)置變性用溫度控制裝置而形成，使得可以將在流路內(nèi)移動(dòng)的反應(yīng)液加熱到上述的核酸解鏈溫度以上；上述復(fù)性區(qū)域較好是通過(guò)在該流路的外部設(shè)置變性用溫度控制裝置而形成，使得可以將在流路內(nèi)移動(dòng)的反應(yīng)液加熱到上述的核酸解鏈溫度以下。
本發(fā)明的方法所用的核酸合成酶是可以用于核酸擴(kuò)增的酶，只要是一般可以獲得的酶均可使用，沒(méi)有特別限定，具體地可以例舉DNA聚合酶、連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶等。此外，也可以將這些核酸合成酶組合使用。
本發(fā)明中，還可以使用以往的PCR法和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chainreactionLCR)法所使用的具有耐熱性的核酸合成酶。核酸合成酶被固定在上述復(fù)性區(qū)域的流路內(nèi)，不會(huì)經(jīng)受使模板變性時(shí)所進(jìn)行的加熱等，所以可以使用不具有耐熱性的核酸合成酶。
本發(fā)明中，核酸合成酶可以適用在30～40℃的溫度下具有最適溫度的酶，所以可以選擇以往的PCR中無(wú)法使用的較經(jīng)濟(jì)的酶。此外，還可以同時(shí)使用除一般核酸合成酶外的其他的酶。因此，通過(guò)同時(shí)使用以往進(jìn)行PCR時(shí)難以同時(shí)使用的酶、例如糾正合成了的核酸的錯(cuò)配的酶等，比以往的PCR可以提高擴(kuò)增的可靠性。
本發(fā)明中，較好是使用反應(yīng)效率高的酶和容易獲得的酶，具體地，較好是使用復(fù)制的可靠性高的來(lái)源于大腸桿菌的DNA聚合酶I。此外，雖然復(fù)制的可靠性稍低，但也可以使用DNA聚合酶I除去核酸外切酶活性部位的克列諾片斷(Klenow fragment)等。
上述核酸合成酶例如可以固定化在珠粒表面并被填充在上述復(fù)性區(qū)域的流路的至少一部分中，也可以直接固定化在流路的內(nèi)壁表面。
在這里，使用被固定在珠粒上的核酸合成酶時(shí)，可以使固定的核酸合成酶與反應(yīng)液高效地接觸，所以能夠提高反應(yīng)效率。
此外，核酸合成酶至少被固定在所述復(fù)性區(qū)域的內(nèi)壁表面的情況下，本發(fā)明的裝置的結(jié)構(gòu)可以簡(jiǎn)單地形成。即，形成這樣的流路時(shí)，首先可以使核酸合成酶固定化在流路的整個(gè)表面而形成整個(gè)流路，通過(guò)這種方式，即使變性區(qū)域的酶失活，復(fù)性區(qū)域的酶仍保持活性狀態(tài)，所以可以容易地形成所需的流路。
固定化核酸合成酶的珠粒的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，可以優(yōu)選地例舉金屬微粒、玻璃粒子、樹(shù)脂制粒子等，特別好是使用膠乳珠粒和殼聚糖珠粒這樣與生物分子的相容性好、酶的固定化容易的珠粒。上述珠粒的大小只要是可以被填充在上述流路內(nèi)的大小即可，可以適當(dāng)設(shè)定，通常直徑為0.4～100μm，較好是直徑為1～50μm。
此外，形成上述流路的材質(zhì)較好是熱傳導(dǎo)性較高，在PCR所需的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，不易被電解質(zhì)溶液和有機(jī)溶劑侵蝕，不易吸附核酸和蛋白質(zhì)。具有耐熱性和耐腐蝕性的材質(zhì)除了玻璃、石英、硅，還可以例舉各種塑料，較好是在它們的表面(與反應(yīng)液接觸的內(nèi)壁表面)用聚乙烯、聚丙烯等被公認(rèn)一般不易吸附核酸和蛋白質(zhì)的材質(zhì)被覆，或以共價(jià)鍵導(dǎo)入聚乙二醇(PEG)等含有大量親水性官能團(tuán)的分子來(lái)抑制核酸和蛋白質(zhì)的吸附。
上述將核酸合成酶固定化在珠粒表面或流路的內(nèi)壁表面的方法可以采用承載法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、靜電吸附法等公知的方法，由于可以反復(fù)進(jìn)行酶反應(yīng)，所以共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法是特別理想的。例如，共價(jià)結(jié)合法可以按照日本專利特開(kāi)平3-164177號(hào)公報(bào)等記載的方法進(jìn)行，可以在珠粒表面和流路的內(nèi)壁表面導(dǎo)入反應(yīng)性較高的官能團(tuán)(例如，氯羰基(氯酰)、羧基、氨基、硫醇基(硫基)、環(huán)氧基等)，通過(guò)使該官能團(tuán)和存在于核酸合成酶的表面的羰基、氨基、硫醇基(硫基)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行固定化。
本發(fā)明中所使用的反應(yīng)液中至少含有模板、引物、磷酸化合物和金屬離子。
上述模板為作為擴(kuò)增目標(biāo)的核酸，可以使用通過(guò)常規(guī)方法制備的天然型或非天然型的核酸。反應(yīng)液中的上述模板的濃度通常較好為0.01～100pM，更好為0.1～10pM。
上述引物是具有至少與上述模板的一部分堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸，一般的PCR法和LCR法中可以使用的核酸即可，較好是設(shè)計(jì)成可以高效地?cái)U(kuò)增作為目標(biāo)的核酸，通常較好是使用15～30堿基的序列。例如，作為引物的核酸可以通過(guò)使用核酸自動(dòng)合成機(jī)容易地制造。反應(yīng)液中的上述引物的濃度通常較好為0.01～1μM，更好為0.1～0.2μM。
此外，為了后面的檢測(cè)和分離，上述引物中還含有被化學(xué)修飾·改變了的非天然型核酸。上述非天然型核酸沒(méi)有特別限定，可以優(yōu)選地例舉用生物素或FITC標(biāo)記的寡聚核酸、具有硫代磷酸酯鍵的寡聚核酸和含有PNA(肽核酸)與天然型核酸的嵌合體核酸等。
上述磷酸化合物是作為擴(kuò)增核酸時(shí)的底物的成分，例如使用DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶作為核酸合成酶的情況下，以任意比例含有dNTP、即dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物較好是使用4種脫氧核苷酸三磷酸的等量混合物。另一方面，使用連接酶的情況下，較好是使用NTP，可以特別優(yōu)選地例舉ATP和GTP。反應(yīng)液中的上述磷酸化合物的濃度可以適當(dāng)設(shè)定，通常較好是0.01～1mM，更好是0.1～0.5mM。
上述金屬離子可以例舉鉀離子(K+)、鈉離子(Na+)、鎂離子(Mg2+)等。通過(guò)含有這樣的金屬離子，可以實(shí)現(xiàn)雙鏈核酸的穩(wěn)定化、酶活性化、合成的核酸的忠實(shí)性提高等效果。反應(yīng)液中的上述金屬離子的濃度通常為，鉀離子和鈉離子較好是10～200mM，更好是50～100mM。此外，鎂離子較好是1～5mM，更好是1.5～2.5mM。
本發(fā)明的方法中，較好是適當(dāng)調(diào)整上述反應(yīng)液的供液速度和流路的長(zhǎng)度等條件，使得可以在流路內(nèi)高效地進(jìn)行模板的變性、變性了的模板和引物的退火以及核酸合成。這些條件由于受到模板的長(zhǎng)度、合成的核酸的長(zhǎng)度、使用的核酸合成酶的反應(yīng)速度等的影響，因此不能一概而論，通常上述反應(yīng)液通過(guò)上述變性區(qū)域一次的時(shí)間為1～60秒，較好是5～30秒，通過(guò)上述復(fù)性區(qū)域一次的時(shí)間為5～300秒，較好是10～120秒。
以下，根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法所使用的核酸擴(kuò)增裝置進(jìn)行說(shuō)明，原則上同一部分使用相同的符號(hào)，其說(shuō)明省略。
圖1中，表示了本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的一種實(shí)施方式。核酸擴(kuò)增裝置10中，在變性用溫度區(qū)域A和復(fù)性用溫度區(qū)域B的基板1上形成具有指定內(nèi)徑的流路2，使其在所述變性用溫度區(qū)域A和所述復(fù)性用溫度區(qū)域B中交替迂回，分別通過(guò)所述變性用溫度區(qū)域A和所述復(fù)性用溫度區(qū)域B多次，由此可以使該流路2成為具有變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域的流路，所述變性區(qū)域中進(jìn)行使上述作為模板的核酸變性成單鏈的變性反應(yīng)，所述復(fù)性區(qū)域中該形成單鏈的核酸和上述作為引物的核酸退火并進(jìn)行核酸合成反應(yīng)。上述流路的復(fù)性區(qū)域的一部分上在多處設(shè)有填充表面固定化了核酸合成酶的珠粒的珠粒填充部3。此外，上述流路2的兩端設(shè)有用于向該流路內(nèi)注入反應(yīng)液的注入孔2a和用于取出核酸的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束了的反應(yīng)液的取出孔2b。
此外，圖2中表示了上述核酸擴(kuò)增裝置的流路的一部分的放大模式圖，上述珠粒填充部3中填充在珠粒4的表面固定化了核酸合成酶5的固定化核酸合成酶6，使得固定形成成固定化核酸合成酶6的核酸合成酶5能夠與經(jīng)流路移動(dòng)過(guò)來(lái)的反應(yīng)液接觸。將固定化核酸合成酶6填充到流路內(nèi)時(shí)，較好是在珠粒填充部3的入口和出口設(shè)置具有適當(dāng)?shù)目讖降倪^(guò)濾器以使該固定化核酸合成酶6不會(huì)漏出。過(guò)濾器的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，較好是不易吸附核酸，可以優(yōu)選地例舉纖維素等。
使用該核酸擴(kuò)增裝置10時(shí)，通過(guò)泵等外部供液裝置(未圖示)將至少含有模板、引物、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液沿圖中箭頭的方向供液。由此，所述模板在上述流路2的變性區(qū)域通過(guò)熱變性形成單鏈后，在上述流路的復(fù)性區(qū)域進(jìn)行所述單鏈模板和與該模板互補(bǔ)的引物的退火反應(yīng)，再在上述珠粒填充部3通過(guò)固定化核酸合成酶6進(jìn)行所述單鏈模板的互補(bǔ)鏈的合成，分別通過(guò)上述流路的變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域一次進(jìn)行一個(gè)PCR循環(huán)。
本發(fā)明中，上述流路2分別通過(guò)上述基板的變性用溫度區(qū)域和復(fù)性用溫度區(qū)域一次以上，這樣形成即可，為了高效地進(jìn)行核酸擴(kuò)增，較好是通過(guò)20～40次。
此外，上述流路2的大小較好是通過(guò)將孔徑減小、比表面積增大而使得熱傳導(dǎo)容易進(jìn)行，而不產(chǎn)生熱的波動(dòng)(參考Science(1998年)280號(hào)5366卷，1046-1048頁(yè)(Kopp MU，Mello AJ，Manz A.著)。本發(fā)明中的流路寬度為20～200μm，較好是50～100μm，深度為20～200μm，較好是40～100μm。此外填充固定化核酸合成酶6的部分的流路寬度為20～3000μm，較好是50～1000μm，深度為20～1000μm，較好是40～500μm。
形成上述流路2的材質(zhì)較好是熱傳導(dǎo)性較高，在PCR所需的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，不易被電解質(zhì)溶液和有機(jī)溶劑侵蝕，不易吸附核酸和蛋白質(zhì)。例如，具有耐熱性和耐腐蝕性的材質(zhì)除了玻璃、石英、硅，還可以例舉各種塑料，較好是在它們的表面(與反應(yīng)液接觸的表面)用聚乙烯、聚丙烯等被公認(rèn)一般不易吸附核酸和蛋白質(zhì)的材質(zhì)被覆，或以共價(jià)鍵導(dǎo)入聚乙二醇(PEG)等含有大量親水性官能團(tuán)的分子來(lái)抑制核酸和蛋白質(zhì)的吸附。
具有上述流路的基板可以例如如下地形成。即，適當(dāng)采用在1塊由上述材質(zhì)構(gòu)成的基板上通過(guò)切削加工等形成具有上述指定寬度和深度的溝，并粘附另1塊基板或薄膜的方法在所述溝上加蓋。
圖3中表示了本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的另一種實(shí)施方式。該核酸擴(kuò)增裝置20中，圖1所示的基板1a呈分枝狀連接另外的多塊基板1b、1c、1d、1e、1f、1g。這些基板的連接方式并不局限于圖3所示的方式，可以以多種方式連接，使核酸擴(kuò)增可以高效地進(jìn)行。
核酸擴(kuò)增裝置20使用由至少含有上述模板的第1反應(yīng)液和至少含有上述引物、磷酸化合物和金屬離子的第2反應(yīng)液構(gòu)成的反應(yīng)液，通過(guò)泵等外部供液裝置11，首先所述第1反應(yīng)液和所述第2反應(yīng)液分別從第1反應(yīng)液槽14和第2反應(yīng)液槽15供給到基板1a，通過(guò)了所述基板1a的反應(yīng)液通過(guò)外部供液裝置12直接作為模板供給基板1b、1c、1d、1e、1f、1g，同時(shí)為了補(bǔ)充在所述基板1a的反應(yīng)中消耗的引物和磷酸化合物等反應(yīng)底物，從第2反應(yīng)液槽15供給所述第2反應(yīng)液。
而且，通過(guò)了上述基板1b、1c、1d、1e、1f的反應(yīng)液可以直接回收進(jìn)行核酸的純化，根據(jù)需要也可以再連接到多塊基板進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
本實(shí)施方式中，設(shè)有流路7、8和泵13，用于將一部分通過(guò)了上述基板1a的反應(yīng)液和通過(guò)了上述基板1g的反應(yīng)液作為上述第1反應(yīng)液進(jìn)行再利用。通過(guò)設(shè)置這樣的再供液流路，不僅可以防止模板用盡，穩(wěn)定地進(jìn)行連續(xù)的核酸擴(kuò)增，還可以減低運(yùn)行成本。
這樣呈分枝狀地連接基板的情況下，較好是在各段的至少一塊基板、例如分支前的基板(基板1a)和具有將通過(guò)了基板的反應(yīng)液作為第1反應(yīng)液進(jìn)行再利用的具有通路的基板(基板1g)上，固定復(fù)制的可靠性高的核酸合成酶。由此，可以正確地進(jìn)行模板的擴(kuò)增，所以即使重復(fù)進(jìn)行PCR也可以正確地?cái)U(kuò)增模板。
在圖4(a)和(b)中表示了本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置中用于使反應(yīng)液循環(huán)并交替通過(guò)循環(huán)流路內(nèi)的變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域的循環(huán)流路的結(jié)構(gòu)。
圖4(a)所示的循環(huán)流路中，通過(guò)在流路2的指定位置分支的分支流路2c形成循環(huán)流路，向分支流路2c的供液可以通過(guò)控制反應(yīng)液流向的外部供液裝置13a進(jìn)行控制。在流路的分支部進(jìn)入分支流路2c的反應(yīng)液在變性用溫度區(qū)域A通過(guò)循環(huán)流路內(nèi)的變性區(qū)域，從流路的匯集部回到復(fù)性用溫度區(qū)域B，可以在通過(guò)了一次的循環(huán)流路內(nèi)的復(fù)性區(qū)域再一次通過(guò)。
此外，如圖4(b)所示，上述循環(huán)流路也可以將流路2形成環(huán)狀而不具有分支流路。在這里，作為反應(yīng)液的供給、取出部分的反應(yīng)液槽16設(shè)置在環(huán)狀流路2的中途，從所述反應(yīng)液槽16導(dǎo)入的反應(yīng)液通過(guò)外部供液裝置13a沿圖中箭頭的方向在流路2內(nèi)循環(huán)。
通過(guò)反應(yīng)液在上述循環(huán)流路中循環(huán)、反復(fù)交替地通過(guò)上述循環(huán)流路內(nèi)的變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在圖4(a)中可以從流路的出口采集，在圖4(b)中可以從所述反應(yīng)液槽16采集。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置中，如圖5(a)所示，上述基板的變性用溫度區(qū)域和復(fù)性用溫度區(qū)域可以通過(guò)例如在溫度控制裝置33內(nèi)設(shè)置上述基板1而形成，所述溫度控制裝置33具有用隔板38分隔具有變性用溫度控制部件34的恒溫槽31和復(fù)性用溫度控制部件35的恒溫槽32的結(jié)構(gòu)。上述恒溫槽中，為了攪拌恒溫槽內(nèi)的介質(zhì)、保持溫度均一，分別設(shè)置攪拌機(jī)36和37。
此外，如圖5(b)所示，可以層合多塊基板1，在各基板間或每隔數(shù)塊基板之間配置變性用溫度控制部件39和復(fù)性用溫度控制部件40，形成上述基板的變性用溫度區(qū)域和復(fù)性用溫度區(qū)域。
上述變性用溫度控制部件和上述復(fù)性用溫度控制部件可以通過(guò)任何溫度控制裝置來(lái)保持溫度恒定，具體地可以優(yōu)選地例舉電熱元件、恒溫裝置、電熱絲、加熱燈等。此外，上述變性用溫度控制部件和上述復(fù)性用溫度控制部件可以不與基板接觸地配置。
圖6中表示了本發(fā)明的核酸擴(kuò)增裝置的又一種實(shí)施方式。該核酸擴(kuò)增裝置50使用2條毛細(xì)管51作為流路，毛細(xì)管51呈螺旋狀卷曲設(shè)置在具有變性用溫度區(qū)域A和復(fù)性用溫度區(qū)域B的溫度控制裝置52內(nèi)，使其交替地通過(guò)所述變性用溫度區(qū)域和復(fù)性用溫度區(qū)域。
如圖7所示，上述毛細(xì)管51的內(nèi)壁表面直接固定化核酸合成酶5。
上述毛細(xì)管的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，形成其的材質(zhì)較好是熱傳導(dǎo)性較高，在PCR所需的溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，不易被電解質(zhì)溶液和有機(jī)溶劑侵蝕，不易吸附核酸和蛋白質(zhì)，例如可以例舉玻璃、塑料等，較好是在它們的表面(與反應(yīng)液接觸的表面)再用聚乙烯、聚丙烯等被公認(rèn)一般不易吸附核酸和蛋白質(zhì)的材質(zhì)被覆，或以共價(jià)鍵導(dǎo)入聚乙二醇(PEG)等含有大量親水性官能團(tuán)的分子來(lái)抑制核酸和蛋白質(zhì)的吸附。
此外，構(gòu)成所使用的毛細(xì)管的材料也可以是半透性的、具有阻止高分子通過(guò)而透過(guò)低分子的性質(zhì)，這時(shí)通過(guò)使用含有低分子量的底物(例如dNTP和NTP等)的溶液作為設(shè)置該毛細(xì)管的恒溫槽的介質(zhì)，還可以向毛細(xì)管內(nèi)持續(xù)地供給反應(yīng)底物。半透過(guò)性的毛細(xì)管可以優(yōu)選地例舉三菱レ一ョン和東レ等銷(xiāo)售的中空纖維。
本發(fā)明中，上述毛細(xì)管的規(guī)格為，外徑100～1000μm，較好是200～500μm，內(nèi)徑20～600μm，較好是50～150μm。
核酸合成酶向上述毛細(xì)管的內(nèi)壁表面的固定化可以用與上述的固定化核酸合成酶同樣的方法進(jìn)行，在毛細(xì)管的整個(gè)內(nèi)壁表面固定核酸合成酶即可。在毛細(xì)管的整個(gè)內(nèi)壁表面固定化核酸合成酶的情況下，固定化在變性區(qū)域的核酸合成酶通常因加熱等失活而不會(huì)對(duì)核酸合成反應(yīng)產(chǎn)生影響，所以固定化在復(fù)性區(qū)域的核酸合成酶具有活性即可，不存在實(shí)際使用上的問(wèn)題。
若采用這種毛細(xì)管結(jié)構(gòu)，則可以節(jié)省裝填珠粒、僅在特定部位固定化核酸合成酶的工序，制造也變得容易。
實(shí)施例以下，例舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的范圍并不局限于這些
<實(shí)施例1>
(核酸擴(kuò)增裝置的制作)為了如上述就圖1和圖2所說(shuō)明地，得到在一條流路內(nèi)交替設(shè)置多個(gè)變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域的結(jié)構(gòu)，如下地形成流路基板，所述流路基板中，將基板的一個(gè)區(qū)域作為變性用溫度區(qū)域，而另一個(gè)區(qū)域作為復(fù)性用溫度區(qū)域，將一條流路迂回配置在表面，使其交替通過(guò)這些區(qū)域。
即，通過(guò)將聚乙烯注塑成型，制作厚1mm的薄板狀基板(縱35mm×橫70mm)，通過(guò)切削加工在基板表面形成具有表1所示的寬度和深度、在長(zhǎng)度方向上連續(xù)的溝，作為流路基板。這時(shí)，將具有相鄰的一個(gè)變性區(qū)域和一個(gè)復(fù)性區(qū)域的流路部分作為一個(gè)單元。


一個(gè)流路單元的溝的模式圖如圖8所示。在這里，基板的變性用溫度區(qū)域A中作為變性區(qū)域的溝沿流路的長(zhǎng)度為12mm，基板的復(fù)性用溫度區(qū)域B中作為復(fù)性區(qū)域的溝沿流路的長(zhǎng)度為50mm。此外，填充固定化核酸合成酶的流路的寬徑部3a的溝寬度為1000μm，其他部分的溝寬度為200μm。上述聚乙烯基板上通過(guò)切削加工形成的在長(zhǎng)度方向連續(xù)的溝由40個(gè)單元的上述流路單元的溝串聯(lián)構(gòu)成。
另一方面，被填充在上述基板的流路的寬徑部3a的固定化核酸合成酶作如下的調(diào)整。
即，將1g(濕重)平均粒徑100μm的殼聚糖珠粒載體(商品名“キトパ一ルBCW-3001”；富士紡織株式會(huì)社制)在5ml PBS緩沖液(137mM NaCl、8.1mMNa2HPO4、2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4、pH7.2)中于4℃下平衡8小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾除去PBS緩沖液，加入2ml 2.5％戊二醛水溶液，在4℃下活化2小時(shí)。然后，濾去2.5％戊二醛水溶液后，將珠粒用5ml PBS緩沖液洗滌3次。接著，濾去PBS緩沖液后，向珠粒加入1ml作為酶溶液的0.1μg/μl DNA聚合酶·Klenow片斷(タカラバイオ株式會(huì)社制)/PBS緩沖液，在4℃下反應(yīng)2小時(shí)，進(jìn)行固定化。濾去酶溶液，用5ml PBS緩沖液洗滌3次后，用PBS緩沖液調(diào)整成50％漿料狀。
在上述流路基板的珠粒填充部分用微量吸管每個(gè)流路單元滴入、填充2.5μl這樣調(diào)制的固定化核酸合成酶。這時(shí)，可以認(rèn)為固定化核酸合成酶占了珠粒填充部分容積中的大約一半。
上述流路基板形成溝的表面的對(duì)向側(cè)的表面上配置珀耳帖元件作為溫度控制部件。即，將把基板的一定面積作為94℃的變性用溫度區(qū)域所需的珀耳帖元件和把基板的一定面積作為37℃的復(fù)性用溫度區(qū)域所需的珀耳帖元件分別設(shè)置在流路基板的表面上。
為了在上述流路基板的溝上加蓋作為流路，疊上另一塊聚乙烯基板并用夾子夾持，作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)用基板。
另外，將來(lái)自作為供液裝置的高速液相色譜用泵的供液管接合到與上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用基板的流路入口部分連接的連接管上，得到上述核酸擴(kuò)增裝置。
<實(shí)施例2>
(核酸擴(kuò)增反應(yīng))使用實(shí)施例1中制作的核酸擴(kuò)增裝置進(jìn)行PCR反應(yīng)。這時(shí)，將含有以下內(nèi)容物的水溶液作為其反應(yīng)液。
反應(yīng)液模板雙鏈DNA(73對(duì)堿基)10pM正向引物DNA(18個(gè)堿基)1μM反向引物DNA(18個(gè)堿基)1μMdATP、dGTP、dCTP、dTTP 各5μMMgSO410mM二硫蘇糖醇 0.1mMTris-HCl(pH7.2，25℃) 50mM
DNA序列模板雙鏈DNA的正鏈序列編號(hào)1模板雙鏈DNA的負(fù)鏈序列編號(hào)2正向引物DNA序列編號(hào)3反向引物DNA序列編號(hào)4此外，使用在上述反應(yīng)液中不含有模板雙鏈DNA(73對(duì)堿基)的溶液作為對(duì)照。
將反應(yīng)液或?qū)φ杖芤侯A(yù)先在94℃下變性2分鐘后，冷卻至37℃，用供液裝置向上述實(shí)施例1的核酸擴(kuò)增裝置的流路內(nèi)以1μl/min的供液速度供液。在這里，如果考慮到固定化核酸合成酶占用了復(fù)性區(qū)域中的一部分，則配置在上述實(shí)施例1的核酸擴(kuò)增裝置的流路基板上的流路的1個(gè)單元的流路內(nèi)容積中復(fù)性區(qū)域和變性區(qū)域所占的部分的比為大約7∶1。由此，可以認(rèn)為通過(guò)了40個(gè)單元的流路的反應(yīng)液或?qū)φ杖芤合喈?dāng)于重復(fù)了40次PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中包括30秒94℃的變性反應(yīng)、3分30秒37℃的退火/延伸反應(yīng)。
將通過(guò)了40個(gè)單元的流路的反應(yīng)液或?qū)φ杖芤旱囊徊糠峙c導(dǎo)入核酸擴(kuò)增裝置的流路內(nèi)之前的反應(yīng)液和核酸分子量標(biāo)記一起在3％瓊脂糖凝膠(TAE緩沖液40mM Tris、19mM醋酸、1mM EDTA)中電泳，將得到的凝膠用0.5μg/ml溴化乙錠水溶液染色。圖9中表示了UV(302nm)照射時(shí)的照片。圖中，1為導(dǎo)入核酸擴(kuò)增裝置的流路內(nèi)之前的反應(yīng)液電泳的泳道，2為通過(guò)了40個(gè)單元的流路的反應(yīng)液電泳的泳道，3為核酸分子量標(biāo)記(50bp梯)電泳的泳道，4為通過(guò)了40個(gè)單元的流路的對(duì)照溶液電泳的泳道。
由圖9可知，導(dǎo)入核酸擴(kuò)增裝置的流路內(nèi)之前的反應(yīng)液所含的模板雙鏈DNA(73對(duì)堿基)是微量的，沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)(泳道1)。此外，從通過(guò)了40個(gè)單元的流路的對(duì)照溶液也沒(méi)有檢測(cè)出DNA(泳道4)。另一方面，從通過(guò)了40個(gè)單元的流路的反應(yīng)液在核酸分子量標(biāo)記遷移率(泳道3)的70～75對(duì)堿基長(zhǎng)度附近的位置檢測(cè)出了DNA，確認(rèn)反應(yīng)液中的模板雙鏈DNA(73對(duì)堿基)被擴(kuò)增(泳道2)。
序列編號(hào)1作為PCR反應(yīng)模板73個(gè)堿基長(zhǎng)度的模板雙鏈DNA的正鏈序列編號(hào)2作為PCR反應(yīng)模板73個(gè)堿基長(zhǎng)度的模板雙鏈DNA的負(fù)鏈序列編號(hào)3用于擴(kuò)增模板DNA的PCR用正向引物DNA序列編號(hào)4用于擴(kuò)增模板DNA的PCR用反向引物DNA產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明可以使用于模板核酸等的高效的復(fù)制·擴(kuò)增。
權(quán)利要求
1.核酸擴(kuò)增裝置，它是在內(nèi)部具有至少一條流路，在該流路中流過(guò)至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液，在該流路內(nèi)擴(kuò)增核酸的的核酸擴(kuò)增裝置，其特征在于，所述流路同時(shí)具有變性區(qū)域和復(fù)性區(qū)域，所述變性區(qū)域內(nèi)進(jìn)行所述作為模板的核酸的分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈解鏈的變性反應(yīng)，所述復(fù)性區(qū)域內(nèi)所述雙鏈解鏈的作為模板的核酸和所述作為引物的核酸形成雙鏈，核酸合成酶被固定于所述復(fù)性區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸擴(kuò)增裝置，其特征還在于，具有可以加熱上述變性區(qū)域、并且將上述復(fù)性區(qū)域保持在比上述變性區(qū)域低的溫度的溫度控制部件。
3.如權(quán)利要求1或2所述的核酸擴(kuò)增裝置，其特征還在于，所述核酸合成酶被固定在珠粒上，該珠粒至少被填充在所述復(fù)性區(qū)域內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的核酸擴(kuò)增裝置，其特征還在于，所述核酸合成酶至少被固定在所述復(fù)性區(qū)域的內(nèi)壁表面。
5.如權(quán)利要求1～4中的任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增裝置，其特征還在于，在所述流路內(nèi)交互地設(shè)置所述變性區(qū)域和所述復(fù)性區(qū)域。
6.如權(quán)利要求1～5中的任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增裝置，其特征還在于，所述核酸合成酶在30～40℃的溫度范圍內(nèi)具有最適溫度。
7.如權(quán)利要求1～6中的任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增裝置，其特征還在于，具有循環(huán)流路，且該循環(huán)流路具有所述復(fù)性區(qū)域和所述變性區(qū)域的結(jié)構(gòu)。
8.如權(quán)利要求1～7中的任一項(xiàng)所述的核酸擴(kuò)增裝置，其特征還在于，還具有控制反應(yīng)液流向的供液裝置，該供液裝置控制反應(yīng)液的流向周期性地逆轉(zhuǎn)。
9.核酸擴(kuò)增方法，它是用于在至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液中擴(kuò)增作為模板的核酸的方法，其特征在于，包含(a)在指定區(qū)域內(nèi)使所述作為模板的核酸的分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈解鏈的變性步驟；(b)在與步驟(a)不同的區(qū)域，使步驟(a)中得到的該雙鏈解鏈了的作為模板的核酸和所述作為引物的核酸之間形成雙鏈的復(fù)性步驟；(c)在步驟(b)中和/或后，使被固定于包括進(jìn)行步驟(b)的區(qū)域在內(nèi)的區(qū)域的、保持活性狀態(tài)的核酸合成酶與反應(yīng)液接觸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供即使使用不具有耐熱性的核酸合成酶也可以高效地進(jìn)行PCR，核酸合成酶可以再利用，可以提升規(guī)模，而且擴(kuò)增的核酸的分離·純化容易的核酸擴(kuò)增裝置及核酸擴(kuò)增方法。向具有使核酸的分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈解鏈變性為單鏈狀態(tài)的區(qū)域和使該雙鏈解鏈了的核酸再次形成雙鏈的復(fù)性區(qū)域的流路中導(dǎo)入至少含有作為模板的核酸、作為引物的核酸、磷酸化合物和金屬離子的反應(yīng)液，在所述變性區(qū)域使所述作為模板的核酸的分子內(nèi)和/或分子間形成的雙鏈解鏈變性為單鏈狀態(tài)后，在所述復(fù)性區(qū)域使該雙鏈解鏈了的作為模板的核酸和作為引物的核酸之間形成雙鏈，同時(shí)通過(guò)被固定在所述復(fù)性區(qū)域內(nèi)的核酸合成酶進(jìn)行核酸合成。
文檔編號(hào)B01L7/00GK1820067SQ20048001964
公開(kāi)日2006年8月16日 申請(qǐng)日期2004年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者荻原直人 申請(qǐng)人:太陽(yáng)誘電株式會(huì)社