專利名稱：生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從乳原料生產(chǎn)高純度乳過氧化物酶(lactoperoxidase)的方法。本發(fā)明要求2004年2月17日提交的日本專利申請No.2004-039704的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容并入本文作為參考。
背景技術(shù)：
乳過氧化物酶是一種氧化還原酶，其包含在哺乳動物乳液如牛乳，和其它分泌物如唾液(saliva)、淚液(lacrymal fluid)和呼吸道粘液(respiratory tractmucus)中(例如，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，U.S.A.Vol.166，2002，p.S57至S61)。乳過氧化物酶是分子量約80,000的蛋白質(zhì)。乳過氧化物酶具有血紅素(heme)作為每一個分子的輔酶。由于此血紅素的最大吸收波長(maximum absorption wavelength)為大約412nm，高度純化的乳過氧化物酶顯褐色(例如，British Journal of Nutrition，England，Vol.84，2000，p.S19至S25)。
據(jù)報道，乳過氧化物酶具有各種生物學(xué)功能諸如抗細(xì)菌性質(zhì)(antibacterialproperty)、抗病毒活性(antiviral activity)、抗氧化活性(antioxidative activity)、抗癌活性(anticancer activity)和免疫調(diào)節(jié)活性(immunoregulatory activity)(例如，所述的British Journal of Nutrition，England，Vol.84，2000，p.S19至S25和Life Sciences，England，Vol.43，1988，p.739至745)，而且已顯示這是一種與宿主防御(host defense)有關(guān)的非常重要的蛋白質(zhì)。關(guān)于所述乳過氧化物酶的工業(yè)應(yīng)用，有公開的技術(shù)如乳過氧化物酶、過氧化物供體和硫氰酸鹽(thiocyanate)在制造治療幽門螺旋桿菌(helicobacter pylori)感染的藥物中的用途(例如，PCT公開的日文文本No.2000-509367)；加入培養(yǎng)的水生動物的配合飼料中的病原菌傳染病預(yù)防和治療劑(例如，日本專利No.3103615)；老化預(yù)防劑(例如，日本專利No.3103167)；肝功能改善劑(hepatic function ameliorative agent)(例如，未審查的日本專利申請，第一次公開No.2001-226289)，過氧化物酶的預(yù)防和治療應(yīng)用(例如，PCT公開的日文文本No.H06-501453)；和用于角膜疾病的治療劑(例如，日本專利No.2840795)。此外，有本發(fā)明人公開的技術(shù)如脲酶-失活組合物和飲料(例如，未審查的日本專利申請，第一次公開No.2002-238554)，和腸內(nèi)菌叢(intestinal flora)改進(jìn)劑和食品和飲料(例如，未審查的日本專利申請，第一次公開No.2003-246753)。
在Acta Chemica Scandinavica，Denmark，Vol.23，1969，p.171至184；FEBSLetters，Holland，Vol.110，1980，p.200至204；和Journal of Chromatography，Holland，Vol.795，1998，p.277至287中報道了以實驗室規(guī)模純化過氧化物酶的方法。
作為其通常方法，有如下已知方法將酸如氫氯酸加入乳，進(jìn)行等電點沉淀酪蛋白，以便于制備作為上清液的乳清；將得到的乳清與陽離子交換劑接觸，以將乳清中帶正電荷的乳過氧化物酶吸附到該陽離子交換劑中；接著，用低鹽緩沖溶液洗滌此陽離子交換劑，然后用高鹽緩沖溶液將乳過氧化物酶解吸。
在實驗室規(guī)模的純化方法中，為了改進(jìn)乳過氧化物酶純度，通常使用如下方法使用以具有小直徑粒子的凝膠形式的陽離子交換劑高密度填充的柱子，和用高壓泵實施高速通過(例如，Journal of Chromatography，Holland，Vol.795，1998，p.277至287)。
在另一方面，如果用具有相對大直徑粒子的陽離子交換劑填充柱子，并通過自然滴落而不用高壓泵實施通過，則花費較多的時間(例如，Acta ChemicaScandinavica，Denmark，Vol.23，1969，p.171至184，和FEBS Letters，Holland，Vol.110，1980，p.200至204)。
連同工業(yè)規(guī)模的分離技術(shù)中近來的進(jìn)展，可能分離并純化包含在乳中的高純度生物活性物質(zhì)用于大規(guī)模生產(chǎn)(mass production)。在大多數(shù)情況中，實際上難以將在實驗室規(guī)模優(yōu)化的蛋白質(zhì)純化方法按照原樣放大到工業(yè)規(guī)模。一個主要的原因是實驗室中通常使用的離子交換劑或柱的性能不是必然適于原材料的大規(guī)模處理。
此外，由于將添加劑加入乳原料易于改變?nèi)榈奈兜篮臀锢硇再|(zhì)，因此使用添加劑來從乳原料中純化蛋白不是優(yōu)選的。此外，如果使用大量的添加劑以洗滌陽離子交換劑和/或從該陽離子交換劑解吸蛋白質(zhì)，那么需要從純化的蛋白質(zhì)中去除這些添加劑，因而生產(chǎn)過程變得復(fù)雜。
作為在從乳原料生產(chǎn)高純度蛋白質(zhì)中解決這些問題的生產(chǎn)方法，本申請人已提出了用于生產(chǎn)高純度牛乳鐵蛋白的方法(例如，已審查的日本專利申請，第二次公開No.H06-13560)關(guān)于乳過氧化物酶的工業(yè)生產(chǎn)方法，公開了如下方法在美國專利No.4667018的說明書中，公開了用于從乳或其乳衍生物中純化蛋白如乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的方法。在此方法中，公開了如下方法將乳或其乳衍生物與包含陽離子多糖的陽離子交換劑接觸；用低鹽溶液洗滌該陽離子交換劑；然后用高鹽溶液從陽離子交換劑解吸蛋白質(zhì)。然而，由于在此專利文獻(xiàn)中描述的方法中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以混合物獲得，所以純度不高，而且存在不能生產(chǎn)高純度乳過氧化物酶的問題。
在日本專利No.2985158中，公開了回收具有高活性的乳烴素級分(lactenin fraction)的方法。在此專利文獻(xiàn)描述的此方法中，由于乳過氧化物酶作為構(gòu)成乳烴素的一種組分獲得，并包含在蛋白質(zhì)混合物中，所以也存在不能生產(chǎn)高純度乳過氧化物酶的問題。
在歐洲專利No.0518448的說明書中，作為從乳中分離蛋白質(zhì)的方法，公開了使用金屬螯合物載體(metal chelate carrier)的方法。在此方法中，由于分離的蛋白質(zhì)是包含免疫球蛋白、乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的混合物，所以存在不能生產(chǎn)高純度乳過氧化物酶的問題。
在日本專利No.3403066中，公開了從乳或乳衍生物中回收細(xì)胞增殖因子或含有一種或多種類型的細(xì)胞增殖因子的組合物的方法。然而，由于在此方法中得到的組合物是混合物，因此也存在該方法不能生產(chǎn)高純度乳過氧化物酶的問題。
在日本專利No.2710283中，作為從乳清(whey)中選擇性提取金屬蛋白的方法，公開了包括以下步驟的方法將乳清與用含有羧基或磺酸基的葡聚糖涂覆的無機(jī)多孔粒子(二氧化硅粒子)接觸。此方法中生產(chǎn)的乳過氧化物酶的純度最高為大約50％，并且存在的問題是為了產(chǎn)生高純度乳過氧化物酶，需要通過另一個步驟增加純度。
在日本專利No.2553180中，公開了從乳清中提取乳過氧化物酶和乳鐵蛋白的純級分的方法。在此方法中，作為解決由陽離子交換劑的體積變化而引起的堵塞問題的手段，使用微濾的乳清作為乳原料。在此方法中，由于除了乳清之外不能使用其它乳原料，所以存在應(yīng)用范圍窄的問題。此外，也要求將微濾作為乳原料的預(yù)處理，這使生產(chǎn)步驟變得復(fù)雜。而且，將強(qiáng)陽離子交換劑作為陽離子交換劑，而且乳過氧化物酶和乳鐵蛋白被具有不同鹽濃度的緩沖溶液選擇性解吸。此方法要求，為了洗滌陽離子交換劑和選擇性解吸蛋白質(zhì)，需要調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH，因此使用大量的添加劑來制備所述的緩沖溶液。而且，存在各種問題以至于必需從純化的蛋白質(zhì)中去除添加劑，這成為進(jìn)一步使步驟復(fù)雜的因素。
在日本專利No.2686831中，公開了使用強(qiáng)陽離子引入磺基的多糖親和性載體(strongly cationic sulfone group-introduced polysaccharides affinity carrier)作為陽離子交換劑來分離和純化鐵結(jié)合蛋白的方法。在此方法中，產(chǎn)生了相對高度純化(純度85％)的乳過氧化物酶。然而，洗滌吸附處理之后的陽離子交換劑步驟中，用pH調(diào)節(jié)至5或更低的緩沖溶液進(jìn)行洗滌處理是必須的。而且，為了選擇性解吸乳過氧化物酶和乳鐵蛋白，需要具有各自不同的鹽濃度的pH 5或更低的緩沖溶液。
在未審查的日本專利申請，第一次公開No.H05-202098中，作為從乳原料中生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的方法，公開了可以使用具有磺基的強(qiáng)陽離子交換劑和具有羧基的弱陽離子交換劑中任一種的方法。然而，在此方法中，還存在需要pH5或更低的緩沖溶液以在吸附處理后能夠洗滌陽離子交換劑并選擇性解吸乳過氧化物酶的問題。
在美國專利No.5596082中，公開了從乳和乳制品中分離乳鐵蛋白和乳過氧化物酶的方法，在此專利中，為了使得以高流速通過乳和乳制品，將具有大直徑粒子的物理穩(wěn)定的凝膠用作陽離子交換劑。在此方法，也存在需要使用緩沖溶液調(diào)節(jié)pH以在吸附處理后洗滌陽離子交換劑并選擇性解吸乳過氧化物酶的問題。由于此專利中沒有生產(chǎn)的乳過氧化物酶純度的描述，所以不確定是否能夠生產(chǎn)高度純化的乳過氧化物酶。
如上所述，在生產(chǎn)乳過氧化物酶的大多數(shù)常規(guī)方法中，從乳原料回收的乳過氧化物酶是作為其與其它蛋白質(zhì)的混合物得到，而純度并不是足夠高。而且，為了增加乳過氧化物酶的純度，需要其它純化步驟，于是為此需要時間和生產(chǎn)成本。
而且，即使在乳過氧化物酶的純度相對較高的生產(chǎn)方法中，還存在需要以下問題在各步中調(diào)節(jié)pH以選擇性吸附乳原料中含有的乳過氧化物酶，洗滌該陽離子交換劑，和選擇性解吸蛋白質(zhì)，從而需要使用大量添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過認(rèn)真地研究，從而解決了上述問題。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一種方法，其通過使用離子交換方法和超濾膜方法進(jìn)行處理步驟，能夠直接從乳原料工業(yè)化生產(chǎn)高純度乳過氧化物酶，而在全部生產(chǎn)步驟中不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，并由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其包括步驟(1)將一種或多種乳原料與具有弱酸性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的陽離子交換劑接觸，由此實現(xiàn)吸附處理；步驟(2)洗滌所述吸附處理之后的陽離子交換劑；步驟(3)將所述洗滌的陽離子交換劑與洗脫乳過氧化物酶的浸出溶劑接觸，由此得到乳過氧化物酶洗脫進(jìn)入所述浸出溶劑的浸出溶液；步驟(4)通過超濾膜濃縮所述浸出溶液，由此實現(xiàn)在濃縮的浸出溶液中的沉淀；和步驟(5)通過從濃縮的浸出溶液中去除沉淀得到乳過氧化物酶溶液。
具體實施例方式
下面是本發(fā)明優(yōu)選實施例的詳述。然而，本發(fā)明不限于如下優(yōu)選的實施例，并且可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)自由地改變。
本發(fā)明考慮了常規(guī)技術(shù)的問題和情況，旨在提供生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其能夠以比常規(guī)方法更簡單的步驟，用更短的時間，更低的成本生產(chǎn)高度純化的乳過氧化物酶，同時防止由于使用添加劑所引起的乳原料組成和質(zhì)量的變化，而且其能以工業(yè)規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。
下面是本發(fā)明中優(yōu)選的條件和獲得效果的說明。
在本發(fā)明中，當(dāng)將10ml的陽離子交換劑置于1kg未加熱的脫脂乳中時，優(yōu)選該陽離子交換劑的乳鐵蛋白吸附能力為85mg/10ml或更多。
離子交換基團(tuán)優(yōu)選羧甲基。
在步驟(4)中，優(yōu)選進(jìn)行濃縮以使浸出溶液中的蛋白質(zhì)含量變?yōu)?.9至15％，由此實現(xiàn)沉淀。
優(yōu)選在步驟(3)中使用的浸出溶劑的離子強(qiáng)度為0.07至0.3。
優(yōu)選在步驟(3)中使用的浸出溶劑是含有選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂中至少一種鹽的水溶液。
優(yōu)選還提供通過去除在所述步驟(5)中得到的乳過氧化物酶溶液的溶劑來獲得固體乳過氧化物酶的步驟。
優(yōu)選在上述步驟中得到的固體乳過氧化物酶的純度是80％或更多。
在本發(fā)明中，當(dāng)吸附入陽離子交換劑的乳過氧化物酶被洗脫至浸出溶劑時，得到了該乳過氧化物酶與其它級分(雜質(zhì))的混合物。然后，當(dāng)使用超濾膜進(jìn)行濃縮時，將其它級分(雜質(zhì))選擇性地分離并通過溶解度的差異去除。結(jié)果，可得到高純度的乳過氧化物酶。
因此，根據(jù)本發(fā)明，可得到如下效果。
(1)可選擇性地回收乳過氧化物酶，而不經(jīng)過需要調(diào)節(jié)pH的步驟。
(2)可通過簡單的步驟，更短時間和更低成本生產(chǎn)高純度乳過氧化物酶。
(3)由于不需要緩沖溶液和大量添加劑，從而降低了成本，這點是有利的。
(4)可防止由于使用添加劑而引起的乳原料組成和質(zhì)量的改變。
(5)可容易地應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模。
(6)可廣泛地應(yīng)用除乳清之外的乳原料作為與陽離子交換劑接觸的原料。
下面是本發(fā)明的優(yōu)選實施例的更詳細(xì)的說明。
關(guān)于本說明書中蛋白質(zhì)含量，通過Kjeldahl方法測定樣品中的氮含量并表示為使用氮/蛋白轉(zhuǎn)換因子6.38轉(zhuǎn)換的百分比。
而且，通過高效液相色譜(HPLC)分析乳過氧化物酶的純度，并表示為乳過氧化物酶的峰面積相對于由樣品中的蛋白質(zhì)得到的總峰面積的比率(百分比)。
在本說明書中，除上述的蛋白質(zhì)含量和純度之外的百分比，除非具體說明，都是基于質(zhì)量得到。
作為能夠用于本發(fā)明的乳原料，可使用至少含有乳過氧化物酶的任何乳原料。例如，由哺乳動物如人、奶牛、水牛、綿羊、山羊和馬得到的乳、脫脂乳、乳清等等。其中，優(yōu)選使用在輕微熱處理條件下處理的或未加熱的乳原料。而且，可使用含有溶于水或緩沖溶液的脫脂奶粉、全脂奶粉、乳清粉、乳清蛋白濃縮物(whey protein condensate，WPC)、乳清蛋白分離物(wheyprotein isolate，WPI)等的溶液。此外，可使用已通過等電點沉淀或通過凝乳酶去除酪蛋白的上清液，或生產(chǎn)乳酪時排出的乳酪乳清。可使用這些乳原料，甚至無需通過澄清器或通過如微濾和過濾等操作預(yù)先除去沉淀。
在本發(fā)明中，具體地，優(yōu)選使用源自奶牛的乳原料作為乳原料而生產(chǎn)牛乳過氧化物酶。
可單獨使用乳原料，或可組合使用其多種類型。
下面將描述本發(fā)明的生產(chǎn)方法。
(1)首先，將乳原料與陽離子交換劑接觸由此實現(xiàn)吸附處理。使用具有弱酸性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的陽離子交換劑。作為弱酸性離子交換基團(tuán)，可選擇在可作為具有預(yù)期目的的合適離子交換基團(tuán)起作用的基團(tuán)范圍內(nèi)可選的任何離子交換基團(tuán)。弱酸性離子交換基團(tuán)的實例包括羧基、羧甲基、酚基(phenol group)等。優(yōu)選羧甲基。
所述陽離子交換劑無具體限制，并可根據(jù)需要任意選擇。優(yōu)選的陽離子交換劑的實例包括含有交聯(lián)的多糖(諸如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素)的多孔粒子，親水性硅膠、合成的聚合物等等，它們引入有弱酸性離子交換基團(tuán)。作為其具體實例，可優(yōu)選使用SEPABEADS FP-CM13(交換基團(tuán)羧甲基，由Mitsubishi Chemical Corporation制備)、CM-Sephadex C-50(交換基團(tuán)羧甲基，由Amersham plc.制備)和CM-Sepharose-FF(交換基團(tuán)羧甲基，由Amershamplc.制備)。
所述陽離子交換劑的形狀、大小、表面條件、材料等是任選的，并可根據(jù)需要選擇。使用方式的實例包括已經(jīng)填充了離子交換劑的樹脂的預(yù)填充柱(pre-packed column)，和介質(zhì)(medium)如其中填充陽離子交換劑的樹脂珠的柱子。在這些情況中，從方便的觀點出發(fā)，優(yōu)選將一種類型的陽離子交換劑與一個容器組合使用。然而，根據(jù)需要，可將多個分別填充樹脂珠的容器串聯(lián)或并聯(lián)以進(jìn)行層析。容器的形狀可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。然而，優(yōu)選地，形狀容易洗滌并提供很多與包含的樹脂珠等的接觸面，而且內(nèi)壁優(yōu)選具有光滑的表面而無凹凸不平。具體地，可優(yōu)選使用具有圓形面如管狀(圓筒狀和桿狀)和圓錐狀作為容器的形狀?？扇我膺x擇容器的材料，然而，可優(yōu)選使用不銹鋼、玻璃、聚丙烯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙酯(polyethylene terephthalate)、聚碳酸酯、丙烯酸類樹脂(acrylic resin)等。可根據(jù)處理的規(guī)模適當(dāng)?shù)剡x擇容器的大小，并可以任意選擇從諸如幾立方厘米到幾立方米的規(guī)模。可優(yōu)選用于本發(fā)明的商業(yè)可得到的預(yù)填充柱包括HIPREP 10/16CM FF(交換基團(tuán)羧甲基，由Amersham plc.制備)，和CM-TOYOPEARLPAK650系列(交換基團(tuán)羧甲基，由Tosoh Corporation制備)。
在此，為了提高乳過氧化物酶的回收率，優(yōu)選地在如下步驟中，當(dāng)將吸附處理之后的陽離子交換劑與浸出溶劑接觸時，吸附入陽離子交換劑的蛋白質(zhì)容易解吸并洗脫至浸出溶劑中。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選乳原料中的蛋白質(zhì)不是強(qiáng)烈結(jié)合于陽離子交換劑。在具有強(qiáng)酸性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的陽離子交換劑中，離子交換基團(tuán)在寬的pH范圍內(nèi)解離。在另一方面，在具有強(qiáng)酸性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的陽離子交換劑中，電荷根據(jù)pH變化。結(jié)果，其具有改變蛋白結(jié)合能力的性質(zhì)，并因此適用于本發(fā)明的生產(chǎn)方法。在本發(fā)明中，可限定酸解離常數(shù)小于3的離子交換基團(tuán)為強(qiáng)酸性基團(tuán)，酸解離常數(shù)大于或等于3的離子交換基團(tuán)為弱酸性基團(tuán)。強(qiáng)酸性基團(tuán)的實例包括磺酸基，而弱酸性基團(tuán)的實例包括羧甲基。
而且，用于本發(fā)明的陽離子交換劑的多孔性和吸附性的數(shù)值范圍可以任意選擇。此外，對具有與乳過氧化物酶近似相同的等電點和分子量的蛋白質(zhì)(具體為具有70至90kDa的分子量和7至9的等電點的蛋白質(zhì))的吸附能力可表示為指標(biāo)(index)。其中，關(guān)于乳鐵蛋白(分子量大約80kDa和等電點大約8)的吸附能力優(yōu)選表示為指標(biāo)?？赏ㄟ^例如，已審查的日本專利申請，第二次公開No.H06-13560中描述的方法得到相對于乳鐵蛋白的陽離子交換劑的吸附能力。
即，將鈉型陽離子交換劑用水溶脹以得到10ml，然后將其置于1kg的未加熱的脫脂乳(pH6.7)。在4℃將其混合的溶液攪拌16小時。然后，制備性分離該陽離子交換劑并用水洗滌。將洗滌的陽離子交換劑與150ml 10％濃度的氯化鈉水溶液接觸，以便于將乳鐵蛋白從該陽離子交換劑中洗脫入氯化鈉水溶液。通過此洗脫得到的收集物(collectate)中的乳鐵蛋白質(zhì)含量通過Lowry方法(Analytical Biochemistry，U.S.A.Vol.15，1966，p.45至52)測定，并由此計算吸附能力(單位mg/10ml)。
通過選擇具有由上述方法測定的較高乳鐵蛋白吸附能力的陽離子交換劑，可以增加通過本發(fā)明的方法回收的乳過氧化物酶的量。即，當(dāng)根據(jù)上述方法將10ml的陽離子交換劑置于1kg的未加熱脫脂乳中時，優(yōu)選具有70mg或更高的乳鐵蛋白吸附能力的陽離子交換劑，更優(yōu)選具有85mg或更高的乳鐵蛋白吸附能力的陽離子交換劑，而且甚至更優(yōu)選具有90mg或更高的乳鐵蛋白吸附能力的陽離子交換劑。吸附能力的值優(yōu)選較高。通常，1kg乳中乳鐵蛋白質(zhì)含量為大約100mg，而能夠吸附其總量的陽離子交換劑是理想的。具體地，上述SEPABEADS FP-CM13的乳鐵蛋白吸附能力85mg/10ml，而CM-Sephadex C-50的乳鐵蛋白吸附能力91mg/10ml，它們都是顯示高乳鐵蛋白吸附能力的陽離子交換劑。
可以任意選擇乳原料和陽離子交換劑的吸附處理(接觸)?？赏ㄟ^諸如批式攪拌方法(batch stirring method)和柱連續(xù)方法等方法進(jìn)行所述的吸附處理。只要乳原料和陽離子交換劑能夠充分地相互接觸，就可以進(jìn)行任何處理。可進(jìn)行一種處理，或可組合進(jìn)行多種吸附處理。
在批式處理的情況中，在希望從一定量乳原料中獲得高產(chǎn)率的情況時，使用大量陽離子交換劑是合適的；在希望從一定量陽離子交換劑中獲得高產(chǎn)率的情況時，使用大量乳原料是合適的。在批式處理中，可根據(jù)陽離子交換劑的吸附能力和/或吸附處理的具體方法來任意調(diào)節(jié)乳原料和陽離子交換劑的混合體積比。
在此，陽離子交換劑的性質(zhì)主要分為兩種類型硬型和軟型。在本發(fā)明中，可使用任一種類型。
在硬型中，離子交換劑本身的體積由于離子強(qiáng)度或pH而難以改變。而且，即使陽離子交換劑上的壓力由于流速等的變化而改變，陽離子交換劑本身的體積也難以改變。因此，硬型更適于柱連續(xù)方法，其中陽離子交換劑被保持在柱子中，并且以高流速流過。
在另一方面，在軟型陽離子交換劑中，離子交換劑本身的體積由于離子強(qiáng)度或pH而大幅變化。而且，如果陽離子交換劑上的壓力由于流速等的變化而改變時，陽離子交換劑本身的體積容易改變。因此，將軟型陽離子交換劑保持在柱中并以高流速流過是困難的。具體地，在將脫脂乳、乳清等流過的情況中，與將其它鹽溶液等流過的情況相比，在陽離子交換劑層中導(dǎo)致較大的壓力損失。因此，軟型陽離子交換劑適于批式方法。
SEPABEADS FP-CM13(由Mitsubishi Chemical Corporation制備)是硬型，而CM-Sephadex C-50(由Amersham plc.制備)是軟型。
關(guān)于乳原料和陽離子交換劑的吸附處理的溫度，考慮到如果溫度低于0℃，那么粘度增加或乳原料凍結(jié)，而當(dāng)溫度超過60℃時，乳過氧化物酶有可能變性。因此，優(yōu)選在0℃-60℃的范圍內(nèi)進(jìn)行所述的處理。即使溫度為25℃-60℃，在需要長時間吸附等情況中，乳過氧化物酶有可能逐漸變性。因此，所述處理優(yōu)選具體在0℃至25℃進(jìn)行。而且，如果使用未加熱的乳原料，要求0℃至10℃進(jìn)行所述處理以便于防止細(xì)菌繁殖。
關(guān)于乳原料和陽離子交換劑的吸附處理的時間(接觸時間)，考慮到在吸附處理的時間的溫度，將采用的吸附處理的方法(批式或柱連續(xù)方法)等可適當(dāng)?shù)剡x擇條件。例如，在批式的情況中，乳原料和陽離子交換劑的吸附處理的時間優(yōu)選為1分鐘以上但24小時以下，而且更優(yōu)選10分鐘以上但6小時以下。而且，在柱連續(xù)方法的情況中，線性流速優(yōu)選為10cm/h以上但1000cm/h以下。
(2)其次，洗滌吸附處理之后的陽離子交換劑。至于此時的洗滌液，考慮到生產(chǎn)成本優(yōu)選用水洗滌，雖然可能使用離子強(qiáng)度低于0.07的低鹽水溶液，或在中性或弱酸性區(qū)的緩沖溶液。
對于吸附處理之后的陽離子交換劑，可通過任何方法洗滌并去除使用的乳原料。例如，可以只將陽離子交換劑從含有乳原料和陽離子交換劑的容器中轉(zhuǎn)移，然后在另一處洗滌該陽離子交換劑，或者可以只將乳原料從該容器中轉(zhuǎn)移，然后在該容器中洗滌陽離子交換劑。
(3)然后，將洗滌的陽離子交換劑與浸出溶劑接觸。結(jié)果，將乳過氧化物酶從陽離子交換劑洗脫入浸出溶劑，并得到浸出溶液。
在此步驟中使用的浸出溶劑的離子強(qiáng)度優(yōu)選為0.07以上但0.3以下，更優(yōu)選0.10以上但0.25以下，并甚至更優(yōu)選0.15以上但0.22以下的范圍內(nèi)。通過使用具有上述范圍內(nèi)的離子強(qiáng)度的浸出溶劑，可有效地從陽離子交換劑洗脫入過氧化物酶。
至于浸出溶劑，也可以使用在離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)至上述范圍內(nèi)的中性或弱酸性區(qū)的緩沖溶液?？紤]到生產(chǎn)成本，更優(yōu)選地，可使用只溶解了鹽的水溶液(鹽溶液)。關(guān)于可在本申請中使用的鹽，可任意選擇一種類型或多種類型的組合。
優(yōu)選的鹽溶液是下述鹽的水溶液，所述的鹽包含選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等中的一種，或者多種類型的混合物。
(4)然后，使用經(jīng)過超濾膜的膜分離方法，對得到浸出溶液進(jìn)行膜處理。結(jié)果，將浸出溶液濃縮從而實現(xiàn)該浸出溶液中的沉淀。
超濾膜的操作方法可分為如下兩種讓水和分子量不大于目標(biāo)分子量的組分分離、滲透以將其去除的正常超濾方法，和連續(xù)操作同時將與已滲透穿過膜的滲透物質(zhì)等量的水加入膜上的保留物(retentate)中的補(bǔ)給水過濾方法(滲濾(diafiltration))。兩種方法都可用于本發(fā)明。具體地，后者補(bǔ)給水過濾方法從可在濃縮的同時進(jìn)行脫鹽，并可將低分子量組分從保留物中去除至較高程度這一點來說是優(yōu)選的。
當(dāng)使用前者正常超濾方法時，優(yōu)選在超濾之后通過如透析和凝膠過濾的方法進(jìn)行脫鹽。
對于超濾膜，可使用任何商業(yè)可得到的超濾膜。其具體實例包括IRIS3038膜、IRIS3072膜(兩種都由Rhone-Poulenc S.A.制備)和GR-61pp膜(由DDS Inc.制備)。
對于超濾膜的材料，可使用有機(jī)材料或無機(jī)材料，并且可考慮成本、通用性(generality)等來選擇。
在超濾處理時的浸出溶液的溫度是可行的，只要其不大于所使用的膜的耐熱溫度(heat resisting temperature)(例如，在GR-61pp膜的情況下為80℃或更低)。然而，如果溫度為60℃或更高，乳過氧化物酶可能變性，而且細(xì)菌繁殖在10-60℃的范圍內(nèi)往往是顯著的。因此，優(yōu)選在0-10℃的范圍內(nèi)進(jìn)行。
關(guān)于超濾時的壓力，任何壓力都是可能的，只要其不大于所使用的膜的耐壓極限(pressure prooflimit)(例如，在GR-61pp膜的情況下為0.6MPa或更低)。由于在耐壓極限值附近的使用可能縮短膜的壽命，優(yōu)選可在2/3的耐壓極限或更低的壓力(例如，在GR-61pp膜的情況下為0.4MPa或更低)進(jìn)行超濾。
對于所使用的超濾膜的組件，可能為任何類型，如管型、中空纖維型、平膜型和螺旋型。然而，在如內(nèi)壓力型的中空纖維型組件的組件中，如果沉淀在中空纖維內(nèi)產(chǎn)生，那么通道也許可能被堵塞，并由此，優(yōu)選考慮壓力等來進(jìn)行超濾。
在步驟(3)中得到的浸出溶液優(yōu)選為澄清的褐色溶液。而且，當(dāng)將此浸出溶液通過超濾膜濃縮時，由于蛋白質(zhì)溶解度的差異，除乳過氧化物酶之外的蛋白質(zhì)被沉淀為超濾膜上保留物中的沉淀。在此，為了有效沉淀除乳過氧化物酶之外的蛋白質(zhì)(即，作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì))，優(yōu)選進(jìn)行濃縮以使?jié)饪s的浸出溶液中的蛋白濃度變?yōu)?.9％或更多。如果浸出溶液中的蛋白質(zhì)含量超過15％，則考慮到該浸出溶液粘度的增加，并由此降低超濾膜處理的效率。因此，浸出溶液中的蛋白質(zhì)含量優(yōu)選在0.9-15％，更優(yōu)選1.5-12％，并最優(yōu)選3-10％的范圍內(nèi)。
通過準(zhǔn)備各步驟中的條件直到產(chǎn)生沉淀，可減少沉淀中混合的乳過氧化物酶的量，并以可能產(chǎn)生根本不包含乳過氧化物酶的沉淀。
(5)然后，從已產(chǎn)生沉淀的浸出溶液(保留物)中去除沉淀。結(jié)果，從該浸出溶液中除去了作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì)，并得到含有高度純化的乳過氧化物酶的溶液(乳過氧化物酶溶液)。
去除沉淀的方法是任意選擇的。其可為通過使已產(chǎn)生沉淀的浸出溶液(保留物)靜置來去除沉淀的方法，或者其可為通過使用離心、精密過濾(precisefiltration)(微濾)等進(jìn)行澄清處理來收集已除去沉淀的澄清溶液(乳過氧化物酶溶液)的方法。
通過此步驟得到的乳過氧化物酶溶液優(yōu)選根據(jù)需要滅菌。此時，從增加乳過氧化物酶的熱穩(wěn)定性的觀點來看，所述滅菌優(yōu)選在如下條件下進(jìn)行加入鈣離子如氯化鈣以使?jié)舛葹榇蠹s20mM，而且熱滅菌在72℃進(jìn)行大約15至90秒。
(6)然后，通過去除所得到的乳過氧化物酶溶液的溶劑，能夠獲得固體乳過氧化物酶。
去除溶劑的方法物無具體限制，并可根據(jù)需要選擇。例如，可合適地使用進(jìn)一步使用超濾膜濃縮，并通過普通方法冷凍干燥以除去水分的方法。結(jié)果，可生產(chǎn)高度純化的乳過氧化物酶粉末。
以此方式得到的固體乳過氧化物酶可實現(xiàn)80％或更高的高純度。
用于去除溶劑的步驟(6)不是必需的。可以以溶液狀態(tài)使用如步驟(5)中高度純化的乳過氧化物酶得到的乳過氧化物酶溶液。
實施例下面通過顯示測試實施例來詳述本發(fā)明。然而，本發(fā)明并不限于如下實施例。例如，在本申請中，這些實施例中的組分和這些實施例不包含的組分可以適當(dāng)?shù)亟M合。而且，除蛋白質(zhì)含量和純度之外，除非具體說明，％表示質(zhì)量％。
測試實施例1進(jìn)行本測試以分析在步驟(4)中生產(chǎn)沉淀的優(yōu)選條件，其進(jìn)行如下步驟(1)至(3)，以在通過使用超濾膜對從弱酸性陽離子交換劑收集的浸出溶液進(jìn)行濃縮而獲得的濃縮物中生成沉淀。
(1)樣品作為弱酸性陽離子交換劑，使用CM-Sephadex C-50(由Amersham plc.制備)，其具有羧甲基和91mg/10ml的乳鐵蛋白吸附能力。
將20升脫脂乳加入以170ml弱酸性陽離子交換劑填充的柱子，以將蛋白質(zhì)吸附于該交換劑。然后，用水洗滌柱子中的弱酸性陽離子交換劑，然后將200ml 1.6％的氯化鈉水溶液(離子強(qiáng)度0.27)作為浸出溶劑加入柱子中，由此將已經(jīng)吸附入弱酸性陽離子交換劑的蛋白質(zhì)被洗脫至氯化鈉水溶液。將大約200ml收集的浸出溶液用作測試樣品。通過Kjeldahl方法測定所得到的測試樣品中的蛋白質(zhì)含量，而且其為0.26％。
(2)測試方法制備三類離心型超濾過濾裝置(級分的分子量10K Dalton(道爾頓)、30KDalton和50K Dalton，其全部由Millipore Corporation制備)。
將0.5ml的測試樣品加入每個過濾裝置，并通過在6000rpm離心來進(jìn)行超濾。然后，觀察沉淀產(chǎn)生的存在/不存在。在此時，通過控制離心時間，改變不同階段中過濾裝置中保留物的體積。
(3)測試結(jié)果作為本測試的結(jié)果，在具有不同級分的分子量的三個過濾裝置的任意一個中，當(dāng)該過濾裝置中保留物的體積濃縮至0.15ml時，在過濾器上觀察到白色沉淀。當(dāng)保留物的體積為0.15ml或更小時，也觀察到沉淀產(chǎn)生。然而，當(dāng)其大于0.15ml時，未觀察到沉淀。
而且，當(dāng)將保留物的體積濃縮到0.15ml時，該保留物中的總蛋白質(zhì)含量未0.9％。
由此結(jié)果可確認(rèn)，當(dāng)進(jìn)行濃縮以使所述濃縮的保留物中的總蛋白質(zhì)含量變?yōu)?.9％時，在該保留物中產(chǎn)生沉淀。
測試實施例2進(jìn)行本測試以分析脫鹽處理對通過使用超濾膜濃縮而產(chǎn)生的沉淀的溶解度的影響。
(1)樣品作為本測試的樣品，使用與測試實施例1類似的測試樣品(在1.6％氯化鈉水溶液中含有洗脫的蛋白質(zhì)的浸出溶液，蛋白質(zhì)含量0.26％)。
(2)測試方法制備三種與30K Dalton級分分子量的超濾膜相連的攪拌小室單位(stirredcell unit)(由Millipore Corporation制備)。每個小室單位加入50ml測試樣品。使用氮氣，將小室單位內(nèi)部加壓至大約0.3Mpa，而且將該小室單位中的保留物濃縮至10ml。
關(guān)于第一個小室，當(dāng)保留物變?yōu)?0ml時，將該小室單位中保留物的總量轉(zhuǎn)移到離心管中，并通過在10,000rpm離心分離為固體和液體。然后，收集沉淀(沉淀樣品1)。
關(guān)于第二個小室，當(dāng)保留物變?yōu)?0ml時，將該小室單位中保留物的總量轉(zhuǎn)移到離心管中，并通過在10,000rpm離心分離為固體和液體。然后，收集沉淀。將10ml純化的水加入所述沉淀，并通過渦旋混合器攪拌1分鐘。將以此方式得到的沉淀懸浮液移至離心管，并通過在10,000rpm離心進(jìn)一步分離為固體和液體。然后，收集沉淀(沉淀樣品2)。
關(guān)于第三個小室，將40ml純化的水加入含有濃縮至10ml的保留物的小室單元。然后與上次類似地加壓，直到將保留物再次濃縮至10ml。當(dāng)保留物變?yōu)?0ml時，將該小室單位中保留物的總量轉(zhuǎn)移到離心管中，并通過在10,000rpm離心分離為固體和液體。然后，收集沉淀(沉淀樣品3)。
通過普通方法測定沉淀樣品1至3的干重。
(3)測試結(jié)果作為本測試的結(jié)果，在任意的小室中，當(dāng)該小室單位中的保留物為10ml時，沉淀在保留物中形成。
而且，沉淀樣品1至3的質(zhì)量幾乎不存在差異。因此，可確認(rèn)的是，即使將純化的水加入已經(jīng)通過濃縮步驟形成的沉淀，該沉淀不再溶解。
此外，可確認(rèn)即使通過脫鹽改變鹽濃度，已經(jīng)在浸出溶液中形成的沉淀以不受影響，而且該沉淀不再溶解。
下面通過顯示實施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明并不局限于如下實施例。
實施例1作為弱酸性陽離子交換劑，使用CM-Sephadex C-50(由Amersham plc.制備)，其具有羧甲基和91mg/10ml的乳鐵蛋白吸附能力。
將17升此陽離子交換劑填充入具有50em內(nèi)徑的柱中，并將40升1.5％氯化鈉水溶液通過該柱子。然后用水洗滌，并將該柱中的陽離子交換劑調(diào)節(jié)為鈉形式。
制備源自奶牛的脫脂乳(pH6.7，后面描述為樣品1)作為乳原料。將2000升此脫脂乳在溫度為4℃且流速為60升/h的條件下通過柱子，由此實現(xiàn)吸附處理。
將水通過吸附處理之后的柱子，以洗滌尚未吸附入該陽離子交換劑的乳組分。
然后，將20升1.6％氯化鈉水溶液(離子強(qiáng)度0.27)作為浸出溶劑以30升/h的流速通過，以洗脫吸附入陽離子交換劑的蛋白質(zhì)。結(jié)果，收集了21升含有牛乳過氧化物酶的浸出溶液(后面描述為樣品2)。
然后，使用20K Dalton級分的分子量的超濾膜(由DDS Inc.制備)單位，以0.3Mpa的平均壓力將21升浸出溶液進(jìn)行超濾，并進(jìn)行濃縮直到保留物的量變?yōu)?升。
然后，進(jìn)一步進(jìn)行超濾同時加入水，以使保留物脫鹽，并最終收集2升的保留物。在該保留物中產(chǎn)生白色沉淀。
然后，將含有白色沉淀的保留物靜置澄清，并收集1.95升的上清液級分(后面描述為樣品3)作為牛乳過氧化物酶溶液。
使用具有1.4μm孔徑的精密過濾膜將收集的上清液級分(牛乳過氧化物酶溶液)進(jìn)行微濾，以進(jìn)一步去除少量沉淀，并且產(chǎn)生含有牛乳過氧化物酶的純化的制備物。
此外，將得到的純化的制備物冷凍干燥，以產(chǎn)生26g粉狀凍干的含有牛乳過氧化物酶的制備物(后面描述為樣品4)關(guān)于在生產(chǎn)步驟中得到的上述樣品1至4，即樣品1脫脂乳(乳原料)，樣品2來自陽離子交換劑的浸出溶液，樣品3超濾膜處理后保留物的上清液級分，和樣品4冷凍干燥的制備物，對于每個樣品測定蛋白質(zhì)含量和牛乳過氧化物酶活性以得到比活性(specific activity)。在此，通過Kjeldahl方法測定蛋白質(zhì)含量，并通過Putter等的方法(Bergmeyer ed，Methods of EnzymaticAnalysis，third edition，Vol.3，1983，p.286至293)測定牛乳過氧化物酶活性，以得到每1mg蛋白的過氧化物酶活性(比活性)。結(jié)果在表1中顯示。
表1

如表1所示，樣品1的蛋白質(zhì)含量為3.30％，而其比活性為0.20單位/mg。而且，樣品2的蛋白質(zhì)含量為0.26％，而其比活性為132.5單位/mg。從這些結(jié)果中，可以理解的是，在脫脂乳(乳原料)的蛋白質(zhì)中，牛乳過氧化物酶被選擇性地洗脫于浸出溶液中。
而且，樣品3的蛋白質(zhì)含量為1.64％，而其比活性為220.3單位/mg。樣品4的比活性為224.4單位/mg。
比較樣品2、與樣品3和4的結(jié)果，通過使用超濾膜濃縮浸出溶液，并去除產(chǎn)生的沉淀，牛乳過氧化物酶的比活性顯著地增加。結(jié)果，可以理解的是，通過上述沉淀的去除，除牛乳過氧化物酶之外作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì)被有效地去除，而牛乳過氧化物酶的純化效率增加。
而且，關(guān)于樣品4(冷凍干燥的制備物)，通過高效液相色譜來分析乳過氧化物酶的純度。
在此分析中，使用裝備SHODEX ASAHIPAK C4P-50柱和具有280nm的分析波長的紫外吸附檢測器的HPLC設(shè)備。關(guān)于流動相，流速為0.8ml/min，使用A溶液(乙腈∶0.5M氯化鈉＝10∶90的混合溶液)和B溶液(乙腈∶0.5M氯化鈉＝50∶50，含有0.03％三氟乙酸的混合溶液)，并通過具有濃度變化(其中比例A∶B由50∶50在30分鐘內(nèi)變?yōu)?∶100)的線性密度梯度方法進(jìn)行洗脫。稱重大約20mg的樣品并將其溶于10ml 2.9％氯化鈉水溶液，將其中的25μl在上述分析方法中測定。
在此，先前將純化的牛乳過氧化物酶(由Sigma-Aldrich Co.制備)用作參考標(biāo)準(zhǔn)物(reference standard)，以確認(rèn)在上述分析方法中參考標(biāo)準(zhǔn)物的峰出于洗脫時間的大約18分鐘。
然后，在上述分析方法中分析樣品4，并通過根據(jù)峰面積的自動積分來測定牛乳過氧化物酶純度。
結(jié)果，可以確認(rèn)，樣品4的牛乳過氧化物酶純度為89％。因此，可以確認(rèn)通過本發(fā)明的方法可以從乳原料中生產(chǎn)高度純化的乳過氧化物酶。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其能夠以比常規(guī)方法更簡單的步驟，用更短的時間，更低的成本生產(chǎn)高度純化的乳過氧化物酶，而且其能以工業(yè)規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其包括步驟(1)將一種或多種乳原料與具有弱酸性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的陽離子交換劑接觸由此實現(xiàn)吸附處理；步驟(2)洗滌所述吸附處理之后的陽離子交換劑；步驟(3)將所述洗滌的陽離子交換劑與洗脫乳過氧化物酶的浸出溶劑接觸，由此得到乳過氧化物酶洗脫至所述浸出溶劑的浸出溶液；步驟(4)通過超濾膜濃縮所述浸出溶液，由此實現(xiàn)在濃縮的浸出溶液中的沉淀；和步驟(5)通過從所述濃縮的浸出溶液中去除沉淀得到乳過氧化物酶溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其中所述陽離子交換劑的乳鐵蛋白吸附能力為85mg/10ml或更高。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其中所述離子交換基團(tuán)是羧甲基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其中，在所述步驟(4)中，進(jìn)行濃縮以使所述濃縮的浸出溶液中的蛋白質(zhì)含量變?yōu)?.9至15％，由此實現(xiàn)沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其中所述步驟(3)中使用的浸出溶劑的離子強(qiáng)度為0.07至0.3。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其中所述步驟(3)中使用的浸出溶劑是含有選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和氯化鎂中至少一種鹽的水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其進(jìn)一步包括通過去除在所述步驟(5)中得到的乳過氧化物酶溶液的溶劑來獲得固體乳過氧化物酶的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其中所述固體乳過氧化物酶的純度是80％或更高。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)乳過氧化物酶的方法，其包括如下步驟(1)將原料乳與具有弱酸性基團(tuán)作為離子交換基團(tuán)的陽離子交換劑接觸，由此實現(xiàn)吸附處理；(2)洗滌吸附處理之后的陽離子交換劑；(3)洗滌后將該陽離子交換劑與浸出溶劑接觸，由此得到乳過氧化物酶溶出至浸出溶劑的浸出溶液；(4)通過超濾膜濃縮浸出溶液，由此實現(xiàn)在濃縮的浸出溶液中的沉積；和(5)通過從濃縮的浸出溶液中去除沉積物得到乳過氧化物酶溶液。
文檔編號B01D61/16GK1918289SQ20058000498
公開日2007年2月21日 申請日期2005年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月17日
發(fā)明者市橋信夫, 山內(nèi)恒治, 新光一郎, 安藤哲也 申請人:森永乳業(yè)株式會社