專利名稱：一種儀器部件和采用該儀器部件檢測分析物的存在的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及一種包括適合用于親和柱的剛性載體的儀器部件、親和柱以及包含與分析柱(例如，高壓液相色譜(HPLC)柱)流體聯(lián)通的親和柱的儀器。本發(fā)明還涉及采用該儀器部件檢測一種或多種分析物的存在的方法。
背景技術(shù)：
用于分析潛在地含有一種或多種分析物的試樣的儀器部件和方法是公知的。然而，目前樣品分析技術(shù)需要以下功效之一或多項(1)單獨或彼此組合使用、能減少樣品制備步驟或減少樣品操作步驟的儀器部件；(2)能減少樣品制備步驟和減少樣品操作步驟的方法；(3)單獨或彼此組合使用、能高度精確地分析復(fù)雜試樣中給定分析物的儀器部件，同時極少受來自以下因素的干擾(i)復(fù)雜試樣內(nèi)的非-分析物組分(即，非標的分析物的材料與儀器中使用的一種或多種配體(之間)不希望的結(jié)合)，以及(ii)標的分析物與非儀器中所用配體的反應(yīng)活性部位不希望的結(jié)合；(4)單獨或彼此組合使用、能高度精確地分析復(fù)雜試樣中特異分析物(例如，具有雌激素活性的分析物)的儀器部件，同時極少受來自以下因素的干擾(i)復(fù)雜試樣內(nèi)非-分析物組分(即，非標的分析物的材料與儀器中使用的一種或多種配體不希望的結(jié)合)，以及(ii)標的分析物與非儀器中所用配體的反應(yīng)活性部位不希望的結(jié)合；以及(5)與分析柱在線或流體聯(lián)通地使用親和柱的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種包括適用于親和柱的剛性載體的儀器部件、包含剛性載體的親和柱以及包含與分析柱(例如，高壓液相色譜(HPLC)柱)流體聯(lián)通的親和柱的儀器。該儀器部件可用于從各種各樣復(fù)雜混合物中俘獲并定量化一種或多種分析物。
在本發(fā)明的一種實施方案中，該儀器部件包含適用于親和柱的剛性載體。本發(fā)明的一種范例剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含(i)無機基材；(ii)某種改性基材表面，它減少非分析物材料對無機基材的非特異結(jié)合(即，非標的分析物材料的非特異結(jié)合)和配體-特異性分析物材料對無機基材的非特異結(jié)合(即，標的分析物與由一種或多種配體提供的反應(yīng)活性部位以外的其它反應(yīng)活性部位的非特異結(jié)合)；以及(iii)結(jié)合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。在本發(fā)明范例實施方案中，無機顆粒包含無機金屬氧化物顆粒，例如，二氧化硅或硅膠顆粒。
本發(fā)明還涉及包含剛性載體材料的親和柱。在本發(fā)明范例實施方案中，該親和柱包含具有一定柱體積的柱結(jié)構(gòu)；以及位于柱結(jié)構(gòu)的柱體積內(nèi)的剛性載體，其中剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含(i)無機基材；(ii)減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料在無機基材上的非特異結(jié)合的改性基材表面；以及(iii)一種或多種結(jié)合在無機基材上的配體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
本發(fā)明另外還涉及包含與分析柱流體聯(lián)通的親和柱的儀器，其中親和柱包含剛性載體，它(i)能耐受最高約200bar的柱壓力，和(ii)具有一種或多種結(jié)合在其上的配體，其中一種或多種配體能選擇性地結(jié)合到給定樣品溶液內(nèi)的一種或多種分析物上。在一種范例實施方案中，儀器的親和柱包含本發(fā)明的剛性載體材料。
本發(fā)明還涉及制備剛性載體、免疫親和柱以及包含免疫親和柱的儀器的方法，以及采用剛性載體、免疫親和柱以及儀器檢測在給定樣品中一種或多種分析物的存在的方法。本發(fā)明方法可用于分析潛在地含有至少一種分析物的試樣。
在本發(fā)明的一種范例實施方案中，本發(fā)明涉及制造包含無機基材的剛性載體材料的方法。在一種范例方法中，該方法包括以下步驟(1)在無機基材表面的至少第一部分上固定R基團，其中R基團的反應(yīng)活性小于固定步驟之前的無機基材表面上任何官能團的；(2)在無機基材表面的至少第二部分上固定一種或多種連接基，其中一種或多種連接基包含醛官能團；以及(3)在一種或多種連接基上選擇性地結(jié)合一種或多種配體。
在本發(fā)明一種范例實施方案中，本發(fā)明涉及分析潛在地含有至少一種分析物的試樣的方法。在一種范例實施方案中，分析潛在地含有至少一種分析物的試樣的該方法包括以下步驟(a)向包含剛性載體的親和柱中引入試樣，其中剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含(i)無機基材；(ii)減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料在無機基材上的非特異結(jié)合的改性基材表面；以及(iii)一種或多種結(jié)合在無機基材上的配體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
分析潛在地含有至少一種分析物的試樣的范例方法還可包括以下步驟(a)令試樣接觸剛性載體和其上的配體；(b)清洗掉剛性載體上的任何未結(jié)合到配體上的試樣組分；(c)向親和柱中引入洗脫液以便使洗脫液接觸結(jié)合在剛性載體上的配體上的一種或多種分析物；(d)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成潛在地包含一種或多種分析物的洗脫樣品；以及(e)分析在分析柱上的內(nèi)容物以確定一種或多種分析物在試樣中的存在。
在另一種范例實施方案中，本發(fā)明涉及一種分析潛在地含有至少一種具有雌激素活性的化合物的試樣的方法，其中該方法包括以下步驟向親和柱中引入試樣，其中親和柱包含具有結(jié)合在其上的一種或多種配體的剛性載體，其中一種或多種配體能選擇性地結(jié)合到具有雌激素活性的一種或多種化合物上。
本發(fā)明進一步涉及分析洗脫樣品的方法，其中該方法包括將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在的步驟。例如，洗脫樣品可含有真菌毒素、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合。
在一種范例實施方案中，分析洗脫樣品的方法包括分析潛在地含有至少一種真菌毒素的洗脫樣品，其中該方法包括將將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定至少一種真菌毒素在洗脫樣品中的存在的步驟。
在另一種范例實施方案中，分析洗脫樣品的方法包括分析潛在地含有葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合的洗脫樣品，其中該方法包括將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者在洗脫樣品中的存在的步驟。
本發(fā)明的這些以及其它特征和優(yōu)點在研讀了下面公開的實施方案和所附權(quán)利要求的詳細描述之后自會了然。
附圖簡述下面將參考附圖進一步描述本發(fā)明，附圖中

圖1畫出本發(fā)明范例儀器的示意圖；圖2畫出本發(fā)明范例親和柱；圖3畫出本發(fā)明另一種范例儀器，顯示樣品加載到樣品回路期間流體穿過儀器的流動；圖4畫出樣品注入親和柱期間圖3的范例儀器；圖5畫出樣品被從親和柱洗脫期間圖3的范例儀器；以及圖6畫出樣品檢測期間圖3的范例儀器。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種儀器部件，包括(i)適用于親和柱的剛性載體，(ii)包含剛性載體的親和柱，(iii)包含本發(fā)明剛性載體和/或親和柱與分析柱，例如，高壓液相色譜(HPLC)柱的組合的儀器，以及(iv)包含與分析柱，例如，高壓液相色譜(HPLC)柱流體聯(lián)通的親和柱的儀器。本發(fā)明還涉及制造該儀器部件之一或多種的方法，以及使用該儀器部件之一或多種分析試樣(包括潛在地含有一種或多種分析物的復(fù)雜混合物)的方法。本發(fā)明還涉及使用儀器部件之一或多種以從各種復(fù)雜混合物中俘獲和/或定量化一種或多種分析物的方法。
本發(fā)明一種范例儀器10表示在圖1中。范例儀器10包括親和柱11、分析柱12、檢測器13、第一泵14、第二泵15、第一閥門16、第二閥門17、試樣進口20、第一緩沖液進口21、洗脫緩沖液進口22、第一廢液出口23以及親和柱廢液出口24。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，親和柱11和分析柱12通過偶聯(lián)器(未畫出)彼此連接以便使親和柱11與分析柱12流體聯(lián)通。這里所使用的術(shù)語“與...流體聯(lián)通”描述本發(fā)明的一種實施方案，其中離開親和柱的洗脫樣品經(jīng)過親和柱與分析柱之間的偶聯(lián)器直接流入到分析柱中。此種結(jié)構(gòu)(本文也稱其為“在線組態(tài)”)消除了在親和柱與分析柱之間處理和/或存儲洗脫樣品的需要。
在本發(fā)明其它實施方案中，親和柱11和分析柱12彼此不流體聯(lián)通。在此種實施方案中，離開親和柱的洗脫樣品可被收集和/或儲存起來以備將來使用(即，用于未來向分析柱12中的引入)。此種結(jié)構(gòu)在本文亦稱作“離線組態(tài)”。
如上所示，本發(fā)明范例儀器10可包含多個部件。各個部件的描述和單獨或組合使用各個部件的方法將在下面給出。
I.儀器部件本發(fā)明儀器可包含但不限于，以下部件之一或多種。
A.親和柱本發(fā)明涉及親和柱，例如，圖1所示范例親和柱11，它包含一個或多個以下部件。本文所使用的術(shù)語“親和柱”包括具有以下部件之一或多種的柱，包括諸如免疫親和柱之類的親和柱。
1.柱結(jié)構(gòu)本發(fā)明親和柱包含具有要求尺寸、柱體積和結(jié)構(gòu)整體性的柱結(jié)構(gòu)。就典型而言，柱結(jié)構(gòu)包含管式結(jié)構(gòu)，在管式結(jié)構(gòu)的兩端具有可拆卸端蓋。端蓋與管式結(jié)構(gòu)構(gòu)成防漏密封以防止物料不可心地從管式結(jié)構(gòu)中流走。一種本發(fā)明范例親和柱11表示在圖2中。
如圖2所示，范例親和柱11包含管式結(jié)構(gòu)110，它具有第一端111和第二端112。端蓋113和114分別在第一和第二端111和112構(gòu)成防漏密封。端蓋113和114在范例親和柱11的儲存期間特別有用，這樣防止(i)范例親和柱11內(nèi)物料的泄漏和/或(ii)物料在范例親和柱11內(nèi)變干。范例親和柱11還包含位于范例親和柱11柱腔32內(nèi)的剛性載體材料30和第一緩沖液31(如下所述)。
管式結(jié)構(gòu)110可由各種不同材料制成并具有耐受管式結(jié)構(gòu)110內(nèi)較高壓力的壁結(jié)構(gòu)?？尚牡氖牵苁浇Y(jié)構(gòu)110具有耐受最高約6000psi(400bar)，更可心地約3000psi(200bar)～約4500psi(300bar)恒定壓力的結(jié)構(gòu)整體性。適合構(gòu)成管式結(jié)構(gòu)110的材料包括但不限于，聚合物，例如，聚醚醚酮(PEEK)和聚丙烯；金屬如不銹鋼；以及無機材料如玻璃。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，管式結(jié)構(gòu)110包含聚醚醚酮(PEEK)。
管式結(jié)構(gòu)110的尺寸可隨多種因素變化，包括但不限于，顆粒尺寸和幾何參數(shù)、流動速率、注入體積、要求的板數(shù)等。就典型而言，管式結(jié)構(gòu)110具有圓形斷面面積、介于約2mm～約20mm的外徑和介于約1mm～約10mm的內(nèi)徑，以及介于約2mm～約250mm的總長。在本發(fā)明一種要求的實施方案中，管式結(jié)構(gòu)110具有圓形斷面面積，約11mm的外徑、約4.6mm的內(nèi)徑和約50mm的總長。
用于管式結(jié)構(gòu)110的端蓋113和114一般由PEEK制成，其尺寸與管式結(jié)構(gòu)110的端部構(gòu)成防漏密封。
要指出的是，雖然具有圓形斷面面積的管式結(jié)構(gòu)是要求的，但具有其它斷面面積的管式結(jié)構(gòu)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。適合各種不同管式結(jié)構(gòu)的斷面構(gòu)型包括但不限于，方形、矩形、三角形、橢圓形、五角形和六角形斷面構(gòu)型。
2.剛性載體材料本發(fā)明還涉及適合用于親和柱的剛性載體材料，例如，圖2所示范例剛性載體材料30。本發(fā)明剛性載體材料包含以下部件之一或多種。
a.無機基材適用于本發(fā)明的無機基材包括作為色譜介質(zhì)銷售的產(chǎn)品。該無機基材可采用技術(shù)上公知的方法制備。該無機基材給一種或多種加載到該無機基材表面的附加組分提供支撐。一般而言，無機基材是無機氧化物，更適合地是無機金屬氧化物、硅酸鹽或硅鋁酸鹽或受控多孔玻璃。無機金屬氧化物更可心。適合用于本發(fā)明的無機氧化物通常具有能與其它化學(xué)官能團鍵合或起反應(yīng)的游離羥基基團?？尚牡氖牵瑹o機氧化物具有約1～約10個羥基基團每平方納米固體無機氧化物。
合適的無機金屬氧化物包括但不限于，二氧化硅如色譜級二氧化硅或硅膠，氧化鋁、二氧化硅-氧化鋁、氧化鋯、鋯酸鹽、受控多孔玻璃或氧化鈦。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，無機金屬氧化物是二氧化硅、更可心地，色譜級二氧化硅或硅膠。磁響應(yīng)無機金屬氧化物，例如，公開在WO 98/31461(在此將其公開內(nèi)容全文收作參考)中的硅質(zhì)氧化物-涂布的磁性顆粒，也可用于本發(fā)明。混合的無機金屬氧化物，例如，二氧化硅和氧化鋁的復(fù)合凝膠，或共沉淀物，也可使用。
固體無機金屬氧化物可具有顆粒、纖維片狀物或其組合的物理形式?？尚牡氖牵腆w無機金屬氧化物處于具有基本球形的粒狀或顆粒的物理形式。不論物理形式如何，固體無機金屬氧化物通常具有最多約100μm的最長尺寸(即，長度、寬度或直徑)。當(dāng)固體無機金屬氧化物包含大量具有基本球形的顆粒時，該大量顆?？尚牡鼐哂屑s1μm～約100μm的平均顆粒直徑。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，固體無機金屬氧化物包含大量具有基本球形形狀的二氧化硅或硅膠顆粒，其中大量二氧化硅或硅膠顆粒的平均顆粒直徑介于約15μm～約20μm。
各種各樣市售供應(yīng)的固體無機金屬氧化物可用于本發(fā)明。合適的固體無機金屬氧化物包括但不限于，由Grace Vydac(Columbia，MD)以商品名DAVISIL市售供應(yīng)的二氧化硅顆粒，例如，DAVISILXWP(超寬孔隙)二氧化硅介質(zhì)，具有無規(guī)形狀，平均孔隙尺寸介于約500埃～約3000埃，可心地介于約500埃～約1500埃，或者VYDAC二氧化硅，具有近似球體的形狀并且平均孔隙尺寸為約300埃。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，VYDAC二氧化硅，具有近似球體形狀并且初始平均孔隙尺寸為約300埃，經(jīng)改性以增加平均孔隙尺寸至約800埃以后使用。
b.改性無機基材表面對上述無機基材的表面實施處理或改性，以便在無機基材上減少非分析物材料的非特異、非選擇性結(jié)合和/或吸附(即，非標的分析物材料的非特異結(jié)合)和配體-特異性分析物材料的非特異、非選擇性結(jié)合或吸附(即，標的分析物與由一種或多種配體提供的反應(yīng)活性部位以外的其它反應(yīng)活性部位的非特異結(jié)合)。獲得的改性基材表面具有(i)較小的對非分析物材料(即，除標的分析物以外的材料)的親和力，由于在無機表面存在著相對惰性的R基團，以及(ii)受控數(shù)量的用于，直接或通過連接基，將一種或多種配體(如下所述)選擇性地結(jié)合到無機基材表面的反應(yīng)活性部位。用于選擇性地結(jié)合到一種或多種配體上的反應(yīng)活性部位的數(shù)量導(dǎo)致一種或多種感興趣的分析物與固定在無機基材表面上的一種或多種配體之間選擇性地受控結(jié)合。
該改性基材表面包含固定在無機表面表面的至少一部分上的相對惰性R基團。本文所使用的術(shù)語“相對惰性R基團”用于描述被固定在無機基材表面上的R基團，其中R基團的反應(yīng)活性小于原來(即，未改性的)無機基材表面的。例如，當(dāng)無機基材包含二氧化硅顆粒時，被固定在無機表面表面的至少一部分上的相對惰性R基團的反應(yīng)活性小于存在于原來或未改性二氧化硅表面上的羥基基團的。
相對惰性R基團可利用各種各樣的技術(shù)固定在無機表面表面的至少一部分上，包括但不限于，本文所描述的技術(shù)，以及在美國專利申請序列號09/929,621，題為″SOLID COMPOSITIONS FORSELECTIVE ADSORPTION FROM COMPLEX MIXTURES″，2001-08-14提交，中描述的技術(shù)，在此將其主題全部收作參考。
在本發(fā)明的一種范例實施方案中，相對惰性R基團被固定到無機表面表面的至少一部分上，其中相對惰性R基團包含R10表面部分。合適的R10表面部分包括但不限于，-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。在本發(fā)明的一種范例實施方案中，R10表面部分包括-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH或-CH(OH)CH2(OH)。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，R10表面部分包括-CH2OH、-CH(OH)CH3或-CH2CH2OH，更可心地，R10表面部分包括-CH2OH。
部分R10位于無機物質(zhì)的至少一個表面上。所謂“位于”指的是，R10可直接固定到初始無機物質(zhì)的表面的官能團上。R10可位于存在于無機物質(zhì)周邊的表面區(qū)域上，或者可位于存在于孔隙內(nèi)的表面區(qū)域上，該孔隙伸入到無機物質(zhì)內(nèi)部并在該物質(zhì)的周邊上具有(孔隙)敞口。
R10也可這樣“位于”無機物質(zhì)的表面，即，通過二價部分或原子(-X-)形成通式為-X-R10的基團從而固定在無機物質(zhì)表面上。在該實施方案中連接R10的二價部分或原子在該物質(zhì)與反應(yīng)物起反應(yīng)之前不存在于初始無機物質(zhì)的組合物中。該部分或原子可源于用于產(chǎn)生R10的反應(yīng)物，例如，來源于硅烷反應(yīng)物的殘余金屬原子(例如，硅原子)。該殘余部分或原子直接固定到無機基材上，但可心的是，通過無機基材表面上的羥基基團。此反應(yīng)物中的-X-基團隨反應(yīng)物之不同而不同，但可以是金屬原子也可以是其它化學(xué)部分。例如，X可由金屬原子如硅、鋁、鋯之類衍生而來。選擇的無機基材也可能確定-X-及其所聯(lián)系的反應(yīng)物的選擇。一般而言，任何含-X-的反應(yīng)物都將是能與無機基材上的反應(yīng)活性官能團起反應(yīng)的反應(yīng)物。在無機氧化物的情況下，合適的反應(yīng)物通常是能與羥基基團起反應(yīng)的那些。
反應(yīng)化合物，例如，能在無機基材上生成R10的那些，的化學(xué)方面在技術(shù)上是公知的，例如，Smith，Organic Synthesis，John Wiley & Sons，1994；March，Advanced Organic Chemistry，John Wiley & Sons，F(xiàn)ourth Edition，1992；Larock，Comprehensive OrganicTransformations，John Wiley & Sons，Second Edition，1999；Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，ThirdEdition，1999；Brook，Silicon in Organic，Organometallic，和PolymerChemistry，John Wiley & Sons，2000；Hermanson等，ImmobilizedAffinity Ligand Techniques，1992；Weetall，″Covalent CouplingMethods for Inorganic Support Materials″，in Methods in Enzymology，vol.XLIV，編著K.Mosbach，pp.134-148，1976；Abbott，美國專利4298500；和Arkles，美國專利5371262；在此將這些文獻中的每一篇的公開內(nèi)容全部收作參考。例如，包含位于無機基材表面上的R10基團的剛性載體可由反應(yīng)物或涂布劑如帶有R10前體基團的烷氧基硅烷、二烷氧基硅烷或三烷氧基硅烷來制備。例如，乙酰氧基甲基可以是羥甲基的前體基團。隨后，令涂布劑與無機物質(zhì)的表面起反應(yīng)，然后使前體水解以生成具有被固定的R10基團的無機物質(zhì)。
改性基材表面還包含用于選擇性地結(jié)合到一種或多種配體(如下所述)上的受控數(shù)量反應(yīng)活性部位。反應(yīng)活性部位可直接在無機基材的表面上，或者可通過固定在無機基材表面上的連接基形成。配體可采用技術(shù)上公知的方法(例如，Hermanson等，Immobilized Affinity LigandTechniques，Academic Press，1992，以及前面有關(guān)固定R10部分所援引的其它參考文獻)直接固定在無機基材的表面。例如，配體可通過與表面官能團(即，反應(yīng)活性部位)，例如，羥基，起反應(yīng)而固定在初始無機氧化物上。
替代地，配體可通過固定在無機基材表面的連接基(即，替代的活性反應(yīng)部位)而固定在無機基材上。連接基可以是二價化學(xué)基團，任選地是取代的。該任選取代的二價化學(xué)基團可包含n個-R-基團，其中n是-R-基團的數(shù)目，n是至少為1的整數(shù)，優(yōu)選不大于30，更優(yōu)選不大于15。更典型的是，二價化學(xué)基團為約1～約30個原子，優(yōu)選約1～約20個原子，更優(yōu)選約5～約15個原子長，從配體量到無機物質(zhì)?；瘜W(xué)基團-R-可選自-C(R1)H-、-C(R2)＝C(R3)-和-C≡C-，其中R1、R2和R3彼此獨立地是氫、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基，所述-R-基團任選用-O-、-S-、羰基、硫羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝NO-、-ON＝C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亞芳基、取代的亞芳基、亞環(huán)烷基、取代的亞環(huán)烷基、亞環(huán)烯基、取代的亞環(huán)烯基、二價雜環(huán)基或二價取代的雜環(huán)基替代，其中R4和R5彼此獨立地是氫、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基；取代的環(huán)烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環(huán)烯基、取代的環(huán)烯基、炔基、取代的炔基、環(huán)炔基、取代的環(huán)炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。化學(xué)基團的例子是包含n個-R-基團的“烴基”，并且其中n如上所述，至少一個-R-基團是-CH2-并且(n-1)個-R-基團任選地被上面提到的R基團，例如，-O-、-S-等替代。
連接基與無機基材的反應(yīng)化學(xué)在文獻中有充分描述(參見Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，1992和Weetall，Methods in Enzymology，vol.XLTV，pp.134-148，1976)。關(guān)于連接基和無機基材具體的反應(yīng)化學(xué)取決于使用的無機基材和連接基。同樣，連接基與配體之間的反應(yīng)化學(xué)取決于所采用的連接基和配體。適宜連接基/配體偶聯(lián)化學(xué)的具體例子描述在美國專利申請09/929,621，題為″SOLID COMPOSITIONS FOR SELECTIVEADSORPTION FROM COMPLEX MIXTURES″，2001-08-14提交，在此將其主題內(nèi)容全部收作參考。正如在，例如，美國專利申請序列號09/929,621中公開的，配體可通過配體和/或連接基上的氨基、巰基、羰基或羧基基團，或者活性氫原子偶聯(lián)到連接基上。
在本發(fā)明的一種范例實施方案中，一種或多種配體通過在其上具有至少一個醛官能團的連接基被偶聯(lián)到無機基材上。該醛官能團可用于結(jié)合到配體、固定在無機基材上的第一連接基，或二者。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，一種或多種配體通過第一和第二連接基而偶聯(lián)到無機基材上，其中第一連接基結(jié)合在無機基材上，而第二連接基則結(jié)合在第一連接基上。在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，第一連接基包含氨基官能硅氧烷，例如，氨基丙基三甲氧基硅烷，而第二連接基包含二醛，例如，戊二醛。在這一實施方案中，游離醛部分被用于將配體結(jié)合到無機基材上。本發(fā)明這一范例實施方案描述在下面的實施例1中。
在制造具有改性基材表面的本發(fā)明剛性載體中，其中剛性載體包含連接基團，形成連接基團以及將R10基團加到無機物質(zhì)上的順序可以變化。R10基團可以在連接基固定上以后在無機表面上生成，或者R10可在無機基材與連接基起反應(yīng)之前生成。替代地，可先生成和/或固定R10或者連接基或二者的前體，然后，再由前體起反應(yīng)生成最終R10和/或連接基。
連接基在改性無機表面上的濃度可以變化。在本發(fā)明的某些實施方案中，配體包含大蛋白分子，它可“遮蓋”剛性載體表面面積的大區(qū)域。結(jié)果，連接基部位在剛性載體表面上的濃度就不需要比較高。該濃度可根據(jù)所考慮的配體/分析物絡(luò)合物的尺寸來優(yōu)化。確定R10和配體濃度的因素包括但不限于，R10基團和配體的本性、無機物質(zhì)上的反應(yīng)活性部位濃度、連接基基團的濃度，以及分析物的本性。
一般而言，R10的濃度可介于約1～約10個基團每平方納米(nm2)剛性載體表面面積，基于按BET測定的表面面積。在某些實施方案中，配體濃度主要取決于使用該組合物時要回收的分析物。如上面所指出，配體濃度也可取決于任何任選使用的連接基的濃度。然而，一般地，配體濃度可介于0.04～約4個基團每平方納米。另外，給定的配體不總是按照1∶1的化學(xué)式量比固定在連接基上。在某些實施方案中，例如，當(dāng)配體是由大蛋白分子制備時，配體可由幾個連接基基團固定。在采用較小配體的其它實施方案中，采用數(shù)量少于化學(xué)式量的配體，同時將任何未反應(yīng)的連接基基團“封堵”起來以避免當(dāng)采用本發(fā)明分離時起干擾作用。
R10和配體或任選連接基的數(shù)量也可用在初始無機物質(zhì)上有多少官能團與(i)R10基團和(ii)配體和/或任選連接基起反應(yīng)或用其覆蓋來表示。例如，在無機基材上，約50％～約99％的反應(yīng)活性部位，例如，表面羥基基團，可覆蓋以R10表面部分，同時約50％～約1％的反應(yīng)活性部位可覆蓋以配體和/或任選連接基。
在本發(fā)明的某些實施方案中，在無機基材表面，約70％～約95％反應(yīng)活性部位覆蓋以R10表面部分，同時約30％～約5％反應(yīng)活性部位覆蓋以配體和/或任選連接基。
c.配體本發(fā)明剛性載體材料還包含一種或多種結(jié)合在上面描述的無機基材上的配體。該一種或多種配體可直接固定在無機基材上的反應(yīng)活性部位上，或者任選地通過固定在無機基材上的連接基，正如上面所描述的。該配體可以是任何分子或分子片段，只要能結(jié)合到另一部分或分子-基分析物上，例如，通過疏水相互作用、共價鍵合或庫侖相互作用的結(jié)合。此類配體乃是分離工業(yè)技術(shù)人員熟知的。生物分離工業(yè)中使用的典型配體包括但不限于，生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、天然和非天然蛋白、肽、抗原和核酸。在本發(fā)明中，配體優(yōu)選是受體或抗體。
適合用于本發(fā)明的配體包括任何配體，只要選擇性地結(jié)合在給定分析物上。適合用于本發(fā)明的配體的非限制性例子包括但不限于，單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲除莠劑抗體(例如，溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆和/或氟磺隆的單克隆抗體)、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-有機磷殺蟲劑抗體(例如，殺螟松、毒死蜱和/或嘧啶磷的單克隆抗體)、抗-兒茶酚胺抗體(例如，腎上腺素、去腎上腺素和/或多巴胺的單克隆抗體)、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
如下表1所示，各種各樣配體可用于俘獲給定的分析物。
表1.要檢測的范例配體和分析物


上面的范例配體可從許多來源購得。合適的市售供應(yīng)用于本發(fā)明的配體包括但不限于下表2中所示配體。
表2.范例市售供應(yīng)的配體


在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，配體包含能從復(fù)雜混合物中選擇性地結(jié)合真菌毒素的抗體。在這一實施方案中，配體可心地包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體，或其組合。另外，在這一實施方案中，復(fù)雜混合物可包括但不限于，堅果或堅果產(chǎn)品、谷類、干果、草本植物、香料、咖啡、可可、椰子、動物飼料、植物油、啤酒、水、生物學(xué)流體等。
在本發(fā)明另一要求的實施方案中，配體包含能從復(fù)雜混合物中選擇性地結(jié)合葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者的抗體。在這一實施方案中，配體可心地包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。另外，在這一實施方案中，復(fù)雜混合物可包括但不限于，食物樣品(例如，嬰兒配方物、寵物飼料、運動飲料和維生素片劑)、生物學(xué)樣品(例如，動物組織、生物學(xué)樣品等)。
在本發(fā)明又一種實施方案中，配體包含天然雌激素受體、重組雌激素受體或其任何衍生物，重組蛋白和/或任何其它模仿能從復(fù)雜混合物中選擇性地結(jié)合一種或多種內(nèi)分泌干擾劑的受體生物活性部分的配體。術(shù)語“內(nèi)分泌干擾劑”用來指一類被懷疑干擾人類和野生生物的內(nèi)分泌系統(tǒng)的化合物。“內(nèi)分泌干擾劑”(亦稱作“外源雌激素”)干擾荷爾蒙平衡并在人和動物及其后代體內(nèi)具有不利效應(yīng)。公知的范例內(nèi)分泌干擾劑包括但不限于，雙酚A、雌酮、17-α-雌二醇、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、烷基酚、二乙基己烯雌酚、甲氧滴滴涕、玉米赤霉烯酮、染料木黃酮、o，p′-DDT、p，p′-DDT和鄰苯二甲酸丁基芐基酯。然而，有許多據(jù)信是未知的內(nèi)分泌干擾劑，潛在地干擾人類和野生生物的正常內(nèi)分泌系統(tǒng)的機能。因此，本發(fā)明這一實施方案可能對于識別復(fù)雜混合物中一種或多種已知或未知內(nèi)分泌干擾劑是有用的。在這一實施方案中，復(fù)雜混合物可包括但不限于，人和牛生物學(xué)流體(例如，血清和尿)、自來水、地下水、工藝水、環(huán)境樣品(像一般地，土地、污泥、地表水，以及特殊地，包含可能的藥物污染物的地表水)、工業(yè)化學(xué)制劑、由于化學(xué)品從包裝材料泄漏而污染的食品，以及包裝材料。
在這一實施方案中，配體可心地包含雌激素受體。該雌激素受體配體從復(fù)雜混合物中提取具有雌激素活性的化合物，而同時對于混合物中不具有雌激素活性的化合物又基本上沒有親和性。本文所使用的術(shù)語“具有雌激素活性的化合物”指的是被定義為內(nèi)分泌干擾劑的化合物(例如，干擾負責(zé)維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)生長過程的體內(nèi)天然荷爾蒙的生產(chǎn)、釋放、運輸、代謝、結(jié)合、作用和消除的外源試劑(Kavlock等，″Research needs for the risk assessment of health and environmentaleffects of endocrine disruptorsA report of the U.S.EPA-sponsoredworkshop.″Environ.Health Perspect.104 Suppl 4715-740(1996))并且描述于Endocrine Disruptor Knowledge Base(EDKB)，可從以下FDA公眾網(wǎng)站獲得http://edkb.fda.gov。適用于本發(fā)明使用的雌激素受體配體包括天然人雌激素受體、重組人雌激素受體(hER)或其衍生物、模擬雌激素受體的生物活性部分的重組蛋白或其衍生物，或任何選擇性識別對其生物學(xué)活性而言為內(nèi)分泌干擾劑的化合物的配體。可心的是，雌激素受體配體包含重組人雌激素受體(hER)。
在本發(fā)明的另一種要求的實施方案中，配體包含能從復(fù)雜混合物中選擇性地結(jié)合一種或多種類固醇激素的抗體。類固醇激素包括但不限于，雌二醇、雌酮、乙炔基雌二醇、睪酮和去甲睪酮。在這一實施方案中，復(fù)雜混合物可包括但不限于，自來水、地下水、工藝水、環(huán)境樣品(像一般地，土地、污泥、地表水，以及特殊地，包含可能的藥物污染物的地表水)、藥物制劑、人和動物生物學(xué)流體(例如，血清和尿)，以及其它生物學(xué)樣品(例如，動物組織、生物學(xué)樣品等)。
本發(fā)明親和柱可心地具有盡可能小的分析物俘獲能力。給定親和柱要求的分析物俘獲能力可隨多種因素變化，包括但不限于，分析物的含量和類型、現(xiàn)有試樣大小、測定裝置的靈敏度和檢測極限等。就典型而言，本發(fā)明親和柱能俘獲最高約500皮可摩爾(pMol)給定分析物。可心的是，親和柱能俘獲約50pMol～約1000pMol給定分析物。
3.緩沖液本發(fā)明親和柱還可包含緩沖液，例如，圖2所示范例第一緩沖液31。合適的第一緩沖液給親和柱內(nèi)的剛性載體材料提供貯存和/或使用親和柱期間的非反應(yīng)性保護介質(zhì)。適合用于本發(fā)明的第一緩沖液包括但不限于，磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)緩沖液，或含有約0.02wt％疊氮化鈉的PBS緩沖液。具體第一緩沖液包括但不限于，0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl緩沖液，pH值為約7.0。
典型地，第一緩沖液的pH值為約6.0-約8.0?？尚牡厥?，第一緩沖液的pH值為約6.8-約7.4。更可心的是，pH值為約7.0-約7.4，還更可心的是pH值為約7.0。
可心的是，第一緩沖液在裝有如上所述剛性載體材料的親和柱貯存期間包含含有約0.02wt％疊氮化鈉的PBS緩沖液。親和柱可心地貯存在約+4℃～約+8℃的PBS緩沖液中。另外，第一緩沖液可心地在裝有剛性載體材料的親和柱使用期間包含pH值為約7.0的PBS緩沖液。
B.分析柱本發(fā)明儀器還可包含一種或多種分析柱，如圖1所示范例分析柱12。每個分析柱可用于俘獲存在于洗脫樣品中的一種或多種分析物。任何市售供應(yīng)的分析柱皆可與任何上面描述的儀器部件組合用于本發(fā)明。
合適的市售供應(yīng)的分析柱包括但不限于，由Grace GmbH & Co.KG(Worms，德國)以商品名GENESIS和DENALITM售的分析柱，例如，GENESIS C8 e/c，具有各種不同尺寸，包括5μm，4.6×250mm；和5μm，4.6×150mm；GENESISC18，具有各種不同尺寸，包括4μm，4.6×250mm；和DENALITMC18，具有各種不同尺寸，包括5μm，4.6×150mm；由Grom Analytik+HPLC公司(Rottenburg-Hailfingen，德國)以商品名GROM-SiL銷售的分析柱，例如，GROM-SiL ODS型柱，具有各種不同尺寸，包括5μm，4.6×150mm；和由Amersham Biosciences(Uppsala，瑞典)以商品名Mono S銷售的陽離子交換柱，例如，Mono S hr5/5，具有各種不同尺寸，包括10μm，1mL。
在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，分析柱連接到親和柱上，從而使親和柱與分析柱流體聯(lián)通。在這一實施方案中，可心的是，由材料制成分析柱的管式結(jié)構(gòu)并具有足以耐受較高管式結(jié)構(gòu)內(nèi)壓力(即，最高約6000psi(400bar)，更可心的是約3000psi(200bar)～約4500psi(300bar))的壁結(jié)構(gòu)。合適的管式結(jié)構(gòu)材料包括上面描述的用于形成本發(fā)明親和柱的管式結(jié)構(gòu)的材料。
就典型而言，該分析柱構(gòu)成液相色譜裝置如高壓液相色譜(HPLC)裝置的一部分。適合本發(fā)明使用的液相色譜設(shè)備包括但不限于以下市售供應(yīng)的液相色譜設(shè)備，例如Shimadzu(Columbia，MD)，AgilentTechnologies(Wilmington，DE)，Applied Biosystems(Fostercity，CA)，Dionex Corporation(Sunnyvale，CA)，Varian Inc.(Palo Alto，CA)，和Waters Inc.(Milford，MA)。
C.檢測器本發(fā)明儀器還可包含一種或多種檢測器，例如，在圖1中所示范例檢測器13。檢測器可用于檢測和定量化移動相樣品中分析物的存在。任何市售供應(yīng)的檢測器皆可在本發(fā)明中與任何上面描述的儀器部件組合使用。
合適的市售供應(yīng)的檢測器包括但不限于，由Shimadzu Inc.(Columbia，MD)銷售的紫外-可見光檢測器，例如，系列SPD10 UV/Vis檢測器，或者其它類型檢測器，例如但不限于，熒光檢測器、折光指數(shù)檢測器、物質(zhì)-選擇性檢測器和電化學(xué)檢測器，這些都有市售供應(yīng)，例如但不限于由以下公司獲得Agilent Technologies(Wilmington，DE)，Applied Biosystems(Fostercity，CA)，Dionex Corporation(Sunnyvale，CA)，Varian Inc.(Palo Alto，CA)，和Waters Inc.(Milford，MA)?？尚牡氖?，該檢測器包含操作在約230nm～約400nm波長的紫外-可見光檢測器。例如，以下范例波長可用于本發(fā)明紫外-可見光，在230nm；紫外-可見光，在240nm(烯菌酮)；和紫外-可見光，在361nm(維生素B12)。
D.偶聯(lián)器本發(fā)明儀器還可包含親和柱與一個或多個分析柱之間的偶聯(lián)器。任何傳統(tǒng)上用于色譜法中的偶聯(lián)材料皆可用于本發(fā)明。就典型而言，該偶聯(lián)器包含由塑料、金屬或玻璃管構(gòu)成的低死體積連接。在親和柱與分析柱流體聯(lián)通的本發(fā)明實施方案中，偶聯(lián)器由各種材料制成并且壁結(jié)構(gòu)應(yīng)足以耐受在偶聯(lián)器內(nèi)的相對高壓(即，最高約6000psi(400bar)，更可心地，約3000psi(200bar)～約4500psi(300bar))。
E.泵本發(fā)明儀器還可包含一種或多種泵，例如，在圖1中表示的范例第一泵14和第二泵15。每臺泵提供穿過上面描述的儀器部件的流體流動。任何市售供應(yīng)的泵皆可在本發(fā)明中與任何上面描述的儀器部件組合使用。
合適的市售供應(yīng)的泵包括但不限于可獲自以下的泵Shimadzu(Columbia，MD)，Agilent Technologies(Wilmington，DE)，Applied Biosystems(Fostercity，CA)，Dionex Corporation(Sunnyvale，CA)，Varian Inc.(Palo Alto，CA)，和Waters Inc.(Milford，MA)。
可心的是，泵包含由Agilent Technologies(Wilmington，DE)以商品名1100系列銷售的具有至少3通路的可編程低或高壓力梯度泵，例如，四級(quaternary)1100型泵。
在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，第一泵用于提供第一緩沖液和試樣穿過親和柱的流體流動，而第二泵則用于提供洗脫緩沖液和洗脫樣品穿過分析柱的流體流動。
F.閥本發(fā)明儀器還可包含一種或多種閥，例如，在圖1中所示范例第一閥16和第二閥17。每個閥各自控制流體穿過上面描述的儀器部件的流動。任何市售供應(yīng)的閥皆可在本發(fā)明中與任何上面描述的儀器部件組合使用。
合適的市售供應(yīng)閥包括但不限于，由VICI Valco Instruments Co.，Inc.(Houston，TX)或VWR International Ltd.(Dorset，UK)銷售的閥?？尚牡氖?，閥包含可編程2-位置6-路閥(這里稱作可編程6-路閥)，由VWR International Ltd.(Dorset，UK)以商品名RHEODYNE銷售，例如，型號7725樣品注入器。
在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，采用第一可編程6-路閥控制第一緩沖液和/或試樣穿過親和柱的流體流動，并用第二可編程6-路閥控制洗脫緩沖液和洗脫樣品穿過分析柱的流體流動。
II.制造儀器部件的方法本發(fā)明還涉及制造上面描述的儀器部件的方法。剛性載體材料可，例如，按照上面的描述和下面的實施例制造。大致地，制造本發(fā)明剛性載體材料的方法包括以下步驟(1)對無機基材外表面實施改性以便減少非分析物材料在無機基材上的非特異、非選擇性結(jié)合和/或吸附；和(2)令一種或多種配體選擇性地結(jié)合到無機基材表面。
如上所述，無機基材表面的改性步驟包括(i)令相對惰性的R基團固定到無機基材表面的至少一部分上，并任選地(ii)固定一種或多種連接基到無機基材表面的至少一部分上。固定相對惰性的R基團到無機基材表面的至少一部分上的步驟可發(fā)生在固定一種或多種連接基到無機基材表面的至少一部分上這一任選步驟之前或以后。令一種或多種配體選擇性地結(jié)合到無機基材表面的步驟可包括(i)令受控數(shù)量的一種或多種配體直接結(jié)合到無機基材表面的反應(yīng)活性部位上，或者(ii)令受控數(shù)量的一種或多種配體結(jié)合到從無機基材表面伸出的一種或多種連接基上。當(dāng)受控數(shù)量的一種或多種配體直接結(jié)合到無機基材表面的反應(yīng)活性部位上時，該一種或多種配體選擇性地結(jié)合到無機基材表面的步驟可發(fā)生在將相對惰性的R基團固定到無機基材表面的至少一部分上這一步驟之前或以后。
在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，制造剛性載體材料的方法包括以下步驟(1)令R基團固定到無機基材表面的至少第一部分上，其中R基團的反應(yīng)活性小于固定步驟之前的無機基材表面上任何官能團的；(2)令一種或多種連接基固定到無機基材表面的至少第二部分上；以及(3)令一種或多種配體選擇性地結(jié)合到一種或多種連接基上。
步驟(1)和(2)可按照任何順序?qū)嵤？尚牡氖?，一種或多種連接基包含氨基取代的硅氧烷與二醛的組合。更可心的是，一種或多種連接基包含氨基丙基三甲氧基硅烷與戊二醛的組合。
本發(fā)明親和柱可采用以下步驟制備(1)密封管式結(jié)構(gòu)的第一端；(2)以剛性載體材料，例如，上面描述的剛性載體材料中的任何一種，至少部分地充填管式結(jié)構(gòu)的柱腔；(3)以第一緩沖液至少部分地填充管式結(jié)構(gòu)的柱腔以包封剛性載體材料；并且，任選地，(4)密封管式結(jié)構(gòu)的另一端(即，第二端)?？少A存親和柱以備將來使用，或者可隨后將其連接到包含上面描述的儀器部件之一或全部的儀器上。
III.分析樣品的方法本發(fā)明進一步涉及分析潛在地包含一種或多種感興趣的分析物的試樣的方法。在本發(fā)明的一種范例實施方案中，該方法包括以下步驟(a)將試樣引入到包含剛性載體的親和柱中，其中剛性載體包含大量無機金屬氧化物顆粒，其中每個顆粒包含(i)金屬氧化物基材；(ii)改性基材表面，該表面減少，在無機基材上，非分析物材料的非特異性結(jié)合(即，非標的分析物材料的非特異結(jié)合)和配體-特異性分析物材料的非特異性結(jié)合(即，標的分析物與由一種或多種配體提供的反應(yīng)活性部位以外的其它反應(yīng)活性部位的非特異性結(jié)合)；以及(iii)結(jié)合在無機基材上的一種或多種配體。
本發(fā)明分析試樣的方法可采用各種不同配體，包括但不限于，單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
該分析試樣的方法還可包括以下步驟(b)令試樣接觸剛性載體和其上的配體；(c)清洗掉剛性載體上的任何未結(jié)合到配體上的試樣組分；(d)向親和柱中引入洗脫液以便使洗脫液接觸結(jié)合在剛性載體上的配體上的一種或多種分析物；(e)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成潛在地包含一種或多種分析物的洗脫樣品；以及(f)分析分析柱的內(nèi)容物以確定一種或多種分析物在試樣中的存在。
圖3～6畫出在采用一種或多種上面描述的儀器部件分析試樣的范例方法中的各個步驟。如圖3～6所示，范例儀器40包含親和柱41、分析柱42、檢測器43、第一泵44、第二泵45、第一閥46、第二閥47、試樣回路48、試樣進口50、第一緩沖液進口51、洗脫緩沖液進口52、第一廢液出口53和親和柱廢液出口54。在本發(fā)明這一實施方案中，親和柱41和分析柱42彼此流體聯(lián)通。另外，試樣回路48被用來在試樣與流經(jīng)親和柱41的第一緩沖液合并前暫時儲存試樣。
圖3畫出試樣加載步驟期間的范例儀器40。試樣被加載到試樣進口50中。如圖3所示，在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處于“位置A”，而可編程6-路第二閥47處于“位置B”，這允許(i)試樣從試樣進口50流到試樣回路48中，以及(ii)第一緩沖液流過親和柱41?？赡艿脑嚇涌砂厦嫣岬降膹?fù)雜混合物中的分析物中的任何一種?？捎糜诜独齼x器40中的合適的第一緩沖液包括上面描述的第一緩沖液中的任何一種。
在單獨的步驟中，試樣如圖4所示流過親和柱41。在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處于“位置B”而可編程6-路第二閥47處于“位置A”，這允許(i)試樣與第一緩沖液從試樣回路48流到并穿過親和柱41，(ii)流體從試樣進口50流到第一廢液出口53，以及(iii)洗脫緩沖液從洗脫緩沖液進口52流過分析柱42，而不流過親和柱41。
在此步驟期間，可以使用各種不同洗脫緩沖液。合適的洗脫緩沖液隨著洗脫緩沖液穿過親和柱41流動而有效地釋放結(jié)合在剛性載體材料上的分析物。適合用于本發(fā)明的洗脫緩沖液包括但不限于，0.1M甘氨酸，pH2.5，5M NaCl，10mM磷酸鹽，pH7.2，3.5M MgCl2，10mM磷酸鹽，pH7.2，2～8M脲，2M鹽酸胍，3～5M硫氰酸鹽，10％二烷，50％乙二醇，含乙腈的水溶液，及其組合。具體洗脫緩沖液包括但不限于，35％(v/v)乙腈/65％(v/v)水洗脫緩沖液(例如，用于雙酚A、17-α-雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、睪酮和去甲睪酮)；10％(v/v)乙腈/90％(v/v)水洗脫緩沖液(例如，用于氯苯氧基乙酸除莠劑)；0.01MHCl+0.15M NaCl緩沖液(例如，用于乳鐵蛋白和維生素B12)；以及10％(v/v)甲醇在0.01M HCl+0.15M NaCl中的洗脫緩沖液(例如，用于烯菌酮)。
在圖5中所示另一單獨的步驟中，洗脫緩沖液流過親和柱41和分析柱42。在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處于“位置B”，而可編程6-路第二閥47處于“位置B”，這允許(i)流體從第一緩沖液進口51流到親和柱廢液出口54，(ii)流體從試樣進口50流到第一廢液出口53，以及(iii)洗脫緩沖液從洗脫緩沖液進口52流經(jīng)親和柱41，然后直接到分析柱42中。
在圖6所示的另一種分開的步驟中，移動相溶液流經(jīng)分析柱42。在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處于“位置B”，而可編程6-路第二閥47處于“位置A”，這允許(i)流體從第一緩沖液進口51經(jīng)過親和柱41流到親和柱廢液出口54，(ii)流體從試樣進口50流到第一廢液出口53，以及(iii)移動相溶液從洗脫緩沖液進口52經(jīng)分析柱42到流檢測器43。
各種不同移動相溶液可用于本發(fā)明。合適的移動相溶液隨著移動相溶液穿過分析柱42流過而有效地釋放被結(jié)合在分析柱42內(nèi)的載體結(jié)構(gòu)上的分析物。適合用于本發(fā)明的移動相溶液包括但不限于，含甲醇或乙腈的水溶液、鹽酸溶液、甲醇/鹽酸溶液、磷酸鹽/氯化鈉溶液、乙酸鈉溶液、甲醇/乙酸鈉溶液、乙腈/鹽酸溶液和甲醇/鹽酸/氯化鈉溶液，及其組合。
適合用于本發(fā)明的具體移動相溶液包括但不限于，45％(v/v)乙腈/55％(v/v)水移動相溶液(例如，用于雙酚A分析物)；0.01M HCl移動相溶液(例如，用于氯苯氧基乙酸除莠劑分析物)；60％(v/v)甲醇在0.01M HCl中的移動相溶液(例如，用于氯苯氧基乙酸除莠劑分析物)；70％(v/v)乙腈/30％(v/v)水(例如，用于17-α-雌二醇，17-α-乙炔基雌二醇、睪酮和去甲睪酮)；0.10M磷酸鹽+1.5M NaCl(pH7.0)移動相溶液(例如，用于乳鐵蛋白)；50mM乙酸鈉(pH6.0)移動相溶液(例如，用于苯基脲除莠劑)；55％(v/v)甲醇在50mM乙酸鈉(pH6.0)中的移動相溶液(例如，用于苯基脲除莠劑)；64％(v/v)乙腈在0.01M HCl中的移動相溶液(例如，用于烯菌酮)；以及30％(v/v)甲醇/70％(v/v)0.01M HCl+0.15M NaCl移動相溶液(例如，用于維生素B12)。
在本發(fā)明的一種要求的實施方案中，分析樣品的方法包括分析洗脫樣品的方法，其中該方法包括將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在的步驟。例如，該分析洗脫樣品的方法可用于分析潛在地包含一種或多種選自以下分析物的樣品黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素Q1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2、雙酚A、2，4-二氯苯氧基乙酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、乳鐵蛋白、睪酮、去甲睪酮、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)、殺螟松、毒死蜱、嘧啶磷、腎上腺素、去腎上腺素、多巴胺，一種內(nèi)分泌干擾劑(例如，具有雌激素活性的化合物)，及其組合。
在這一實施方案中，在分析洗脫樣品的方法中，親和柱與分析柱流體聯(lián)通，該方法還可包括下列步驟之一或多步(1)向裝有能耐受最高約200bar柱壓力的剛性載體的親和柱中引入試樣，其中剛性載體上具有結(jié)合在其上的一種或多種配體，其中一種或多種配體能選擇性地結(jié)合一種或多種分析物；(2)令試樣與剛性載體和其上的配體接觸；(3)清洗掉剛性載體上除一種或多種分析物以外的任何試樣組分；(4)將洗脫液引入到親和柱中，以便使洗脫液接觸結(jié)合在剛性載體上的配體上的一種或多種分析物；以及(5)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成洗脫樣品。就典型而言，洗脫液與剛性載體維持接觸介于約5min～約15min的時間。
在分析洗脫樣品的一種范例方法中，該方法包括分析潛在地包含真菌毒素的洗脫樣品的方法。在這一范例實施方案中，該方法包含將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定至少一種真菌毒素在洗脫樣品中的存在的步驟。洗脫樣品可接受分析以確定黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素Q1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2或其組合的存在。
在分析洗脫樣品的另一種范例方法中，該方法包括分析潛在地包含葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合的方法，其中該方法包含將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者在洗脫樣品中的存在的步驟。
本發(fā)明還涉及分析試樣的方法，其中試樣潛在地包含至少一種具有雌激素活性的化合物。在這一實施方案中，該方法包含將試樣引入到裝有其上結(jié)合了一種或多種配體的剛性載體的親和柱中，其中一種或多種配體能選擇性地結(jié)合一種或多種具有雌激素活性的化合物，例如天然人雌激素受體、重組人雌激素受體(hER)或其衍生物、模擬雌激素受體的生物學(xué)活性部分的重組蛋白或其衍生物，或任何選擇性識別對其生物學(xué)活性而言為內(nèi)分泌干擾劑的化合物的配體。在一種要求的實施方案中，一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
分析潛在地包含至少一種具有雌激素活性的化合物的試樣的范例方法還可包括以下步驟之一或多步(1)令試樣接觸剛性載體和其上的配體；(2)清洗掉剛性載體上不表現(xiàn)出雌激素活性的任何試樣組分；(3)將洗脫液引入到親和柱中，以便使洗脫液接觸結(jié)合在剛性載體上的配體上的一種或多種具有雌激素活性的化合物；(4)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成含具有雌激素活性的化合物的洗脫樣品；以及(5)分析分析柱的內(nèi)容物以確定一種或多種具有雌激素活性的化合物在洗脫樣品中的存在。
在這一實施方案的一種要求的變體中，剛性載體能耐受最高約200bar的柱壓，并且親和柱與分析柱流體聯(lián)通。
本發(fā)明親和柱可反復(fù)使用。因此，上述范例方法中任何一種可進一步包括以下步驟之一或多步(1)以第一緩沖液沖洗親和柱；以及(2)向親和柱中引入第二試樣。
本發(fā)明已在上面做了描述并將在下面以實施例的方式做進一步說明，但這些實施例從任何意義上都不應(yīng)被視為構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。相反，應(yīng)當(dāng)清楚地理解，可以訴諸各種各樣其它實施方案、修改及其等價物，本領(lǐng)域技術(shù)人員在研讀了這里的描述以后自然明了，所有這些都不偏離本發(fā)明精神和/或所附權(quán)利要求的范圍。
實施例1包含單克隆抗-維生素B12抗體的剛性載體的制備一種范例剛性載體按如下所述制備。500g甲苯和1.52g 3-氨基丙基三乙氧基硅烷的溶液加入到1000mL圓底燒瓶中。100g預(yù)先在200℃烘烤過2h的具有800埃擴大的平均孔隙尺寸(平均顆粒尺寸介于約15～約20μ)的Grace Vydac二氧化硅被加入到圓底燒瓶中。將圓底燒瓶置于加熱罩內(nèi)并安裝冷凝器。將加熱罩固定在軌道搖動器頂部，后者將操作在115rpm速度下。在整個反應(yīng)期間將N2通過圓底燒瓶和冷凝器以帶走空氣。
圓底燒瓶的物料在沸騰(～110℃)下加熱4h。樣品經(jīng)過濾并以2×100mL甲苯洗滌，在115℃干燥，隨后在150℃烘烤2h。所獲得的樣品被貼上中間體A的標簽。
-C3H6NH2基團在二氧化硅上的濃度是0.54，根據(jù)二氧化硅載體的表面面積(BET)(43m2/g)，中間體的碳含量(LECO)(0.41％)計算。參見ASTM D5373(關(guān)于煤的)和ASTM 5291。
400mL 1M NaCl與中間體A在燒杯內(nèi)進行混合并以磁攪拌子攪拌。初始pH值是4.79。滴加1M HCl直至pH達到2.0。將pH在2.0維持15min。隨后，樣品進行過濾并以5×100mL去離子水洗滌，在115℃干燥，隨后在200℃烘烤2h。該樣品被貼上中間體B的標簽。
400g甲苯和48.78g乙酰氧基甲基三乙氧基硅烷與中間體B在圓底燒瓶中進行混合。將圓底燒瓶放在安裝了冷凝器的加熱罩內(nèi)。將加熱罩固定在操作在115rpm速度下的軌道搖動器頂部。在整個反應(yīng)期間將N2通過圓底燒瓶和冷凝器以帶走空氣。樣品在沸騰(～110℃)下加熱24h，過濾并以3×100mL甲苯洗滌，在115℃干燥，隨后在150℃烘烤2h。該樣品被貼上中間體C的標簽。
在下一個反應(yīng)步驟中，20g中間體C被加入到80mL 0.1M鹽酸中并沸騰4h。濾出二氧化硅并以60mL去離子水洗滌4次。該樣品被貼上中間體D的標簽。
20g中間體D和300mL偶聯(lián)緩沖液(0.1M Na2PO4+0.15M NaCl；pH＝7.0)在1000mL燒杯內(nèi)進行混合并攪拌5min。樣品進行過濾從而得到濕濾餅。隨后，在燒杯中加入57.53g 50wt％戊二醛和2.89gNaCNBH3，隨后加入中間體D的濕濾餅。樣品攪拌4h，過濾，以400mL偶聯(lián)緩沖液洗滌并在400mL偶聯(lián)緩沖液內(nèi)再調(diào)漿從而獲得新樣品，后者經(jīng)過濾，以200mL偶聯(lián)緩沖液洗滌并在200mL偶聯(lián)緩沖液內(nèi)再調(diào)漿2次。該再洗滌并再調(diào)漿的樣品進行過濾，隨后以400mL偶聯(lián)緩沖液洗滌。該樣品被貼上中間體E的標簽。
1.5g偶聯(lián)緩沖液和250μL單克隆抗-維生素B12抗體(產(chǎn)品號V9505，由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO銷售)濃度為約10～15mg抗體每毫升)加入到10mL圓底燒瓶中。在該燒瓶中加入160mg NaCNBH3和1g中間體E并在搖動器上混合4h。樣品過濾，并以10mL偶聯(lián)緩沖液洗滌4次。隨后，在10mL圓底燒瓶中加入1.5g偶聯(lián)緩沖液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺，隨后在搖動器上混合4h。樣品過濾并以10mL偶聯(lián)緩沖液洗滌4次。獲得的剛性載體材料被置于含0.02％疊氮化鈉的PBS緩沖液內(nèi)并在4℃下儲存。
實施例2檢測維生素B12的親和柱的制備一種范例親和柱通過在4.6×50mm內(nèi)徑親和柱中充填實施例1制備的剛性載體材料而制成。充填的柱隨后灌注以含0.02wt％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。獲得的范例親和柱在4℃溫度下儲存。
實施例3含維生素B12的組合物的分析實施例2的范例親和柱被偶聯(lián)到類似于圖3所示范例儀器40的儀器上。該儀器包含高效液相色譜(HPLC)(型號1100系列，AgilentTechnologies，Wilmington，DE)。利用配備了200μL樣品回路的型號RHEODYNE 7725的樣品注入器(VWR International Ltd.，Dorset，UK)進行注入。借助型號RHEODYNE 7725的樣品注入器可將親和柱從HPLC的在線組態(tài)(即，親和柱與HPLC流體聯(lián)通)轉(zhuǎn)換到離線組態(tài)(即，親和柱未與HPLC流體聯(lián)通)。借助型號LC10AD高壓液體泵(Shimadzu，Columbia，MD)使樣品從樣品注入器轉(zhuǎn)移流過親和柱。型號1100紫外-可見光檢測器(Agilent Technologies，Wilmington，DE)在361nm檢測到峰。
結(jié)合緩沖液，包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl；pH 7.0)，被泵送通過親和柱以使該柱達到平衡。總共使用了10個柱體積的結(jié)合緩沖液。
按如下所述制備含維生素B12的試樣。將含有約1mg/g維生素B12并重0.1g試樣的固體材料溶解在100mL結(jié)合緩沖液中形成混合物。該混合物利用0.22μm過濾器進行過濾。
在加載該試樣之前，采取以下步驟(1)給RP-HPLC按下面的規(guī)定編程；(2)所有緩沖液接受脫氣處理并采用0.45μm過濾器進行過濾；(3)給泵管充填適當(dāng)?shù)木彌_液，然后再將親和柱和分析柱連接到儀器上，以防止空氣帶入到柱內(nèi)；(4)從柱上拆下端蓋，將柱連接到儀器上；(5)每個柱使用至少10個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡或直至在流出液中檢測不到信號；以及(6)將試樣加載到樣品回路中。
采用以下色譜條件柱1 抗-維生素B12免疫親和柱柱2 GENESISC18，4μm，4.6×250mm流率 1ml/min檢測器紫外-可見光，361nm結(jié)合緩沖液0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl，pH7.0洗脫緩沖液0.01M HCl+0.15M NaCl移動相30％(v/v)甲醇/70％(v/v)0.01M HCl+0.15M NaCl將以下時間周期編程到儀器設(shè)定中

實施例4含有單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體的剛性載體的制備按如下所述制備范例剛性載體。1.5g偶聯(lián)緩沖液和250μg單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體(產(chǎn)品號A9555，由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，)銷售，濃度為約7.6mg抗體每毫升)加入到10mL圓底燒瓶中。在該燒瓶中加入160mg NaCNBH3和1g實施例1的中間體E并在搖動器上混合4h。樣品過濾，并以10mL偶聯(lián)緩沖液洗滌4次。隨后，在10mL圓底燒瓶中加入1.5g偶聯(lián)緩沖液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺，隨后在搖動器上混合4h。樣品過濾并以10mL偶聯(lián)緩沖液洗滌4次。獲得的剛性載體材料被置于含0.02％疊氮化鈉的PBS緩沖液內(nèi)并在4℃下儲存。
實施例5檢測黃曲霉毒素B1的親和柱的制備一種范例親和柱通過在4.6×50mm內(nèi)徑的親和柱中充填實施例4制備的剛性載體材料而制成。充填的柱隨后灌注以含0.02wt％疊氮化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。獲得的范例親和柱在4℃溫度下儲存。
實施例6含黃曲霉毒素的組合物的分析實施例5的范例親和柱被偶聯(lián)到類似于圖3所示范例儀器40的儀器上。該儀器包含配備了后柱型號為Cobra cell(Lamers & Pleuger′s，Hertogenbosch，NL)的高效液相色譜(HPLC)(型號1100系列，AgilentTechnologies(Wilmington，DE))。利用配備了500μL樣品回路的型號RHEODYNE 7725的樣品注入器(VWR International Ltd，Dorset，UK)進行注入。借助型號RHEODYNE 7725的樣品注入器可將親和柱切換到與HPLC的在線或離線。借助型號LC10AD高壓液體泵(Shimadzu，Columbia，MD)，使樣品從樣品注入器轉(zhuǎn)移流過親和柱。型號1100紫外-可見光檢測器(Agilent Technologies，Wilmington，DE)在365nm和型號1046A可編程熒光檢測器(Agilent Technologies，Wilmington，DE)在365/430nm檢測到峰。
結(jié)合緩沖液，包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl；pH 7.0)，被泵送通過親和柱以使該柱達到平衡。總共使用了10個柱體積的結(jié)合緩沖液。
按如下所述制備含黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的試樣。含有10～100ng/g黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2并重25g的固體材料被懸浮在100mL乙腈中。樣品在超聲波作用下提取15min。液體部分以6000rpm離心處理10min。100μL上層清液以900μL結(jié)合緩沖液進行稀釋。
在加載試樣之前，采取以下步驟(1)給RP-HPLC按下面的規(guī)定編程；(2)所有緩沖液接受脫氣處理并采用0.45μm過濾器進行過濾；(3)給泵管充填適當(dāng)?shù)木彌_液，然后再將親和柱和分析柱連接到儀器上，以防止空氣帶入到柱內(nèi)；(4)從柱上拆下端蓋，將柱連接到儀器上；(5)每個柱使用至少10個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡或直至在流出液中檢測不到信號；以及(6)將試樣加載到樣品回路中。
采用以下色譜條件柱1 抗-黃曲霉毒素B1免疫親和柱柱2 GENESISC18，4μm，4.6×250mm檢測器1 紫外-可見光，365nm檢測器2 熒光檢測器(365/430nm)結(jié)合緩沖液0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl，pH7.0流率 0.5ml/min洗脫緩沖液20％(v/v)乙腈水溶液移動相600mL甲醇+80mL乙腈+200μL濃硝酸+50mg溴化鉀并以水調(diào)整到1000mL流率 0.8ml/min將以下時間周期編程到儀器設(shè)定中

實施例7
含有重組人雌激素受體(hER)作為活性配體的剛性載體的制備按如下所述制備范例剛性載體。1.5g偶聯(lián)緩沖液和50μg重組人雌激素受體(產(chǎn)品號AB RP-310，由10P′s(Breda，NL)銷售)加入到10mL圓底燒瓶中。在該燒瓶中加入160mg NaCNBH3和實施例1的1g中間體E并在搖動器上混合4h。樣品過濾，并以10mL偶聯(lián)緩沖液洗滌4次。隨后，在10mL圓底燒瓶中加入1.5g偶聯(lián)緩沖液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺，隨后在搖動器上混合4h。樣品過濾并以10mL偶聯(lián)緩沖液洗滌4次。獲得的剛性載體材料被置于含0.02％疊氮化鈉的PBS緩沖液內(nèi)并在4℃下儲存。
實施例8檢測內(nèi)分泌干擾劑的親和柱的制備一種范例親和柱通過在4.6mm×50mm內(nèi)徑的親和柱中充填實施例7制備的剛性載體材料而制成。充填的柱隨后灌注以含0.02wt％疊氮化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。獲得的范例親和柱在4℃溫度下儲存。
實施例9含內(nèi)分泌干擾劑的組合物的分析實施例8的范例親和柱被偶聯(lián)到類似于實施例3中使用的儀器的儀器上。結(jié)合緩沖液，包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl；pH 7.0)，被泵送通過親和柱以使該柱達到平衡?？偣彩褂昧?0個柱體積的結(jié)合緩沖液。
按如下所述制備含17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、雌酮、雙酚A、壬基酚和鄰苯二甲酸丁基芐基酯的混合物的試樣。含250～1000mg/l 17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、雌酮、雙酚A、壬基酚和鄰苯二甲酸丁基芐基酯的儲備溶液在100mL結(jié)合緩沖液中稀釋1000倍配成混合物。
在加載試樣之前，采取以下步驟(1)給RP-HPLC按下面的規(guī)定編程；(2)所有緩沖液接受脫氣處理并采用0.45μm過濾器進行過濾；(3)給泵管充填適當(dāng)?shù)木彌_液，然后再將親和柱和分析柱連接到儀器上，以防止空氣帶入到柱內(nèi)；(4)從柱上拆下端蓋，將柱連接到儀器上；
(5)每個柱使用至少10個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡或直至在流出液中檢測不到信號；以及(6)將試樣加載到樣品回路中。
采用以下色譜條件柱1 重組人雌激素受體(hER)親和柱柱2 GENESISC18，4μm，4.6×250mm流率 0.8ml/min檢測器紫外-可見光，230nm結(jié)合緩沖液0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl，pH7.0洗脫緩沖液25％(v/v)6M硫氰酸鉀，50％(v/v)結(jié)合緩沖液，25％(v/v)甲醇移動相A 0.01N HCl水溶液移動相B 乙腈將以下時間周期編程到儀器設(shè)定中

雖然以結(jié)合本發(fā)明具體實施方案對本發(fā)明做了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員在研讀了上面的內(nèi)容以后可以輕易地想到對于這些實施方案的替代、變換和等價方案。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)按照所附權(quán)利要求及其任何等價物的范圍來評估。
權(quán)利要求
1.一種包含與分析柱流體聯(lián)通的親和柱的儀器，其中親和柱包含剛性載體，它能耐受最高約200bar的柱壓力，所述剛性載體具有一種或多種結(jié)合在其上的配體，所述一種或多種配體能選擇性地結(jié)合到給定樣品溶液內(nèi)的一種或多種分析物上。
2.權(quán)利要求1的儀器，其中剛性載體包含大量無機顆粒。
3.權(quán)利要求2的儀器，其中每個無機顆粒包含(i)無機基材；(ii)改性基材表面，它減少不希望的材料與無機基材之間的非特異結(jié)合。
4.權(quán)利要求3的儀器，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
5.權(quán)利要求4的儀器，其中每個R10基團包含-CH2OH。
6.權(quán)利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
7.權(quán)利要求1的儀器，其中一種或多種分析物包含黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素Q1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2、雙酚A、2，4-二氯苯氧基乙酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、乳鐵蛋白、睪酮、去甲睪酮、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)、殺螟松、毒死蜱、嘧啶磷、腎上腺素、去腎上腺素、多巴胺、具有雌激素活性的化合物，或其組合。
8.權(quán)利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體，或其組合。
9.權(quán)利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。
10.權(quán)利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
11.權(quán)利要求1的儀器，其中親和柱通過管式偶聯(lián)器連接到分析柱上。
12.權(quán)利要求1的儀器，其中分析柱構(gòu)成反相高效液相色譜(RP-HPLC)裝置的一部分。
13.權(quán)利要求12的儀器，還包含熒光檢測裝置。
14.權(quán)利要求1的儀器，其中剛性載體包含大量硅膠顆粒。
15.權(quán)利要求14的儀器，其中硅膠顆粒具有球體的形狀和介于約500埃～800埃的平均孔隙尺寸。
16.一種適用于親和柱的剛性載體，所述剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含無機基材；改性基材表面，它減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料在無機基材上的非特異結(jié)合；以及結(jié)合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
17.權(quán)利要求16的剛性載體，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
18.權(quán)利要求17的剛性載體，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
19.權(quán)利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應(yīng)活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
20.權(quán)利要求19的剛性載體，其中一種或多種連接基包含氨基取代的硅氧烷與二醛的組合。
21.權(quán)利要求20的剛性載體，其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷，而二醛則包含戊二醛。
22.權(quán)利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應(yīng)活性部位上。
23.權(quán)利要求16的剛性載體，其中改性基材表面包含反應(yīng)活性部位，其中約50％～約99％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約1％～約50％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
24.權(quán)利要求23的剛性載體，其中約70％～約95％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約5％～約30％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
25.權(quán)利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體，或其組合。
26.權(quán)利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。
27.權(quán)利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
28.權(quán)利要求16的剛性載體，其中剛性載體包含大量硅膠顆粒。
29.權(quán)利要求28的剛性載體，其中硅膠顆粒具有球體的形狀和介于約500?！s800埃的平均孔隙尺寸。
30.一種親和柱，包含權(quán)利要求16～29中任何一項的剛性載體。
31.一種儀器，包含與分析柱流體聯(lián)通的親和柱，其中親和柱包含權(quán)利要求30的親和柱。
32.一種親和柱，包含具有一定柱體積的柱結(jié)構(gòu)；以及位于柱結(jié)構(gòu)的柱體積內(nèi)的剛性載體，所述剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含無機基材；改性基材表面，它減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料與無機基材之間的非特異結(jié)合；以及結(jié)合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
33.權(quán)利要求32的親和柱，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
34.權(quán)利要求33的親和柱，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
35.權(quán)利要求32的親和柱，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應(yīng)活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
36.權(quán)利要求35的親和柱，其中一種或多種連接基包含氨基取代的硅氧烷與二醛的組合。
37.權(quán)利要求36的親和柱，其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷，而二醛則包含戊二醛。
38.權(quán)利要求32的親和柱，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應(yīng)活性部位上。
39.權(quán)利要求32的親和柱，其中改性基材表面包含反應(yīng)活性部位，其中約50％～約99％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約50％～約1％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
40.權(quán)利要求39的親和柱，其中約70％～約95％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約30％～約5％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
41.權(quán)利要求32的親和柱，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素g1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體，或其組合。
42.權(quán)利要求32的親和柱，其中一種或多種配體包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。
43.權(quán)利要求32的親和柱，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
44.權(quán)利要求32的親和柱，其中剛性載體包含大量硅膠顆粒。
45.權(quán)利要求44的親和柱，其中硅膠顆粒具有球體的形狀和介于約500?！s800埃的平均孔隙尺寸。
46.一種儀器，包含與分析柱流體聯(lián)通的親和柱，其中親和柱包含權(quán)利要求30和32～45中任何一項的親和柱。
47.一種分析試樣的方法，所述方法包括以下步驟令試樣與權(quán)利要求1～46中任何一項的儀器、剛性載體或親和柱接觸。
48.一種分析洗脫樣品的方法，所述方法包括以下步驟將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在。
49.權(quán)利要求48的方法，其中洗脫樣品包含一種或多種在溶劑中的分析物，所述一種或多種分析物選自黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素Q1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2、雙酚A、2，4-二氯苯氧基乙酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、乳鐵蛋白、睪酮、去甲睪酮、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)、殺螟松、毒死蜱、嘧啶磷、腎上腺素、去腎上腺素、多巴胺、具有雌激素活性的化合物，或其組合。
50.權(quán)利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數(shù)量的至少一種真菌毒素。
51.權(quán)利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數(shù)量的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素Q1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2或其組合。
52.權(quán)利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數(shù)量的葉酸、維生素B12(氰鈷銨)，或其組合。
53.權(quán)利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數(shù)量的至少一種具有雌激素活性的化合物。
54.權(quán)利要求48的方法，其中轉(zhuǎn)移步驟包括對洗脫樣品施加流體壓力以便將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱。
55.權(quán)利要求54的方法，其中流體壓力是通過泵施加的。
56.權(quán)利要求48的方法，其中分析步驟包括檢測一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在，將一種或多種分析物彼此分離，在洗脫樣品中定量化一種或多種分析物，或其任意組合。
57.權(quán)利要求56的方法，其中分析步驟包括對洗脫樣品實施反相高效液相色譜(RP-HPLC)、熒光檢測或這兩種處理。
58.權(quán)利要求48～57中任何一項的方法，其中親和柱包含能耐受最高約300bar的柱壓的剛性載體，所述剛性載體具有一種或多種結(jié)合在其上的配體，所述一種或多種配體能選擇性地結(jié)合試樣內(nèi)的一種或多種分析物。
59.權(quán)利要求58的方法，其中剛性載體包含大量無機顆粒。
60.權(quán)利要求59的方法，其中每個無機顆粒包含無機基材；和減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料對無機基材的非特異結(jié)合的改性基材表面。
61.權(quán)利要求60的方法，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
62.權(quán)利要求61的方法，其中每個R10基團包含-CH2OH。
63.權(quán)利要求61的方法，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
64.權(quán)利要求58的方法，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應(yīng)活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
65.權(quán)利要求64的方法，其中一種或多種連接基包含氨基取代的硅氧烷與二醛的組合。
66.權(quán)利要求65的方法，其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷，而二醛則包含戊二醛。
67.權(quán)利要求58的方法，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應(yīng)活性部位上。
68.權(quán)利要求60的方法，其中改性基材表面包含反應(yīng)活性部位，其中約50％～約99％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約50％～約1％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
69.權(quán)利要求68的方法，其中約70％～約95％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約30％～約5％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
70.權(quán)利要求59的方法，其中無機顆粒包含大量硅膠顆粒。
71.權(quán)利要求70的方法，其中硅膠顆粒具有球體的形狀和介于約500?！s800埃的平均孔隙尺寸。
72.權(quán)利要求48～71中任何一項的方法，還包括以下步驟將試樣引入到包含能耐受最高約200bar柱壓的剛性載體的親和柱中，所述剛性載體具有一種或多種固定在其上的配體，所述一種或多種配體能選擇性地結(jié)合一種或多種分析物；令試樣接觸剛性載體和其上的配體；清洗剛性載體以便洗掉任何除一種或多種分析物以外的試樣組分；將洗脫液引入到親和柱中以便使洗脫液接觸一種或多種結(jié)合在剛性載體上的配體上的分析物；以及讓洗脫液維持與剛性載體接觸一段時間以便形成洗脫樣品。
73.權(quán)利要求72的方法，其中該段時間介于約5分鐘～約15分鐘。
74.權(quán)利要求72的方法，還包括以下步驟以第一緩沖液沖洗親和柱；以及將第二試樣引入到親和柱中。
75.一種分析潛在地包含至少一種真菌毒素的洗脫樣品的方法，所述方法包括以下步驟將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定至少一種真菌毒素在洗脫樣品中的存在。
76.權(quán)利要求75的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數(shù)量的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素Q1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2或其組合。
77.一種分析潛在地包含葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合的洗脫樣品的方法，其中該方法包含以下步驟將洗脫樣品從親和柱轉(zhuǎn)移到分析柱，其中親和柱與分析柱流體聯(lián)通，以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者在洗脫樣品中的存在。
78.一種分析潛在地包含至少一種具有雌激素活性的化合物的試樣的方法，所述方法包括以下步驟將試樣引入到親和柱中，該親和柱包含剛性載體，后者具有結(jié)合在其上的一種或多種配體，所述一種或多種配體能選擇性地結(jié)合到一種或多種具有雌激素活性的化合物上。
79.權(quán)利要求78的方法，其中一種或多種配體包含天然人雌激素受體、重組人雌激素受體(hER)或其衍生物、模擬雌激素受體或其衍生物的生物學(xué)活性部分的重組蛋白，或任何選擇性識別作為內(nèi)分泌干擾劑的具有生物活性的化合物的其它配體。
80.權(quán)利要求78的方法，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
81.權(quán)利要求78的方法，還包括以下步驟令試樣接觸剛性載體和其上的配體；清洗剛性載體以便洗掉任何未顯示雌激素活性的試樣組分；將洗脫液引入到親和柱中以便使洗脫液接觸一種或多種結(jié)合在剛性載體上的配體上的具有雌激素活性的化合物；以及讓洗脫液維持與剛性載體接觸一段時間以便形成包含具有雌激素活性的化合物的洗脫樣品；以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定一種或多種具有雌激素活性的化合物在洗脫樣品中的存在。
82.權(quán)利要求81的方法，其中剛性載體能耐受最高約200bar的柱壓，并且親和柱與分析柱流體聯(lián)通。
83.一種分析潛在地包含至少一種分析物的試樣的方法，所述方法包括以下步驟向包含剛性載體的親和柱中引入試樣，所述剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含無機基材；改性基材表面，它減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料與無機基材之間的非特異結(jié)合；以及結(jié)合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃曲霉毒素B1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素Q1抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素B2抗體、單克隆抗-黃曲霉毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)，及其組合；令試樣接觸剛性載體和其上的配體；清洗剛性載體以便洗掉任何不結(jié)合配體的試樣組分；將洗脫液引入到親和柱中以便使洗脫液接觸一種或多種結(jié)合在剛性載體上的配體上的分析物；以及讓洗脫液維持與剛性載體接觸一段時間以便形成潛在地包含一種或多種分析物的洗脫樣品；以及分析分析柱的內(nèi)容物以確定一種或多種分析物在試樣中的存在。
84.權(quán)利要求83的方法，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
85.權(quán)利要求84的方法，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
86.權(quán)利要求83的方法，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應(yīng)活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
87.權(quán)利要求86的方法，其中一種或多種連接基包含氨基取代的硅氧烷與二醛的組合。
88.權(quán)利要求87的方法，其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷，而二醛則包含戊二醛。
89.權(quán)利要求83的方法，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應(yīng)活性部位上。
90.權(quán)利要求83的方法，其中改性基材表面包含反應(yīng)活性部位，其中約50％～約99％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約50％～約1％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
91.權(quán)利要求90的方法，其中約70％～約95％反應(yīng)活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應(yīng)活性小于改性前基材表面上的任何官能團的，并且約30％～約5％反應(yīng)活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
92.權(quán)利要求83的方法，其中無機顆粒包含大量硅膠顆粒。
93.權(quán)利要求92的方法，其中硅膠顆粒具有球體的形狀和介于約500?！s800埃的平均孔隙尺寸。
94.一種制造包含無機基材的剛性載體材料的方法，所述方法包括以下步驟(1)令R基團固定到無機基材表面的至少第一部分上，其中R基團的反應(yīng)活性小于固定步驟之前無機基材表面上的任何官能團的；(2)令一種或多種連接基固定到無機基材表面的至少第二部分上，其中一種或多種連接基包含醛官能團；以及(3)令一種或多種配體選擇性地結(jié)合到一種或多種連接基上。
95.權(quán)利要求94的方法，其中步驟(2)在步驟(1)之前實施。
96.權(quán)利要求94的方法，其中一種或多種連接基包含氨基取代的硅氧烷與二醛的組合。
97.權(quán)利要求96的方法，其中氨基取代的硅氧烷包含氨基丙基三甲氧基硅烷，而二醛則包含戊二醛。
98.一種制造親和柱的方法，所述方法包括以下步驟(1)密封管式結(jié)構(gòu)的第一端；(2)以權(quán)利要求16～29中任何一項的剛性載體材料或按照權(quán)利要求94～97中任何一項的方法成形的剛性載體材料，至少部分地充填管式結(jié)構(gòu)的柱腔；(3)以第一緩沖液至少部分地填充管式結(jié)構(gòu)的柱腔以包封剛性載體材料；并且，任選地，(4)密封管式結(jié)構(gòu)的另一端。
全文摘要
公開一種包括適合用于親和柱的剛性載體的儀器部件、親和柱以及與分析柱(例如，在高壓液相色譜(HPLC)柱中的)流體聯(lián)通的親和柱。還公開采用該儀器部件檢測一種或多種分析物的存在的方法。
文檔編號B01J20/286GK101031344SQ200580031449
公開日2007年9月5日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月19日
發(fā)明者P·M·－J·布雷姆斯, G·范埃謝, M·M·雷姆雷夫－布姆 申請人:格雷斯股份有限兩合公司