專利名稱：以碳酸鈣微粒懸浮液制備超大孔型剛性高分子介質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超大孔型高分子微球分離介質(zhì)的制備方法，屬于生物大分子分離純化介質(zhì)的制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
液相色譜因?yàn)槠浞蛛x條件溫和、分離效率高而成為一種重要的生物大分子分離純化工具。在生物大分子的液相色譜技術(shù)中，分離介質(zhì)的性能往往起著決定性的作用，因而獲得優(yōu)良性能的分離介質(zhì)一直是重要的研究課題之一。
為了實(shí)現(xiàn)高流速、高容量和高分辨率的分離效果，人們一直嘗試著尋找性能優(yōu)良的色譜介質(zhì)。在上個(gè)世紀(jì)，研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)膜的孔徑達(dá)到0.5μm時(shí)，膜兩端微小的壓差就可以引發(fā)膜孔內(nèi)的對(duì)流傳質(zhì)，這一原理被用于新型色譜介質(zhì)的設(shè)計(jì)中。通過(guò)引入橫穿介質(zhì)的特大孔使溶質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)發(fā)生對(duì)流傳質(zhì)，從而加快孔內(nèi)傳質(zhì)過(guò)程。1989年，Afeyan等人申請(qǐng)了一種雙孔型高分子微球聚合物色譜介質(zhì)的美國(guó)專利(US 5,019,270)。該介質(zhì)具有兩類孔型一類是穿透孔(600～800nm)貫穿于固定相的顆粒中，流體以對(duì)流形式通過(guò)；另一類是擴(kuò)散孔(80～150nm)，其與穿透孔相連組成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，流體以擴(kuò)散的形式通過(guò)。利用該技術(shù)制備的苯乙烯-二乙烯基苯大孔介質(zhì)的操作流速可達(dá)1500cm/h?；谠摻橘|(zhì)的色譜技術(shù)稱為灌注色譜(Perfusion Chromatography，也叫流通色譜)。
隨著生物技術(shù)特別是基因治療技術(shù)的進(jìn)展，對(duì)于核酸等生物大分子的分離越發(fā)顯得重要。核酸分子由于具有較大的直徑而無(wú)法進(jìn)入普通色譜介質(zhì)內(nèi)部，造成了吸附容量的降低。對(duì)于這類生物大分子的分離不僅需要高親和性配基以提高選擇性，更加需要具有較大孔徑的分離介質(zhì)來(lái)增加吸附容量。
Gustavsson和Larsson在《Journal of Chromatography A》第734卷中報(bào)道了以油相(環(huán)己烷)為液體致孔劑，采用油/水/油的雙乳化技術(shù)制備超大孔瓊脂糖軟凝膠介質(zhì)的方法(P.E.Gustavsson and P.O.Larsson.Journal of Chromatography A，1996，743，231-240)。這類超大孔介質(zhì)既保持瓊脂糖軟凝膠介質(zhì)原有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，又具備穿透孔的特性。在此基礎(chǔ)上，Larsson公開了采用雙乳化法獲得超大孔軟凝膠介質(zhì)的專利技術(shù)(US5,723,601)。
Guoyong Sun和Yan Sun等在2004年的《Journal of Chromatography A》第1061卷中發(fā)表的論文以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，采用甘油水溶液和有機(jī)溶劑(甲苯與正庚烷)為致孔劑，懸浮聚合生成兩類孔型的PGED分離介質(zhì)。制得的分離介質(zhì)在3000cm/h下仍有較好的機(jī)械強(qiáng)度和高的動(dòng)態(tài)吸附容量。該技術(shù)已經(jīng)申請(qǐng)了專利(CN 1563122A)。
本專利報(bào)道了一種以碳酸鈣懸浮液為超大孔致孔劑，環(huán)己醇與十二醇為有機(jī)致孔劑，紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)，制備具有超大孔型的剛性介質(zhì)。該介質(zhì)的超大孔大小與介質(zhì)粒徑大小可以通過(guò)乳化過(guò)程調(diào)節(jié)，使操作技術(shù)更加簡(jiǎn)化；制備得到的分離剛性介質(zhì)具有10μm級(jí)的超大孔，對(duì)核酸分子在高流速下(3000cm/h)有較好的機(jī)械強(qiáng)度與高的動(dòng)態(tài)吸附容量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以碳酸鈣微粒懸浮液制備超大孔型剛性高分子介質(zhì)的方法方法。該方法制備的介質(zhì)是一種高機(jī)械強(qiáng)度、高吸附容量和高傳質(zhì)速率且孔徑、孔隙率和粒徑是可控的分離介質(zhì)。
本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的。采用碳酸鈣懸浮液為致孔劑，雙乳化法光引發(fā)懸浮聚合制備兩類孔型剛性介質(zhì)微球。包括碳酸鈣懸浮液的制備、一次乳化液的預(yù)處理與制備、雙乳化反應(yīng)、固化和交聯(lián)過(guò)程、固體微粒中致孔劑的去除過(guò)程，其特征在于，單體甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)按照0.3～3的體積比混合制成聚合物單體溶液中；再將乳化劑司班80、光聚合引發(fā)劑安息香乙醚溶解在上述的聚合物單體溶液中，司班80的濃度為10～100g/L單體溶液，光聚合引發(fā)劑安息香乙醚加入量相當(dāng)于聚合單體體積的0.1～5％；上述溶液混合均勻后，分別加入聚合物單體體積10～100％的有機(jī)致孔劑環(huán)己醇與十二醇，混合均勻；將粒徑分布0.08μm-4.58μm(10％-90％)、密度為2.3-2.6g/mL的碳酸鈣微粒懸浮分散于水溶液中，然后向單體溶液中加入濃度為1～40％的碳酸鈣懸浮液，碳酸鈣懸浮液的加入量為聚合單體體積的10～150％；上述溶液在2000～10000rpm攪拌速度下形成的乳化液加入到濃度為1～200g/L的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，在500～5000rpm攪拌速度下再次攪拌形成二次乳化，PVA水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶1～1∶20；上述乳化液在100～4000rpm轉(zhuǎn)速下采用0.5～4kW紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)成聚合物微球，反應(yīng)時(shí)間為5～30分鐘；微球用無(wú)水乙醇進(jìn)行抽提除去有機(jī)致孔劑，在甘氨酸-鹽酸緩沖溶液中并保持pH3.0達(dá)到6小時(shí)去除碳酸鈣，再用蒸餾水多次清洗并干燥即可得到超大孔型剛性分離介質(zhì)，反應(yīng)在常溫常壓下進(jìn)行。
上述的優(yōu)化條件單體甲基丙烯酸縮水甘油酯與交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯體積比為0.5～0.8，司班80的濃度為25～35g/L單體溶液；有機(jī)致孔劑環(huán)己醇與十二醇體積分別為單體溶液體積的10～100％；碳酸鈣懸浮液的濃度為5～40％，其加入體積為聚合單體體積的80～120％；碳酸鈣懸浮液在聚合物單體中形成乳化液所需轉(zhuǎn)速為5000～8500rpm，二次乳化的攪拌速度為1000～2000rpm；二次乳化的連續(xù)相中PVA的濃度為25～35g/L水溶液，其水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶2～1∶12；聚合反應(yīng)中紫外光的功率為1～2kW，攪拌速度為200～500rpm，反應(yīng)時(shí)間為15～25分鐘。
下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明1、本發(fā)明采用雙乳化技術(shù)形成微球。第一次乳化所用的致孔劑是碳酸鈣懸浮液，選取的乳化劑是司班80，通過(guò)調(diào)節(jié)聚合反應(yīng)過(guò)程中碳酸鈣懸浮液加入量和乳化過(guò)程的轉(zhuǎn)速可以有效地控制介質(zhì)超大孔的數(shù)量和大小，從而獲得較為理想的傳質(zhì)性能；第二次乳化過(guò)程選取的乳化劑是聚乙烯醇(PVA)，它對(duì)體系穩(wěn)定的作用有兩方面的乳化和增加體系粘稠度，類似的也可以選用明膠、阿拉伯膠、黃原膠和瓜爾豆膠等。
2、致孔劑的選擇與添加量。在乳化過(guò)程中連續(xù)相和分散相的粘度是影響乳化液分散均勻度和穩(wěn)定性的重要因素。本發(fā)明將碳酸鈣懸浮液作為致孔劑，通過(guò)采用一定濃度(1～40％)的碳酸鈣懸浮液液使分散相在聚合物單體溶液中獲得較好的穩(wěn)定性。另外碳酸鈣懸浮液可以在單體相中形成的超孔是兩類孔一類為碳酸鈣微粒形成的孔，而另一類為乳化液滴形成的孔，兩類孔可以互為補(bǔ)充，互相貫通，隨著懸浮液中碳酸鈣濃度的變化，兩類孔型介質(zhì)中超大孔的大小與數(shù)目也會(huì)發(fā)生變化；針對(duì)不同目標(biāo)的孔可以選擇不同類型的碳酸鈣，從納米級(jí)到微米級(jí)都可以做為本實(shí)驗(yàn)的致孔劑，高濃度的碳酸鈣懸浮液以碳酸鈣微粒致孔為主，而低濃度的碳酸鈣懸浮液是以乳化液滴致孔為主。
碳酸鈣懸浮液的制備。由于碳酸鈣不能直接懸浮在水中，而且本發(fā)明所用的碳酸鈣為粉末類，針對(duì)這樣的目的，本發(fā)明使用了三種制備方法方法一是將碳酸鈣粉末直接加入到預(yù)先制備含有乳化劑(如Triton 114)的水溶液中，使用震蕩與超聲結(jié)合的方法讓碳酸鈣均勻分散與溶液中，再用離心方法將碳酸鈣沉降下來(lái)，除去上清液，經(jīng)蒸餾水反復(fù)多次清洗后除去乳化劑，就可以得到碳酸鈣懸浮液；方法二將碳酸鈣置于水溶性有機(jī)溶劑(如乙醇、丙酮等)中浸潤(rùn)后，再加入適量蒸餾水，通過(guò)離心除去上清液，再經(jīng)蒸餾水反復(fù)多次清洗后除去水溶性有機(jī)溶劑，得到碳酸鈣懸浮液；方法三是先制備可溶性鈣鹽(氯化鈣、氫氧化鈣)的澄清溶液，再在反應(yīng)器內(nèi)高速攪拌，同時(shí)通入二氧化碳?xì)怏w或加入碳酸鈉(碳酸氫鈉)，就會(huì)生成碳酸鈣的細(xì)小微粒，通過(guò)離心法或沉降法收集就可以得到大量的碳酸鈣懸浮液。
3、有機(jī)致孔劑的選擇與配比。在乳化過(guò)程中連續(xù)相的粘度對(duì)于乳化后乳化狀態(tài)的穩(wěn)定性影響很大，在選擇好單體與交聯(lián)劑的情況下，選擇粘度大的有機(jī)致孔劑對(duì)于乳化效果影響也比較大，本發(fā)明采用環(huán)己醇與十二醇為有機(jī)致孔劑，因?yàn)檫@兩類醇類粘度非常大，并且十二醇較低溫度下還是固態(tài)，這樣的致孔劑加入到單體相中可以增加單體相的粘度，讓乳化狀態(tài)保持的時(shí)間可以達(dá)到更長(zhǎng)時(shí)間。另外有機(jī)致孔劑可以制備出更多的微孔，可以使合成的介質(zhì)比表面積大，吸附容量大。
4、聚合方法的選擇。目前分離介質(zhì)大多采用懸浮熱聚合反應(yīng)，其所需時(shí)間較長(zhǎng)。而本發(fā)明所采用的雙乳化成球的體系很不穩(wěn)定，常規(guī)的熱聚合反應(yīng)成球無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明利用電磁攪拌下的懸浮光引發(fā)聚合生成兩類孔型介質(zhì)微球，反應(yīng)所用光源為紫外線燈，功率是kW級(jí)的，反應(yīng)器位于紫外燈正下方，反應(yīng)液面離紫外線燈約30cm距離。光聚合反應(yīng)比熱聚合反應(yīng)用時(shí)大大縮短，可以加快介質(zhì)微球的制備速度。
5、乳化過(guò)程中轉(zhuǎn)速的控制。本發(fā)明中微球的形成就是靠?jī)纱稳榛纬傻?，第一次乳化的轉(zhuǎn)速影響到兩類孔型介質(zhì)中超大孔的大小及數(shù)目，主要是影響一次乳化過(guò)程中乳化液滴的大小，進(jìn)而影響最后生成介質(zhì)中超大孔的大小與數(shù)目；第二次乳化的轉(zhuǎn)速影響到微球的粒徑分布。本發(fā)明的第一次乳化轉(zhuǎn)速為5000～8500rpm，第二次乳化轉(zhuǎn)速為1000～2000rpm。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，該方法制備的分離介質(zhì)可用于各種液相色譜(包括反相、離子交換、疏水性相互作用、生物親和等色譜)分離填料的基質(zhì)樹脂，因此在大規(guī)模分離生物大分子具有廣闊的前景。


圖1超大孔型剛性介質(zhì)在掃描電子顯微鏡下的照片(5,000×)，圖中暗色部分為超孔與小孔結(jié)構(gòu)
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例將對(duì)本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1稱取10克納米級(jí)碳酸鈣粉末，加入到50mL 1％的Triton 114溶液中，先振蕩10分鐘，再在超聲水浴中混合30分鐘，然后在8000rpm離心10分鐘，倒去上清液后再加入蒸餾水，再離心，如此反復(fù)多次直至Triton 114被除去為止，再定容至50mL，就可以得到20％的碳酸鈣懸浮液。
稱取0.08克安息香乙醚和1.2克司班80溶解到4.5mL甲基丙烯酸縮水甘油脂(GMA)和3.0mL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)混合溶液中；再加入2.5mL環(huán)己醇和1mL十二醇并混合均勻。向混合液中加入8mL的20％的碳酸鈣懸浮液，以8000rpm攪拌5分鐘，在顯微鏡下可以清楚的看到其乳化所形成的小液滴，再將攪拌好的乳化液加入到120mL2％的PVA水溶液中，以1800rpm攪拌1分鐘，然后將整個(gè)混合體系轉(zhuǎn)移到帶有電磁攪拌的反應(yīng)器中，在1kW紫外燈下進(jìn)行懸浮聚合，反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到聚四氟紗袋中，用水多次洗滌，在自然條件下風(fēng)干，再用無(wú)水乙醇抽提24小時(shí)，除去有機(jī)致孔劑與乳化劑，再把反應(yīng)產(chǎn)物懸浮到pH 3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液中6小時(shí)后用蒸餾水多次沖洗除去緩沖液與氯化鈣，真空干燥后得到上述的超大孔型微球介質(zhì)3.0克。稱取1.0克兩類孔型介質(zhì)與5mL二氧六環(huán)和5mL二乙胺進(jìn)行混合，在60℃水浴搖床200rpm反應(yīng)6.5小時(shí)；待反應(yīng)結(jié)束后用蒸餾水多次洗滌介質(zhì)，然后向經(jīng)G3漏斗抽干后的介質(zhì)中加入60mL 0.1mol/L的硼氫化鈉溶液，在25℃水浴搖床200rpm反應(yīng)12小時(shí)；用蒸餾水與無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，充分干燥，得到可以用于生物分離用的陰離子交換兩類孔型剛性分離介質(zhì)。制備好的剛性分離介質(zhì)的體積平均粒徑為46μm的干樹脂，靜態(tài)吸附容量為77.4mgBSA/mg濕樹脂。
實(shí)施例2稱取3.8克氫氧化鈣固體粉末，溶解于足量的水中以制得澄清的氫氧化鈣溶液，把制得的氫氧化鈣溶液加入到帶有攪拌槳的三頸反應(yīng)器中，加高速攪拌邊通入二氧化碳?xì)怏w待反應(yīng)的混濁度不再增加時(shí)就停止通入，然后離心取上清用澄清的氫氧化鈣溶液檢驗(yàn)其上清中是否還含有碳酸氫鈣，若沒有了就可以除去上清液，把沉淀重新懸浮并定容到50mL，就可以得到10％的碳酸鈣懸浮液。
稱取0.08克安息香乙醚和1.5克司班80溶解到4.5mL甲基丙烯酸縮水甘油脂(GMA)，3.0mL二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)中；再加入3mL甲苯和2mL正庚烷混合均勻。向混合液中加入4.5mL的10％的碳酸鈣懸浮液，以8000rpm攪拌5分鐘，在顯微鏡下可以清楚的看到其乳化的小液滴，再將攪拌好的乳化液加入到100mL2％的PVA水溶液中，以1800rpm攪拌1分鐘，然后將整個(gè)混合體系轉(zhuǎn)移到帶有電磁攪拌的反應(yīng)器中，在1kW紫外燈下進(jìn)行懸浮聚合，反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到聚四氟紗袋中，用水洗滌，在自然條件下風(fēng)干，再用無(wú)水乙醇抽提24小時(shí)，除去有機(jī)致孔劑與乳化劑，再把反應(yīng)產(chǎn)物懸浮在甘氨酸-鹽酸緩沖液中保持pH3達(dá)6小時(shí)后用蒸餾水多次洗滌除去緩沖液與氯化鈣，真空干燥后得到上述的兩類孔型微球介質(zhì)3.0克，利用二乙胺修飾分離介質(zhì)，按1.0克分離介質(zhì)與5mL二氧六環(huán)和5mL二乙胺的比例進(jìn)行混合，在60℃水浴搖床200rpm反應(yīng)6.5小時(shí)；待反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水多次洗滌介質(zhì)，向經(jīng)G3漏斗抽干后的介質(zhì)中加入60mL 0.1mol/L的硼氫化鈉溶液，在25℃水浴搖床200rpm反應(yīng)12小時(shí)，用蒸餾水與無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，充分干燥，得到可以用于生物分離用的陰離子交換兩類孔型剛性分離介質(zhì)。制好的分離介質(zhì)的體積平均粒徑為45μm，靜態(tài)吸附容量為70.5mg BSA/mg濕樹脂。
權(quán)利要求
1.一種以碳酸鈣微粒懸浮液制備超大孔型剛性高分子介質(zhì)的方法，該方法包括碳酸鈣懸浮液的制備、一次乳化液的預(yù)處理與制備、雙乳化反應(yīng)、固化和交聯(lián)過(guò)程、固體微粒中致孔劑的去除過(guò)程，其特征在于，單體甲基丙烯酸縮水甘油酯、交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯按照0.3～3的體積比混合制成聚合物單體溶液中；再將乳化劑司班80、光聚合引發(fā)劑安息香乙醚溶解在上述的聚合物單體溶液中，司班80的濃度為10～100g/L單體溶液，光聚合引發(fā)劑安息香乙醚加入量相當(dāng)于聚合單體體積的0.1～5％；上述溶液混合均勻后，分別加入聚合物單體體積10～100％的有機(jī)致孔劑環(huán)己醇與十二醇，混合均勻；將粒徑分布0.08μm-4.58μm、密度為2.3-2.6g/mL的碳酸鈣微粒懸浮分散于水溶液中，然后向單體溶液中加入濃度為1～40％的碳酸鈣懸浮液，碳酸鈣懸浮液的加入量為聚合單體體積的10～150％；上述溶液在2000～10000rpm攪拌速度下形成的乳化液加入到濃度為1～200g/L的聚乙烯醇水溶液中，在500～5000rpm攪拌速度下再次攪拌形成二次乳化，PVA水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶1～1∶20；上述乳化液在100～4000rpm轉(zhuǎn)速下采用0.5～4kW紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)成聚合物微球，反應(yīng)時(shí)間為5～30分鐘；微球用無(wú)水乙醇進(jìn)行抽提除去有機(jī)致孔劑，在甘氨酸-鹽酸緩沖溶液中并保持pH3.0達(dá)到6小時(shí)去除碳酸鈣，再用蒸餾水多次清洗并干燥即可得到超大孔型剛性分離介質(zhì)，反應(yīng)在常溫常壓下進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于單體甲基丙烯酸縮水甘油酯與交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯體積比為0.5～0.8，司班80的濃度為25～35g/L單體溶液；有機(jī)致孔劑環(huán)己醇與十二醇體積分別為單體溶液體積的10～100％；碳酸鈣懸浮液的濃度為5～40％，其加入體積為聚合單體體積的80～120％；碳酸鈣懸浮液在聚合物單體中形成乳化液所需轉(zhuǎn)速為5000～8500rpm，二次乳化的攪拌速度為1000～2000rpm；二次乳化的連續(xù)相中PVA的濃度為25～35g/L水溶液，其水溶液體積與聚合單體體積之比為1∶2～1∶12；聚合反應(yīng)中紫外光的功率為1～2kW，攪拌速度為200～500rpm，反應(yīng)時(shí)間為15～25分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以碳酸鈣微粒懸浮液制備超大孔型剛性高分子介質(zhì)的方法。該方法包括配制碳酸鈣懸浮液作為超大孔致孔劑，將單體甲基丙烯酸縮水甘油脂、光引發(fā)劑安息香乙醚、乳化劑司班80和交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯形成均勻的混合液，再將碳酸鈣懸浮液致孔劑分散于混合溶液中形成乳化液；此乳化液在聚乙烯醇水溶液中形成二次乳化；整個(gè)體系在一定轉(zhuǎn)速下通過(guò)紫外光引發(fā)懸浮聚合反應(yīng)；反應(yīng)后，體系經(jīng)水和無(wú)水乙醇反復(fù)清洗獲得具有超大孔和擴(kuò)散孔兩類孔型結(jié)構(gòu)的色譜分離介質(zhì)。該方法制備的分離介質(zhì)可用于包括反相、離子交換、疏水性相互作用、生物親和等各種液相色譜分離填料的基質(zhì)樹脂，因此在大規(guī)模分離生物大分子具有廣闊的前景。
文檔編號(hào)B01J20/26GK1695795SQ200510013278
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者孫彥, 孫國(guó)勇, 董曉燕, 白姝, 史清洪 申請(qǐng)人:天津大學(xué)