專利名稱：：用于純化抗體的親和力加離子交換層析的制作方法用于純化抗體的親和力加離子交換層析本發(fā)明涉及蛋白質領域，具體地說涉及生物技術生產中的抗體純化。本發(fā)明的目的是描述一種純化這類蛋白質或抗體的新方法。由于可用于一步幾乎完全純化細胞培養(yǎng)上清液中的抗體(通常是IgG)，A蛋白層析已廣泛應用于抗體的產業(yè)化生產。反復使用后，A蛋白親和柱不可避免地發(fā)生一定程度的配體脫落。這部分是因為柱上的A蛋白被水解剪切脫落，在醫(yī)藥領域的抗體產業(yè)化生產中，出于管理上原因不得加入蛋白酶抑制劑混合物。不幸的是，這種A蛋白或A蛋白片段污染物仍保留它們對IgG的親和力，它們與純化的抗體形成復合物而難以除去。必須除去純化抗體中的該兩類由不同大分子(組成)的異質二聚體復合物，因為A蛋白是細菌蛋白會引發(fā)有害免疫應答反應；有報道說體外將A蛋白加入單體(monomelic)IgG所形成的模型復合物能激活攜帶Fc的白細胞與補體系統(tǒng)而產生氧化和過敏毒素活性(Balint等，CancerRes,，44，734，1984)。Balint等(同上)和其他人(Das等，1985，Analyt.Biochem.，145，27-36)證明可通過凝膠過濾分離這種IgG-蛋白復合物與未形成復合物的IgG。此方法的缺點在于處理量低和抗體損失。如US6,399,750所述，經一根硫醚鍵與柱基質相連的重組A蛋白制劑的最新商業(yè)化產品有較高的A蛋白柱容量。但同時，與通過CNBr偶聯得到的傳統(tǒng)多點連接天然A蛋白基質相比，這種重組A蛋白基質的脫落率經常急劇上升。US4,983,722描述了通過將污染性A蛋白與A蛋白純化的抗體制品混合物吸附到陰離子交換材料，在離子強度升高條件下依次洗脫抗體與A蛋白來分離這二種成分的選擇性分離方法。該分辨方法高度依賴于抗體的pl，但對于給定抗體，其分辨率極為不同。此外，獲得良好分離所需的鹽梯度斜率限制了處理除了除去A蛋白復合物以外，涉及抗體(但可拓展至任何其它類型的生物醫(yī)藥蛋白)的另一純化問題是均質二聚體與更高聚凝聚體的形成。與A蛋白形成復合物(這主要基于親和力甚至天然蛋白質也能形成)相反，自發(fā)性或者鹽或pH誘導的至少一部分蛋白質變性使得溶劑可接近表面的疏水性區(qū)域暴露導致抗體或類似蛋白質受均質化學質量定律(chemicalmasslaw)的驅動開始形成凝聚體。因此，與基于親和力的復合物形成相反，非特異性凝聚主要受溶劑排斥作用(solventexclusioneffect)驅動，在這點上類似于晶體生長行為。最初仍可溶的凝聚物隨時間而增加，進而蛋白質從溶液中沉淀。藥物給予后，低百分比的污染性凝聚物還可引發(fā)有害的免疫應答反應。迄今為止，能可靠地除去凝聚物幾乎只有尺寸排阻層析(SEC);然而，SEC是純化的瓶頸，與其它層析技術相比，它需要大量處理時間、材料昂貴并且加載容量低。本發(fā)明的目的之一是設計另一種方法來分離A蛋白或A蛋白片段與抗體(優(yōu)選IgG)和/或分離抗體凝聚物或其它產物蛋白的均質凝聚物，該方法避免了現有技術的缺點。采用本發(fā)明方法實現了此目的。本發(fā)明設計的純化抗體方法包括以下步驟首先，通過A蛋白親和層析純化抗體，其中A蛋白是天然A蛋白或其功能衍生物；第二步，在污染性A蛋白或其功能衍生物與離子交換材料結合的條件下(該條件能通過分級流通液中的抗體凝聚物與未和A蛋白或A蛋白衍生物形成復合物的抗體單體而分辨流通液)，將含抗體凝聚物和A蛋白或A蛋白衍生物的純化抗體加載到離子交換材料上；第三、第四步是分級該流通液收集離子交換劑流通液中至少一種抗體單體級分，該級分與加載于離子交換材料前的抗體組成相比，其A蛋白或A蛋白衍生物與抗體凝聚物含量降低。本發(fā)明方法優(yōu)選能將如此純化的抗體單體中凝聚物含量降低到1.0%以下，更優(yōu)選在所述或第一離子交換步驟流通液中最終收集的所有抗體的凝聚物低于0.5%。因此，通過技術人員熟知的分析性體積排阻層析測定，本發(fā)明方法離子交換步驟后得到的抗體單體至少為99%，更優(yōu)選至少為99.5%。還優(yōu)選在所述離子交換劑流通液收集級分中回收到加載于離子交換材料上抗體總量的至少70%、更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少90%，而污染性A蛋白或A蛋白衍生物與離子交換材料保持結合。本發(fā)明的凝聚物應理解為相同蛋白質的非共價結合，優(yōu)選以至少l(T7M或以下(該數值低表示結合較緊密)的結合平衡常數結合，所述蛋白質可以由單鏈蛋白質或共價結合(例如通過二硫鍵結合)的均質或異質多條多肽構成。與衍生其的單體一樣，本發(fā)明的凝聚物可溶于水溶液。例如，本發(fā)明IgG抗體的"單體"涉及分別含有兩條相同的糖基化重鏈和輕鏈的標準四聚體抗體。那么，例如二聚體凝聚物是兩個IgG分子的非特異性結合。凝聚物的形成與對天然蛋白質折疊和蛋白質四級結構的變性影響(因素)緊密相關；例如加熱與pH誘導的蛋白質折疊變性可引發(fā)凝聚。因此，給定蛋白的凝聚速率有高度特異性，取決于各蛋白質折疊特定攻擊的能量穩(wěn)定性(Chiti等，2004，"突變對蛋白質凝聚速率作用的合理解釋"(Rationalizationoftheeffectsofmutationsonproteinaggregationrates)，Nature，424:805-808)。A蛋白是金黃色葡萄球菌OSYa;/^/ococc^aw"w"中發(fā)現的細胞表面蛋白。其具有結合哺乳動物抗體，特別是IgG類抗體Fc區(qū)的特性。在給定的一類抗體中，親和力會根據物種來源與抗體亞類或同種異型而略有不同(綜述見Surolia，A.等，1982，"A蛋白天然的通用抗體"(ProteinA:Nature'suniversal,antibody),TIBS,7，74-76;Langone等，1982，"金黃色葡萄球菌A蛋白及相關的免疫球蛋白受體"(ProteinAofstaphylococcusaureusandrelatedimmunoglobulinreceptors,AdvancesinImmunology),32:157-252)。A蛋白可從分泌A蛋白的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中直接分離，或者不難在大腸桿菌(￡.//)中重組表達(1^(^(1&111等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,80:697-701)?，F有技術詳細描述了A蛋白在純化抗體，特別是單克隆IgG中的應用(例如，Langone等，同上；Hjdm等，1972，FEBSLett.，28:73-76)。為用于A蛋白親和層析，可將A蛋白偶聯于固體基質，例如交聯的無電荷瓊脂糖(Sepharose，不具有天然未精制瓊脂糖所含的帶電荷組分)、trisacryl交聯的葡聚糖或二氧化硅材料。這種偶聯的方法是本領域公知的，例如通過蛋白質的伯胺官能團偶聯于CNBr活化基質。A蛋白以高親和力和高特異性與IgG的Fc部分結合，即Langone等(1982，同上)所述IgG的Cy2-Cy3界面區(qū)。特別是A蛋白能與人的同種異型或亞類IgGl、IgG2、IgG3和小鼠同種異型或亞類IgG2a、IgG2b、IgG3強烈結合。A蛋白也顯示對VH基因家族，VHIII編碼的免疫球蛋白Fab區(qū)有親和力(Sasso等，1991，J.Immunol,61:3026-3031;Hilson等，JExp.Med.，178:331-336，(1993))。其編碼A蛋白的基因序列顯示有兩個功能相異的區(qū)域(Uhlen等，J.Biol.Chem.，259:1695-1702，(1984);Lofdahl等，Proc.Nutl.Acad.Sci.，(USA),80:697-701，(1983))。其氨基末端區(qū)域含有5個高度同源的IgG結合結構域(稱為E、D、A、B和C)，而羧基末端區(qū)域將該蛋白質錨定在細胞壁和細胞膜上。以A蛋白的B結構為例，如Deisenhofer等(1981，Biochemistry,20:2361-2370)禾口Sauer-Eriksson等(1995，Structure,3:265-278)的晶體結構所示，A蛋白的所有5個IgG結合結構域與IgG的Fc區(qū)結合，包括例如人IgG-Fc殘基252-254、433-435與311。Gouda等(1998，Biochemistry,37:129-136)的NMR-溶液研究證實，發(fā)現Fc部分的兩個基本上毗連的主要結合位點。A蛋白的IgG-結合結構域A-E之一在原理上足以結合IgG的Fc部分。此外，發(fā)現VH3結構域家族的某些人類等位基因可任選通過A蛋白介導與人IgG結合(Ibrahim等，1993，J.Immunol.，151:3597-3603;"V-區(qū)通過A蛋白介導與人IgG結合"(V-regionmediatedbindingofhumanIgbyproteinA))。在本申請中，本發(fā)明另一目的，凡是說到適用于抗體Fc區(qū)域與A蛋白結合，也同樣適用于抗體經VH3家族A-蛋白結合等位體的結合，如果這種抗體的Fc區(qū)域本身不能以高親和力與A蛋白結合時。可認為這是本發(fā)明主要Fc方法的等價實施方案；以下部分進一步描述了Fc方法。本發(fā)明的IgG抗體應理解為能以高親和力方式與A蛋白結合的同種異體抗體。此外，除與A蛋白結合有關的抗體Fc部分外，這種抗體不一定對應于天然產生的抗體。特別是在其可變區(qū)部分，它可以是如本領域常規(guī)設計的工程改造的嵌合抗體或CDR嫁接抗體。簡言之，本發(fā)明的IgG抗體應理解為IgG型抗體。本發(fā)明的A蛋白或A蛋白片段功能衍生物的特征是對小鼠IgG2a或人IgGl的Fc部分的結合常數至少為K二1(T8M，優(yōu)選K^10一M。本文將符合這種結合常數值的相互作用稱為"高親和力結合"。A蛋白的這種功能性衍生物優(yōu)選含有野生型A蛋白的功能性IgG結合結構域的至少一部分，該結構域選自天然結構域E、D、A、B、C或其保留了IgG結合功能的工程改造的突變蛋白。如US6013763所述，這種衍生物的例子是A蛋白的B結構域的功能性59個氨基酸的"Z"-片段，該B結構域可用于抗體純化。然而，本發(fā)明的抗體結合片段優(yōu)選至少含有兩個本段定義的完整Fc結合結構域。其例子是重組A蛋白序列，例如RepligenCorporation的EP-282308和EP-284368中所述。還優(yōu)選(單獨或與上述A蛋白或A蛋白功能性衍生物組合)工程改造從而能單點連接的A蛋白衍生物。單點連接表示蛋白質部分經一條共價鍵與A蛋白親和層析的層析支持材料相連。這種單點連接是通過合適的反應性殘基，所述殘基最好位于接近N-或C-末端的暴露氨基酸位置(即環(huán)中)或位于該蛋白質折疊的外周處。合適的反應性基團是例如巰基或氨基。這種重組A蛋白或其功能性片段更優(yōu)選在其氨基酸序列中包含半胱氨酸。所述半胱氨酸最優(yōu)選包含在由重組A蛋白或其功能性片段C-末端的最后30個氨基酸構成的區(qū)段中。在這種類型的另一優(yōu)選實施方案中，重組A蛋白或其功能性片段的至少50%經硫醚硫鍵與A蛋白親和層析介質的層析支持物或基質材料相連。這種實施方案的一個例子描述于，例如Pharmacia的US6399750，并可根據所用支持基質的性質以商品名StreamlineTM或MabSelectTM購自Amersham-Biosciences。在本文中，硫醚鍵應狹義地理解為-S-鍵合方式，而無論其化學成分，在這點上與常規(guī)化學術語有偏差；例如，本發(fā)明的所述-S-"硫醚"鍵橋可以是較大基團，例如硫酯或混合乙縮醛的一部分，在這點上與化學家根據反應性取名的常規(guī)術語有偏差。硫醚鍵橋在其常規(guī)的狹義化學含意上優(yōu)選硫醚鍵橋。這種橋連硫醚基團可以是，例如通過使A蛋白的半胱氨酸殘基的巰基與活化的層析支持材料所含有的環(huán)氧基團反應而產生。利用末端半胱氨酸殘基可在適合于僅偶聯蛋白質暴露的唯一巰基的條件下進行這種反應，從而只導致這種蛋白質的單點連接。在一特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的A蛋白或功能性A蛋白衍生物是US6399750所述的重組A蛋白，其近末端(juxtaterminal)含有一個工程改造的半胱氨酸殘基，并且優(yōu)選至少50%、更優(yōu)選至少70%通過所述半胱氨酸殘基的硫原子作為單一連接點與層析支持材料偶聯。還優(yōu)選通過環(huán)氧化物介導的活化實現這種偶聯，更優(yōu)選采用1,4-雙-(2,3-環(huán)氧丙氧基)丁烷活化，例如瓊脂糖基質，如SepharoseFastFlow(用環(huán)氧氯丙垸交聯的瓊脂糖珠，AmershamBiosciences,英國)或采用環(huán)氧氯丙烷活化，例如瓊脂糖基質，如SepharoseFF。結合本段上述優(yōu)選實施方案，還優(yōu)選第一離子交換劑是陰離子交換劑，特別是季胺陰離子交換劑，例如SepharoseQTMFF(Amersham-Biosciences/Pharmacia)，更優(yōu)選在基質支持物上偶聯有功能交換性基團Q的陰離子交換劑，所述基團Q是N,N，N-三甲基氨基-甲基，最優(yōu)選的陰離子交換劑是Pharmacia/AmershamBiosciences的SepharoseQFF。季胺基團是對加載/洗滌緩沖液的pH變化不敏感的強交換劑。快速流(fastflow)交換劑的基礎是高交聯度較高物理穩(wěn)定性的45-0165瓊脂糖珠；還有此瓊脂糖凝膠(sepharose)除去了天然瓊脂糖的帶電荷硫酸化分子組分從而即使在抗體高載量條件下也不會發(fā)生抗體的非特異性基質吸附。這種實施方案的例子見實驗章節(jié)。本發(fā)明的污染性A蛋白是上述A蛋白或其功能性衍生物的任何類型的功能性IgG結合產物(offspring)，獲自A蛋白親和層析柱上洗脫所結合抗體時。例如，肽鍵水解可產生這種污染性A蛋白物質，這種水解在利用酶的作用，特別是工業(yè)生產中非?？赡馨l(fā)生。A蛋白層析適用于下游處理的早期步驟，此時未精制純化的新鮮產物溶液仍含有相當的蛋白酶活性。細胞培養(yǎng)液中將死的細胞或在初步離心或過濾步驟中破裂的細胞很可能放出游離的蛋白酶；與生物化學研究實踐相反，為質控目的而通常在下游處理前或期間不補加含有蛋白酶抑制劑的細胞培養(yǎng)^^。(蛋白酶抑制劑的)例子是苯基-甲基-磺酰氯(PMSF)或e-己酸。這種化學試劑在生物藥物生產中是有害的添加劑。取決于A蛋白質折疊的四級結構，其重組功能性衍生物或片段對蛋白酶的耐受性也可能不如野生型A蛋白。一旦結合結構域的總數減少，連接各IgG結合結構域的氨基酸區(qū)段可能暴露。結構域間的接觸可能有助于結構域折疊的穩(wěn)定性。因為抗體結合時所誘導的構象變化，A蛋白或其所述功能性衍生物與抗體結合也可能影響或促進了對蛋白酶作用的易感性。野生型或全長A蛋白或其功能性工程改造片段也可能表現不同。本發(fā)明的污染性A蛋白優(yōu)選仍是功能性的IgG結合蛋白，因此當將其加載于隨后的本發(fā)明離子交換分離介質上時能與A蛋白純化的抗體結合。污染性A蛋白與純化的抗體的高親和力結合是為何難于有效地分離二者的原因。按照本發(fā)明，優(yōu)選先從細胞培養(yǎng)液中收集待純化的抗體，通過A蛋白親和層析純化所述抗體。更優(yōu)選所述細胞培養(yǎng)液是哺乳動物細胞培養(yǎng)液。哺乳動物細胞具有稱為溶酶體的較大區(qū)室，其中含有在細胞死亡或收集時細胞破壞釋放的降解酶。具體地說，所述細胞培養(yǎng)液可以是骨髓瘤細胞培養(yǎng)液，例如NSO細胞(Galfre，G.和Milstein，C.，MethodsEnzymology，1981，73，3)。骨髓瘤細胞是漿細胞瘤細胞，即淋巴細胞譜系細胞。示例性NSO細胞系是，例如可從英國，WiltshireSP40JG，Salisbury,應用微生物與研究中心(CentreforAppliedMicrobiology&Research)，歐洲細胞培養(yǎng)物保藏所(EuropeanCollectionofCellCultures)(ECACC)自由獲得的細胞系ECACC第85110503號。已發(fā)現NSO能產生極高的產物產量，特別是如果用于生產重組抗體時。進而發(fā)現與至少用于某些A蛋白親和層析系統(tǒng)的其它宿主類型細胞相比，NSO細胞可重現地產生了更高水平的污染性A蛋白，所述系統(tǒng)采用可能是單點連接的野生型A蛋白的重組縮短片段。這種系統(tǒng)的例子有Streamline重組A蛋白親和層析樹脂(AmershamBiosciences;US6,399,750所述的基本上硫酯單點連接的重組A蛋白)。利用StreamlineTM重組A蛋白親和柱可得到大約或超過1000ng污染性A蛋白/mg抗體的水平。本發(fā)明方法與現有技術的區(qū)別在于能在一步快速純化步驟中有效地將污染性A蛋白從所述高水平降至〈lng/mg抗體，即純化系數約IOOOX。待用A蛋白親和層析純化的抗體還優(yōu)選(單獨或與前段組合)不處理從而在收集時或收集后滅活蛋白酶，更優(yōu)選抗體在收集后不與至少一種外源性補加的蛋白酶抑制劑混合。在本文中，蛋白酶抑制劑是能選擇性抑制蛋白酶，同時不會化學修飾抗體蛋白的三級和/或四級結構或對其無害的任何種類化學試劑(不是蛋白酶)；蛋白酶抑制劑的例子是螯合劑，例如可能認為螯合對金屬蛋白酶活性重要的金屬離子的EDTA以及鹽酸N-[(2S,3R)-3-氨基-2-羥基-4-苯基丁?；鵠-L-亮氨酸[苯丁抑制素](等效抗金屬蛋白酶活性)是這類抑制劑。最優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑選自PMSF和Laskowski等(1980，"蛋白酶的蛋白質抑制劑"(Proteininhibitorsofproteinases)，Ann.Rev.Biochem.，49，593-626)所述的特異性蛋白酶抑制肽。例子是亮抑肽酶和抑蛋白酶肽。技術文獻中己廣泛描述了A蛋白親和層析的操作，無需贅述。除上述以外的其它例子是，例如Duhamel等(J.ImmunologicalMethods,31，(1979)，211-217)所述的從A蛋白-Sepharose上pH梯度洗脫人IgGl、IgG2和IgG4。當然，洗脫時要與約pH3-4.5的酸性pH條件接觸，即使緊接著立即將緩沖液更換為約pH7.5，也肯定會形成凝聚物。在20世紀80年代早期，A蛋白層析開始廣泛應用并與傳統(tǒng)層析培訓作比較時覺察到此問題。在其它優(yōu)選實施方案中，酸洗脫A蛋白基質后進行病毒滅活處理，再將如此純化的抗體加載于第一離子交換劑上，其中病毒滅活處理更優(yōu)選包括在pH3.5-pH4.5進行低pH培育約50-90分鐘，溫度優(yōu)選至少30'C,更優(yōu)選至少45'C，或經孔徑小于lpm，優(yōu)選小于0.25pm的動物病毒減少過濾器過濾。因此，在降低凝聚物含量同時除去污染性A蛋白或A蛋白衍生物之前，宜插入另一重要的處理步驟以確保凝聚物再形成并確保凝聚物生長；所述處理可以是，例如酸性pH時的(熱)攻擊使病毒的蛋白質衣殼變性或使之組裝解離(de-assemble)，或者可用超濾步驟，該步驟也受膜變性作用的影響。病毒減少處理優(yōu)選低pH培育步驟，易于獲得系數約為6-8的log病毒減少。在一優(yōu)選的實施方案中，利用低于5mS/cm、優(yōu)選低于3mS/cm、更優(yōu)選低于2mS/cm、最優(yōu)選約1.2mS/cm或更低的低電導率洗脫緩沖液從A蛋白層析柱上洗脫抗體，制備1X緩沖溶液，用于從A蛋白柱上洗脫抗體產物蛋白。這種緩沖液同樣優(yōu)選應具有至少0.1mS/cm、優(yōu)選至少0.5mS/cm、最優(yōu)選至少0.8mS/cm的最低電導率。意外的是，在本發(fā)明的該方面，證明這種低電導率緩沖液(不依賴于所用緩沖鹽的化學性質)一致顯示i.從A蛋白柱上洗脫時的凝聚物含量低，ii.在隨后的酸或低pH病毒滅活步驟中(然后立即將pH再調節(jié)至約中性pH，即pH6.5-7.5)凝聚物含量大多數適度升高，和iii.在酸性pH處理期間病毒的log仍顯著減少，一般在接觸60分鐘后得到的log減少系數約為7。低電導率緩沖液的這種共同益處尚不明白。應注意在較高電導率(約5-20mS/cm)時，緩沖鹽的性質強烈影響凝聚物含量的增加。應注意電導率為5-10mS/cm和以上的檸檬酸鹽導致酸性pH病毒滅活步驟中凝聚物比例極大升高。因此，在其它優(yōu)選的實施方案中(單獨或與上述低電導率洗脫緩沖液的其它實施方案組合)，A蛋白層析洗脫緩沖液利用pKa值約3-4的單價羧酸和/或其對應的單羧酸鹽，例如其堿或堿土羧酸鹽作為緩沖鹽，更優(yōu)選利用甲酸鹽/甲酸。任選地，優(yōu)選所述單羧酸鹽或羧酸是單價a-氨基酸，其側鏈中沒有pH4時帶電荷的任何基團，除了114]^+-(:^1-(:00-頭基團(116&(1group)外，其中R是側鏈基團，所述氨基酸沒有巰基官能團，優(yōu)選在pH4時是水溶性，濃度至少為5mM，更優(yōu)選至少10mM，還優(yōu)選其羧酸官能團的pKa值(pK^)為pH2-3。所述氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，優(yōu)選天然氨基酸。天然氨基酸羧基頭基團的pKa值見Dawson等，《生物化學研究數據》(DataforBiochemicalResearch),第二版，第1-63頁，牛津大學出版社(1969)。更優(yōu)選所述氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、Cl-C5烷基羥基氨基酸，例如絲氨酸或蘇氨酸、或C1-C5垸氧基垸基或可能的聚烷氧基(polyoxyalkyl)氨基酸。強烈優(yōu)選使用甘氨酸作為配制本發(fā)明A蛋白層析步驟的洗脫緩沖液的緩沖氨基酸。在第一離子交換劑的流通液中，污染性A蛋白濃度宜降低至〈10ng/mg抗體、更優(yōu)選〈4ng/mg抗體、最優(yōu)選<1ng/mg抗體，其中抗體宜理解為指IgG。實驗部分詳述了驗證這些閾值的Elisa測定方法，應注意將樣品酸化至pH-4(優(yōu)選有溫和的去污劑存在)對精確測定脫落的A蛋白的含量至關重要。此閾值當然應理解為不能超過第一離子交換劑A蛋白結合的加載容量，(否則)將不可避免地導致污染性A蛋白漏出(break-through)。US4,983,722描述了測定A蛋白或A蛋白片段的合適Elisa方法。合適的抗A蛋白抗體可購得，例如購自Sigma-Aldrich。具體地說，當利用工程改造而含有額外巰基的A蛋白衍生物時，適當維持該蛋白質標準品至關重要。驗證作為測試樣品定量標準品的這種純A蛋白衍生物的單體特征至關重要，因為通過-S-S-橋形成的共價二聚體或多聚體可導致錯誤結果。不難在還原與非還原條件下進行本領域常規(guī)的SDS-PAGE分析來驗證。因此，利用DTT或(3-巰基乙醇還原這種A蛋白衍生物-標準品溶液有助于防止ELISA技術中的測量誤差。在本發(fā)明方法中，還優(yōu)選從離子交換劑的流通液中回收到加載于第一離子交換劑上抗體的至少70%、更優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%。優(yōu)選(無論同一抗體的糖形式與最終處理的變體)在起始混合物中只存在一種(動物)類型抗體通過A蛋白親和層析，然后經本發(fā)明離子交換層析純化。例如，當按照本發(fā)明純化人或人-小鼠嵌合型或靈長類或靈長類化IgG抗體時，在補加血清的細胞培養(yǎng)液中不應存在可能從血清帶入的牛IgG。換言之，本發(fā)明方法宜用于收集無血清細胞培養(yǎng)液中粗制未純化的抗體。本發(fā)明的第一離子交換劑是陰離子交換樹脂；如EP-289129Bl所述，A蛋白可與兩種類型樹脂結合。可將離子交換樹脂浸入輕柔攪拌的樣品溶液，然后采用過濾替換液體介質，從而以層析柱方式和確定流速，或以分批操作方式來操作該第一離子交換劑或陰離子交換劑?？砂凑毡景l(fā)明并考慮給定抗體的PI來確定加載第一離子交換劑的合適pH與離子強度條件，所述條件能將抗體保持在流通液中而同時A蛋白污染物結合(于交換劑)，從而除去抗體。如上所述，本發(fā)明方法能快速分離抗體與污染性A蛋白。與基質支持物相連的這種第一陰離子交換劑的官能團的例子是，例如伯氨基、仲氨基，特別是叔氨基或季氨基，如氨基乙基、二乙基氨基乙基、三甲基氨基乙基、三甲基氨基甲基與二乙基-(2-羥丙基)-氨基乙基。本領域己知陰離子交換劑的合適層析支持基質。例子是瓊脂糖樹脂和珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯珠與聚苯乙烯/二乙烯基-苯樹脂。同樣還能用離子交換膜吸附劑(例如，Sartorius的SartobindQ)。顯然為了提高流速并縮短分離時間，基質材料可以是灌注材料(perfusionmaterial),這是另一優(yōu)選實施方案。所述材料可由含陶瓷基質的精制灌注珠基質(cp.例如Afeyan等，1991，J.Chromatography,544，267-279)構成，或者可以是整體式(monolithic)灌注材料，例如SepragenInc.(Hayward,加利福尼亞/美國)出售的商品名為SepraSorb②的快流速材料。SepraSorb⑧是專門開發(fā)作為珠基質的替代品。它是交聯的海綿樣再生纖維素材料，具有連續(xù)的互通開孔(50-300)Lim)結構。此整體式基質具有其上不難固定離子交換官能團0DEAE，QM，CM和SE)的易于接近的表面。與在常規(guī)介質中進料液流過珠的周圍不同，進料液流實際上象灌注一樣流入該連續(xù)基質的互通孔。相比于珠介質，SepraSorba在生產規(guī)模有許多優(yōu)點。它不難承受100ml/分鐘的流速，而反壓很少超過1巴(14.5psi)。整體式基質非常易于操作與配置，避免了繁重與耗時的裝柱。該基質能防止堵塞、溝流并耐破碎，因此能延長使用時間與循環(huán)使用次數。最優(yōu)選的離子交換劑是瓊脂糖基質上連接有季氨基的陰離子交換劑，例如Amersham-Biosciences/Pharmacia的SepharoseCL-6B或SepharoseFastFlow(FF)。這種交換劑的例子是Amersham-Biosciences/Pharmacia的SepharoseQTM。還優(yōu)選(聯用第一陰離子交換劑)本發(fā)明抗體是等電點(pl)比上述A蛋白親和層析步驟中所用A蛋白的pI高至少兩個pH單位的單克隆抗體，即該抗體更偏堿性；例如天然A蛋白的pl約5.0，而液流(中)重組A蛋白的pl約4.5。本發(fā)明抗體優(yōu)選等電點(pl)至少為6.5或更高，更優(yōu)選7.0或更高，最優(yōu)選pl至少7.5或更高的單克隆抗體。應該注意此pl指實際收獲與純化抗體的pl，不是只從氨基酸序列預計的pl。還可修飾實際純化的抗體分子的多肽骨架，例如糖基化，所述修飾可以是加入帶電荷的部分從而改變該分子的pl。通過等電點聚焦(IEF)測定產物抗體的pl后，抗體蛋白，例如單克隆抗體蛋白翻譯后加工形成的微小不均一性各糖基化形式的產物抗體導致更寬的pl范圍，所有這些抗體在IEF凝膠中形成類似于成片的條帶而非單一條帶，至少大多數產物有特定(pl)數值。按照本發(fā)明，在上述這種優(yōu)選實施方案中，"抗體的pl"指pl處于上述pl優(yōu)選范圍內的抗體產物分子所共有的pl。本說明書的所有其它定義，例如經給定純化步驟后回收的抗體比例％僅指所述抗體共有的pl。(近似地)實驗測定的"成片條帶"范圍的平均pi數字值還宜理解為本發(fā)明的pi或平均pl，假定這合理公平地代表了糖基化形式(抗體)的數量分布。就同時除去凝聚物和污染性A蛋白或A蛋白衍生物的共同目的而言，優(yōu)選將加載和清洗第一離子交換劑所用緩沖液pH的設置為能避免接觸緩沖液時離子交換材料的帶電荷基團與A蛋白或A蛋白污染物和待純化抗體之間在總體上的直接排斥。如果要在所施加的緩沖條件下使A蛋白物質與離子交換劑靜電結合，同時在相同緩沖條件下抗體不結合，接著應考慮抗體與A蛋白或A蛋白衍生物的pI，故第一離子交換劑通常應是在接近或高于待純化抗體pi的pH下操作的陰離子交換劑。所以抗體的表面電荷可以為0或為負，但不能直接(bkmtly)為正從而發(fā)生排斥。然后適當調節(jié)離子強度條件對實現抗體不結合而A蛋白結合至關重要。然而，這確實屬于上述平均pl值；因此就糖基化形式的抗體而言，這不意味著糖基化形式抗體的較少有共同的pi值或有不相接近的pl(范圍)。此外，鑒于要除去凝聚物，應考慮以流通方式分辨單體與凝聚物，但部分作用至少歸因于短暫而弱的離子相互吸引作用與非結合方式的離子交換；單體和凝聚物的表面電荷及pi顯示有微小差異；因此本發(fā)明方法至少對某些抗體成功有效，即使(例如)在利用陰離子交換劑時緩沖液pH的范圍最多比抗體的pi低0.5個pH單位(反之亦然，鑒于只需除去凝聚物，當利用陽離子交換劑時緩沖液的pH應比抗體的pI高0.5個pH單位，見以下)，事后該現象的解釋是因為只有含不同可接近表面并且最終是中性或甚至帶負電荷的單體而不是凝聚物受到離子交換材料的離子力主動排斥。然而，實施本發(fā)明的此方案高度依賴于凝聚物的pi及其不可預測的凝聚特性，從而不能用于估計任何給定的抗體。根據另一優(yōu)選的實施方案，對于最佳分離污染性A蛋白與凝聚物，利用待純化抗體的平均pi的來設置緩沖液pH不理想；在本發(fā)明的非結合層析條件下，產生收集的含有抗體產物峰流通液的加載與清洗第一陰離子交換劑的緩沖液pH優(yōu)選設置為高于抗體單體的pl，更優(yōu)選設置為高于該抗體單體的pi+0.5個pH單位。本發(fā)明第一陰離子交換劑的操作方式需要用第一陰離子交換劑的平衡緩沖液更換A蛋白親和層析步驟的酸性或中和洗脫緩沖液。在本發(fā)明方法中平衡緩沖液與加載緩沖液相同。常規(guī)使用的超濾裝置(例如Amicon或Millipore出售的)可方便地用于該目的；那些裝置能避免稀釋作用同時能用，例如低分子量多孔過濾基質，例如SephadexG-25。本發(fā)明的平衡緩沖液優(yōu)選置換劑(例如，氯化鈉)的鹽濃度范圍是1-150mM，更優(yōu)選5-110mM，最優(yōu)選20-100mM。平衡緩沖液的pH優(yōu)選pH6.5-pH9.0，更優(yōu)選pH7.5-pH8.5，最優(yōu)選pH7.9-pH8.4。應注意蛋白質的N-末端氨基官能團的pKs值約為9.25，因此污染性A蛋白和任何其它帶負電荷蛋白質與陰離子交換劑能在更偏堿性的pH下強烈結合；就給定的應用而言，可能需要微調加載緩沖液的pH以最佳區(qū)分一對給定抗體和污染性A蛋白的結合與非結合(情況)，所述抗體和污染性A蛋白具有不同的pi值和不同的半胱氨酸和組氨酸側鏈含量，而導致在所選擇的pH區(qū)域內電荷改變。此外，由于離子強度增加，較堿性pH可干擾A蛋白-抗體相互作用；同樣，需要微調離子強度以平衡防止抗體結合，這是除去污染性A蛋白結合的需要。技術人員當然知道該緩沖液的離子強度通常與pH值呈逆相關；A蛋白(取決于pH)與陰離子交換劑結合越強，防止抗體結合與干擾潛在的A蛋白-抗體相互作用需要耐受的鹽越多。因此，pH與置換劑鹽的上述范圍應理解為是相關的pH越低，實施本發(fā)明的上述優(yōu)選范圍所允許的鹽越少。將pH緩沖物質加入其它鹽負載，進一步增加了溶液的離子強度。可通過檢測平衡緩沖液的電導率測定離子強度。術語"電導率"指水溶液在兩個電極之間傳導電流的能力，可衡量離子總量，還考慮了電荷與離子遷移率。因此，隨著水溶液中離子含量增加，溶液將具有較高的電導率。衡量電導率的單位是mS/cm(毫西門子/厘米)，用可購得的電導儀，例如T叩acInc.(Hingham，MA/U.S.A.)或Honeywell的電導儀檢測。在本申請中，所有數值屬于25'C的具體電導率。第一陰離子交換步驟的加載或平衡緩沖液的電導率為0.5-5mS/cm，更優(yōu)選1-3mS/cm，最優(yōu)選1.25-2.5mS/cm。電導率最好約為2mS/cm。合適緩沖鹽的例子見Good,N.E.(1986，Biochemistry,5:467-476)。例如，常規(guī)使用的Tris.HCl緩沖液或磷酸氫鈉緩沖液是合適的緩沖物質。緩沖物質的濃度通常為，例如10-40mM緩沖鹽。在可能用于設計緩沖液的陰離子中，優(yōu)選陰離子洗脫液的特定強度低于氯陰離子，低洗脫強度性能大致與離子電荷密度呈逆相關并與離子大小成比例。陰離子洗脫液強度的經驗比較見生物化學教材中的表格。本發(fā)明緩沖物質更優(yōu)選是磷酸鹽緩沖液。磷酸氫鹽具有低洗脫強度，尤其是如果采用的pH等于或低于8時，特別低的離液性能使其更出眾。在另一優(yōu)選實施方案中，第一陰離子交換劑是陶瓷基質陰離子交換劑，例如Biosepra-brandedHyperD②陰離子交換劑，更優(yōu)選含有季銨(=季胺)的離子與基質結合的官能團的陶瓷基質陰離子交換劑。這些交換劑對治療性規(guī)模純化極其有用。季(胺)陶瓷陰離子交換劑最優(yōu)選Q-陶瓷基質陰離子交換劑，例如(特別優(yōu)選)英國，Guildford/Surrey，CiphergenBiosystemsLtd.，以商品名"Biosepra，，出售的Q-HyperD⑧陰離子交換樹脂。上述和下文提及的抗體pl，蛋白質加載和緩沖液pH的優(yōu)選實施方案也優(yōu)選與本實施方案聯用，除了當利用Q-HyperD材料，特別是利用Q-HyperD⑧-F離子交換劑時，緩沖液的優(yōu)選電導率最好是0.5-2mS/cm，更優(yōu)選為0.6-1.7mS/cm，最優(yōu)選約為1-1.5mS/cm。就從產物蛋白中除去污染性A蛋白或其片段而言，此電導率確保了最佳純化結果。利用剛性多孔珠制成的陶瓷HYPERD吸附劑，其用功能化水凝膠包衣和滲透。這賦予這些珠出眾的硬度與流動性能，以及罕有的傳質和動力學特性。陶瓷HYPERD吸附劑非常易于使用。它們較高的密度使其易于裝柱并可用于非常大的柱中。它們完全不收縮或溶脹因而無需反復裝柱/拆柱。目前，利用500升以上的柱作為治療用分子的制備型層析。用于制備過程的陶瓷HYPERD離子交換劑也可得到50pm級(F級)，它們的高容量和較低反壓使50級可完美用于捕獲過程與通常的下游處理。珠的陶瓷性質使其在化學上非常穩(wěn)定，可采用最常用的清潔劑，包括0.5MNaOH清潔。上述條件為用以流通方式除去污染性A蛋白設立了框架。為進一步同時從給定的抗體單體中除去凝聚物，需要在上述緩沖鹽的電導率、pH和身份等一般范圍內進一步小心測試以確定允許的條件，就給定抗體而言，這些條件可同時除去A蛋白并分辨凝聚物。如上所述，這對給定抗體高度特異，不能用通用術語作進一步定義。在實驗部分進一步舉例說明了此研究，顯示以非結合方式操作陰離子交換基質可導致凝聚物與單體分級，從而使分辨的凝聚物主要存在于流通液中抗體的非結合蛋白質峰部分下降之處。該驚人發(fā)現不僅可應用于抗體產物蛋白單體的純化，而不考慮A蛋白。通過小心選擇與合并各級分，可減少第一離子交換劑流通液的主要洗脫峰中的凝聚物水平。這種發(fā)現以前在科學文獻中未見報道，因為未預計到流通液-流動相與固相，即離子交換材料會明顯相互作用而未預見到這些發(fā)現。最驚人的是，在流通緩沖液的pH遠離產物蛋白或抗體單體的平均pl時發(fā)生流通液凝聚物拖尾效應，并且該電荷狀態(tài)(chargewise)使得在靜電結合所不允許的離子強度下發(fā)生離子吸引。發(fā)現陰離子和陽離子交換劑能以此方式分辨流通液級分中的凝聚物或使之拖尾。推測且不受這種解釋的束縛，如上所述，可以事后提出與離子交換劑某些弱的但動態(tài)性的離子吸引至少部分促進此效應?；|支持材料可能產生其它作用。在本發(fā)明離子交換樹脂上以流通方式分離凝聚物與產物蛋白單體或抗體單體的一適度(temptativdy)優(yōu)選實施方案中，第一陰離子交換劑的基質材料是聚合的多元醇或多糖。所述分辨作用的親合力受同一分子上富余結合位點的擴大，凝聚物越大可能對此貢獻越大。那么二聚體凝聚物(例如兩個IgG抗體構成)仍可成功地與本發(fā)明方法的單體IgG抗體相分離。盡管可用分批方式操作，優(yōu)選第一陰離子交換劑步驟是柱操作方式。在該情況中，優(yōu)選采用約10-60ml/小時的流速。所加載抗體的加載濃度最好為10-30mg抗體/ml交換樹脂。技術人員當然知道利用極稀的樣品會降低抗體的產率。待純化抗體收集在加樣操作的流通液(low-through)中，包括用相同的平衡緩沖液洗滌約1個柱體積。將流通液的pH調節(jié)至中性以提高穩(wěn)定性并防止抗體蛋白的新凝聚和/或沉淀?？傮w上應注意，本發(fā)明方法不能應用于產生的針對A蛋白所攜帶表位的抗體。放棄這種抗體，雖然這是對技術人員的明顯限制。還應注意本發(fā)明的"第一"離子交換層析步驟的含義是開放式定義，它只考慮了本發(fā)明各步驟的時間順序；不應排除以傳統(tǒng)的結合與洗脫方式進行待純化蛋白或抗體蛋白的任何插入性離子交換層析步驟。本發(fā)明方法最吸引人的特征是以非結合或流通方式經陰離子交換劑純化抗體，柱的容量根本不會限制材料的處理量；此容量只決定所保留的污染性A蛋白的最低含量。這省去了許多處理時間和原料，同時能非常有效地除去A蛋白污染物。早已部分提到的本發(fā)明上述另一目的是從待純化產物蛋白的單體中除去凝聚物的通用方法，其包括以下步驟，先在通過分級流通液分辨其中所述產物蛋白凝聚物與所述產物蛋白單體(優(yōu)選不與第二蛋白質配體形成復合物)的條件下將含有產物蛋白的溶液加載到離子交換材料上，所述產物蛋白包括所述蛋白的單體和凝聚形式；其次進一步分級流通液收集離子交換劑流通液中(與加載用于純化的離子交換材料上的產物蛋白組成相比)產物蛋白凝聚物含量降低的至少一種產物蛋白單體級分。以上定義也適用于本文，特別是流通離子交換層析的實際操作；因此，凝聚物應理解為含有一條或多條共價結合的蛋白質鏈的給定蛋白質的非特異性二聚或高聚可溶性凝聚物。凝聚物優(yōu)選包括以上定義抗體的具體例子與IgG所示例的相同產物蛋白的二聚體和高階凝聚物，所定義的所有這種類型凝聚物可被以流通方式進行的本發(fā)明離子交換層析步驟除去。發(fā)現陰離子和陽離子交換可實施本發(fā)明；更驚人的是，發(fā)現所述方法在待純化產物蛋白單體的pl時以及導致產物蛋白單體和離子交換材料之間離子吸引(例如交換劑和蛋白表面的正電荷吸引)的緩沖液pH時起作用，雖然由于緩沖液的電導率不允許產物蛋白與離子交換劑結合而不導致生產性結合。簡言之，為除去凝聚物，就待純化的產物蛋白而言，當采用非結合方式的陽離子交換劑時該陽離子交換劑應起作用，但要利用pH約為或低于產物蛋白平均pl的加載和清洗(加載后)緩沖液；反之亦然，當利用陰離子交換劑時，該陰離子交換劑只在用pH約為或高于產物蛋白平均pI的一種或幾種加載和清洗(加載后)緩沖液時起作用。如前文抗體純化中解釋的但具有通用意義的那樣，緩沖液pH優(yōu)選不設置在產物蛋白的pl。上述對糖蛋白pl的解釋與糖基化形式分布和測定pl的實驗同樣適用于本目的。所述清洗與加載緩沖液當然必須遵從給定產物蛋白單體所建立的非結合操作方式，在所設置的限制范圍中，就組成而言，所述清洗緩沖液可以與加載緩沖液相同或不同，或者甚至可依次使用幾種不同的清洗緩沖液，雖然未覺察到這樣做明顯有好處。為簡明起見，樣品制品的加載與清洗，例如利用永遠相同的緩沖液進行。然而，與只是將用非結合方式操作所允許的緩沖液懸浮的液體樣品制品傾倒在均勻的離子交換柱上相比，感覺可采用更精細的加載方式來進行本發(fā)明的層析純化方法。優(yōu)選將流通液的抗體峰分級或分為至少兩級分并棄去拖尾級分來實現分級。以此方式最終可獲得所收集抗體的單體百分比純度以總產物蛋白含量計至少99%的單體，同時用最廣泛應用的高流通量與極快速離子交換層析取代煩瑣的凝膠過濾(permation)或大小排阻層析方法或同等的低通量、機械復雜的昂貴分流或沉淀技術。直接從離子交換柱流通液中收集是最快的處理方法，它無需額外的煩瑣洗滌、洗脫和再生步驟。實驗1.A蛋白Elisa已描述了測試A蛋白或重組A蛋白的許多Elisa方法(參見US4983722與本文所述的參考文獻)。下文所述的所有工作采用簡單的夾心Elisa，其中包被在平底96孔微滴定板(NuncTM)上的捕獲性抗A蛋白抗體能留住A蛋白。然后利用生物素化抗-A蛋白檢測抗體來檢測結合的A蛋白，所述檢測抗體還能結合偶聯鏈霉親和素的辣根過氧化物酶(Amersham#RPN1231)。用于捕獲的可購得抗A-蛋白家兔抗體(用天然金黃色葡萄球菌A蛋白免疫家兔產生)可購自Sigma-Aldrich(#P-3775)。本項研究中采用此抗體。檢測用家兔抗體也購自Sigma-Aldrich(#3775)。通過非特異性吸附方法包被該(抗體)蛋白后，利用該包被蛋白，即特異性A蛋白捕獲性抗體留住A蛋白，然后利用生物素化家兔抗A蛋白(抗體)與鏈霉親和素-辣根過氧化物酶檢測。四甲基聯苯胺用作產色底物。用待檢測的污染性A蛋白的親代A蛋白或A蛋白衍生物(制作的)標準曲線讀取未知樣品的濃度。用酸性pH包被以及適當的標準品證明至關重要。特別是經工程改造攜帶額外半胱氨酸殘基的重組A蛋白，例如StreamlineproteinATM(AmershamBiosciences,原來的Pharmacia),發(fā)現需要用還原性巰基試劑預處理標準品溶液以確保蛋白標準品溶液的單體狀態(tài)。相反，野生型A蛋白標準品可購自許多公司，例如Sigma-Aldrich/瑞士(弁P6031)或Pharmacia(#17-0770-01)，無需這種預處理。就觀察到污染性A蛋白從StreamlineTM基質上脫落的以下所述實驗而言，可采用得自生產商的未偶聯的重組A蛋白樣品作為標準品。1.1預處理富含Cys的A蛋白標準品在StreamlineTMA蛋白親和層析(AmershamBiosciences)柱材料中含有凍干的純重組A蛋白-Cys可購自Pharmacia/AmershamBiosciences。將蛋白溶解在含有0.5MNaCl、1mMEDTA和20mM二硫蘇糖醇的0.1MTrispH8中達到20mg/ml，在室溫培育15-30分鐘，用一次性PD-10凝膠過濾柱脫鹽(AmershamBiosciences)。包被前用于處理該標準溶液的所有緩沖液應用N2處理以防巰基氧化。最好恰在用該標準品包被微滴定板之前制備蛋白標準品。任選制備1mg/ml的儲備液，保存在-65'C冰箱中，融化后將等份試樣加于非還原性SDS-PAGE上測試A蛋白的單體特征。用Bradford試驗(Bradford等，1976，Anal.Biochem.，72:248-254;Splittgerber等，1989，Anal.Biochem.，179:198-201)以及自動化氡基酸分析測定蛋白標準品的濃度。圖1顯示通過非還原性10。/。SDS-PAGE檢測葡萄球菌A蛋白標準品(泳道1:天然A蛋白；泳道2:預處理后)和純的未偶聯Streamline重組A蛋白(Pharmacia，現在的Amersham-Biosciences惠贈；泳道4:重組天然A蛋白；泳道5:預處理后)的這種預處理結果。泳道l是分子量標記物，相應的分子量標注在縱軸上。含有額外Cys殘基的Pharmacia重組A蛋白在還原為低分子量后遷移到約34kD處，為單一更強的條帶，顯然源自二硫鍵結合二聚體的解離。1.2Elisa1.2.1制備樣品通過兩步稀釋制備1mg/ml的A蛋白標準品儲備溶液的1:200.000稀釋液，得到50ng/ml標準品。從而制備0.2ng/ml的稀釋液用于標準曲線測試。此外，利用標準品的稀釋液("摻加溶液")來摻加待測試的一式兩份產物樣品以排除樣品中干擾物質的存在。對于最終的產物樣品測試，將每份樣品分為500pl等體積的兩份。一份摻加1000ng/ml的摻加溶液，或10jig/ml溶液(如果合適)以使最終A蛋白含量為每毫克抗體10ngA蛋白。另一半摻加相同體積的樣品緩沖液；因此消除了因摻加導致產物樣品稀釋的系數。以下將這兩類制品稱為"摻加樣品"。樣品緩沖液由7.51g甘氨酸(堿)、5.84gNaCl、0.5mlTritonX-100構成，用去離子水或雙蒸水將體積補足至1L。為最佳精確測量，預先采用本領域熟知的常規(guī)Elisa測定樣品中的抗體濃度。另一份標準品溶液摻加等量的對A蛋白具有相當恒定區(qū)親和力的已知標準抗體，來測定酸化步驟的效果并除去測定中任何可能的系統(tǒng)誤差(因抗體與A蛋白結合使A蛋白從捕獲(抗體)上脫落而引起)。酸化向450^摻加的樣品或標準品中加入200^0.2M檸檬酸鹽/0.05。/0TritonX-100緩沖液，pH3.0。所有樣品進行一式三份酸化。此外，制備諸樣品的稀釋液并以一式三份測試，因為試驗的最佳抗體濃度是1mg/ml-0.2mg/ml。在本試驗中，酸化步驟對于釋放污染性A蛋白或A蛋白片段至關重要，否則所述蛋白或蛋白片段會與樣品溶液中存在的過量抗體結合。1.2.2用抗體包被微滴定板包被緩沖液由1.59g/LNa2C03、2.93g/LNaHC03和0.20g/L疊氮鈉構成。將緩沖液的pH調節(jié)為pH9.6。向每孔加入抗體含量不足以飽和A蛋白標準品的100pl抗體溶液。用塑料膜覆蓋板，置于潮濕小室。37'C過夜培育約18小時。用至少300pl洗滌緩沖液[NaCl5.8g/L、Na2HP041.15g/L、NaH2PO-H200.26g/L、EDTA3.7g/L、吐溫-200.2g/L、丁醇10ml/L，pH7.2]清洗所有孔3次，拍干。向各孔加入250^封閉緩沖液[含有0.5%酪蛋白hammarsten的包被緩沖液，在室溫用桌面軌道搖床(轉速為120rpm)培育2小時。用至少300pl洗滌緩沖液清洗所有孔3次，拍干。1.2.3樣品培育和檢測以100pl/孔將標準品與樣品(包含摻加樣品)加于板上。用塑料膜覆蓋板，在室溫用桌面軌道搖床培育90分鐘。用至少300Hl洗滌緩沖液清洗所有孔3次，拍干。將生物素化家兔抗A蛋白(抗體)稀釋至事先確定的最佳稀釋度。以100pl/孔加入，用塑料膜覆蓋板，在室溫用軌道搖床培育90分鐘。再次清洗。用偶聯緩沖液[Na2HP041.15g/L、NaCl5.84g/L、NaH2P04.H200.26g/L、EDTA3.73g/L、TritonX-1000.05%(v/v)，pH7.2]將鏈霉親和素-辣根過氧化物酶稀釋至事先測定的最佳稀釋度。以100pl/孔加入，用塑料膜覆蓋板，在室溫用軌道搖床培育45分鐘。再次清洗。加入100pl新鮮制備的四甲基聯苯胺(TMB，ICN產品號980502)底物溶液。如下所示制備底物溶液將10mgTMB溶解于1mlDMSO來制備儲備液。向用0.5M檸檬酸調節(jié)至pH0.6的2.05%(w/w)乙酸鈉水溶液中加入10pl該儲備液和10^H202。用于制備該試驗任何試劑的水當然是最高質量的，即去離子的超純水或至少是雙蒸水。在室溫用搖床培育底物溶液8-11分鐘。然后向每孔中加入50^終止液[13%H^04]以終止反應。在加入終止液后IO分鐘內，利用平板讀數分光光度計測定各孔的450nm吸光度。這種Elisa的檢測極限是0.2ng/mlA蛋白，工作范圍是0.2-50ng/ml。試驗間差異小于10%。圖2顯示了StreamlineTM重組A蛋白層析洗脫的抗體液中脫落重組A蛋白的水平，所述層析利用硫醚鍵連接的單點連接A蛋白。循環(huán)次數指用1M氯化鈉洗脫與再平衡后重復使用的次數。盡管雜交瘤細胞培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)肉湯的脫落通常為500ppm級，但其它細胞類型的水平高達1000ppm。表1總結了不同來源基質的脫落率；按照生產商的使用說明進行層析。表1基質支持物偶聯化學劑典型的脫落p.p.m工作容量(mg/ml)流速(em/小時)天然A蛋白Sepharose4FFAmersham-Bioscience多點連接的CNBr10-205-2030-300rmpA蛋白SepharoseFAmersham-Bioscience多點連接10-205-2030-300多孔A高容量Amersham-Bioscience多點連接10-5010500-1000A蛋白陶瓷HyperDBiosepra多點連接最高30010-20200-500重組A蛋白SepharoseAmersham-Bioscience單點連接的硫醚鍵50-100020-4030-300MabSelectAmersham-Bioscience單點連接的硫醚鍵50-100020-40500STREAMLINE重組A蛋白Amersham-Bioscience單點連接的硫醚鍵50-100020-40200-400圖3提供了用相同親和力基質材料的A蛋白親和層析反復運作期間脫落的污染性A蛋白無實質性降低的數據；如下文2.1部分所述，反復使用野生型A蛋白多點連接的Sepharose4FF(Amersham-Biosciences)，通過上述Elisa測定對洗出液進一步處理之前其中的污染性A蛋白水平。2.A蛋白和SepharoseQ層析/不同時分級除去凝聚物2.1用StreamlineiM的A蛋白親和層析通過離心、深過濾和超濾濃縮初步純化NSO骨髓瘤細胞培養(yǎng)物的細胞培養(yǎng)上清液，也采用超濾將培養(yǎng)液替換為PBS，pH7.0。細胞所產生的5號抗體的滴度是0.2mg/ml，更換了緩沖液的上清液總加載量是1L。5號單克隆抗體的pi是8.5。A蛋白StreamlineTM柱(5.0ml體積)預先用IO個柱體積的50mM甘氨酸/甘氨酸鹽，pH8.8，4.3MNaCl平衡；流速是200cm/小時。為加載，以50cm/小時操作該柱；加載容量約為20mg/ml基質材料。先用至少IO個柱體積的補加了額外200mMNaCl和0.1%吐溫-20的甘氨酸平衡緩沖液洗滌該柱，再用0.1M甘氨酸/HC1，pH4.0緩沖液構成的洗脫緩沖液洗脫。洗脫后立即用足量0.5MTrisHCl，pH7.5中和含抗體峰的各洗出液級分，采用Amicon透濾裝置用本發(fā)明后續(xù)陰離子交換步驟的加載/平衡緩沖液(10mMTris/HClpH8.0，50mMNaCI)替換緩沖液以防止長期接觸酸性pH。如上所述測定抗體濃度與污染性A蛋白濃度。洗出液中污染性A蛋白的水平透濾前為1434ng/mg抗體，透濾后為1650ng/mg抗體。根據加載前被替換緩沖上清液的滴度抗體回收率是81%;經透濾的溶液中抗體的濃度是3.6mg/ml。2.2非結合方式的Q-SepharoseFF陰離子交換步驟如下所述進一步處理2.1部分非純化抗體用lOmlO.lMNaOH制備5.0ml的Q-SepharoseFF柱(Amersham-Biosciences)，然后用兩個柱體積的0.1TrispH8(洗滌)，用10個柱體積的10mMTrispH8/50mMNaCl平衡，流速為75cm/小時。平衡后，流速降低至50cm/小時。將6ml透濾的抗體溶液加載至柱上，收集流通液作進一步處理；將前6ml加載上柱后繼續(xù)用純的加載或平衡緩沖液(10mMTrispH8/50mMNaCl)通柱，繼續(xù)收集流通液直至所檢測流通液的280nm處吸光度回復至基線。流通液中回收的抗體共23mg(87%)。污染性A蛋白的水平測定為<3ng/mg抗體。用SephacrylS-300凝膠過濾(大小排阻層析，SEC)進一步處理此Q-Sepharose純化的抗體，用10mM磷酸鹽pH7.0，140mMNaCl緩沖液，流速為10cm/小時，加載率是每ml凝膠15mg抗體，發(fā)現基本上未改變此痕量污染性A蛋白水平。根據經驗，可采用SEC將污染性A蛋白的水平從約30-100ng/mg降低至約1-5ng/mg。因此，對于痕量A蛋白，SEC的純化系數極低，可能的解釋是抗體與污染性A蛋白間存在親和力相互作用。然而，由于不可避免的樣品稀釋和處理緩慢使抗體蛋白有一定降解，SEC只能回收所加載抗體量的70%。這說明SEC不可避免地導致物質損失，同時更耗時間。如上所述，為再次使用，可用2MNaCl洗脫與平衡再生Q-Sepharose柱。2.3用定制的多點結合A蛋白進行StreamlineTMA蛋白親和層析此多點結合的StreamlineTMA蛋白親和層析基質是定制的，由PharmaciaBiotech(現在是Amersham-Pharmacia)提供。生產商將具有末端Cys殘基的相同34kDStreamlineTM型重組A蛋白偶聯于相同的Sepharose基質材料來制成此親和層析基質，但采用傳統(tǒng)的CNBr化學方法活化和偶聯，而不用環(huán)氧化物介導的活化和選擇性反應條件只通過-SH基團偶聯(見生產商的產品信息)。實驗2.1重復了此方法，污染性A蛋白的水平測定為353ng/mg抗體。因此，可推論A蛋白與基質材料的偶聯方式可部分解釋高容量單點連接的重組A蛋白親和基質蛋白脫落為何增加；與全長野生型A蛋白相比，在這種重組A蛋白中引入氨基酸序列修飾也顯著導致蛋白質脫落增加。3.平行測試與Miles方法的比較(US4，983，722)Miles的專利(第4,983,722號)宣稱將DEADSepharose以結合方式用作第二層析步驟，用鹽梯度(0.025M-0.25MNaCl)洗脫能將洗出液中脫落的A蛋白含量降低至15ng/mg抗體以下(A蛋白(含量)的范圍是0.9-14ng/mg抗體)。表2:比較用單點與多點連接的A蛋白層析基質純化6A1抗體洗出液樣品中A蛋白的殘留<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>這些實驗的目的是證實利用MabSelect(新的單點相連的重組A蛋白基質)和pi較低的抗體(pl6.5-7.5)獲得的這些結果，以及直接比較非結合Q-Sepharose方法(用不同的平衡/加載緩沖液)與Miles的專利方法。收集NSO細胞的6Al抗體，表達和收集抗體的各種細胞培養(yǎng)方法詳細描述于下文實驗部分7。所用的方法6A1抗體(pI6.5-7.5)的純化包括兩步層析MabSelectA蛋白步驟，然后進行Q-Sepharose陰離子交換層析(非結合)或DEAESepharose層析(結合)步驟。MabSelectA蛋白層析柱基質MabSelect重組A蛋白(單點連接的rPA)柱尺寸1.6cm內徑X15cm床高柱體積30mL操作流速500cm/小時(16.80mL/分鐘)清潔6M鹽酸胍(2個柱體積)加載容量35mg/ml基質平衡50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH8.0/250mMNaCl(8個柱體積)加載后洗滌50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH8.0/250mMNaCl(8個柱體積)洗脫緩沖液100mM甘氨酸pH3.50(6個柱體積)洗滌；100mM檸檬酸pH2.1(2個柱體積)利用與AKTAFPLC系統(tǒng)相連的MabSelect柱(30ml)純化含有6A1抗體的培養(yǎng)上清液。所用的條件如上表所述。利用0.1M甘氨酸pH3.5洗脫抗體。洗脫后，將洗出液pH調節(jié)到pH7.0，然后分為5等份；各等份用不同緩沖液透濾作陰離子交換層析。第一等份用50mMTrisHClpH8〃5mMNaCl滲濾作Q-Sepharose層析運作1。第二等份用50mMTrisHClpH8/100mMNaCl滲濾作Q-Sepharose層析運作2。第三等份用20mM磷酸鈉pH6.5/80mMNaCl滲濾作Q-Sepharose層析運作3。將第四等份與第五等份緩沖液替換為25mMTrisHClpH8.0/25mMNaCl來評估Miles專利所述的DEAESepharose結合方法。運作4和5之間的差異是將運作4的主峰作為一級分收集用標準磷酸緩沖鹽水滲濾后分析，而運作5中，分級該洗出液的峰并用按照Miles專利所述制備的磷酸緩沖液滲濾。下文描述了5種柱運作各自的條件O-Sepharose層析運作1柱基質Q-SepharoseFastFlow(AmershamBiosciences)柱尺寸1.6cm內徑X8cm床高柱體積16mL柱制備用0.1M氫氧化鈉以150cm/小時裝柱操作流速100cm/小時(3.35mL/分鐘)清潔O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)加載容量15mg/ml基質平衡50mMTrisHClpH8.0/75mMNaCl(8個柱體積)加載后洗滌50mMTrisHClpH8.0/75mMNaCl(5個柱體積)剝離緩沖液2M氯化鈉(2個柱體積)洗滌O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)O-Sepharose層析運作2柱基質Q-SepharoseFastFlow(AmershamBiosciences)柱尺寸1.6cm內徑X8cm床高柱體積16mL柱制備用0.1M氫氧化鈉以150cm/小時裝柱操作流速100cm/小時(3.35mL/分鐘)清潔O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)加載容量7.5mg/ml基質平衡50mMTrisHClpH8.0/100mMNaCl(8個柱體積)加載后洗滌50mMTrisHClpH8.0/100mMNaCl(5個柱體積)剝離緩沖液2M氯化鈉(2個柱體積)洗滌O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)O-Sepharose層析運作3柱基質Q-SepharoseFastFlow柱尺寸1.6cm內徑X8cm床高柱體積16mL柱制備用0.1M氫氧化鈉以150cm/小時裝柱操作流速100cm/小時(3.35mL/分鐘)清潔O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)加載容量7.5mg/ml基質平衡20mMTrisHClpH6.5/80mMNaCl加載后洗滌20mMTrisHClpH8.0/80mMNaCl(5個柱體積)剝離緩沖液2M氯化鈉(2個柱體積)洗滌O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)O-Seuharose層析運作4柱基質Q-SepharoseFastFlow(AmershamBiosciences)柱尺寸1.6cm內徑X8cm床高柱體積16mL柱制備用平衡緩沖液以150cm/小時裝柱操作流速100cm/小時(3.35mL/分鐘)清潔O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)加載容量7.5mg/ml基質平衡25mMTrisHClpH8.6/25mMNaCl(8個柱體積)加載后洗滌25mMTrisHClpH8.0/25mMNaCl(5個柱體積)洗脫緩沖液25mMTrisHClpH8.6/25mMNaCl至25mMTrisHClpH8.6/250mMNaCl(2個柱體積)洗滌2M氯化鈉(2個柱體積)DEAESepharose結合方法運作5fMiles方法)柱基質DEAESepharose柱尺寸1.6cm內徑X8cm床高柱體積16mL柱制備用平衡緩沖液以150cm/小時裝柱操作流速100cm/小時(3.35mL/分鐘)清潔0.1M氫氧化鈉(2個柱體積)加載容量7.5mg/ml基質平衡25mMTrisHClpH8.6/25mMNaCl(8個柱體積)加載后洗滌25mMTrisHClpH8.0/25mMNaCl(5個柱體積)洗脫緩沖液25mMTrisHClpH8.6/25mMNaCl至25mMTrisHClpH8.6/250mMNaCl(2個柱體積)洗滌2M氯化鈉(2個柱體積)用于此研究的不同緩沖液性能見表3。用rPAELISA檢測了5次離子交換運作產生的洗出液樣品的A蛋白水平。結果見表4。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*梯度洗脫緩沖液收集DEAE-Sepharose運作5(Miles方法)的洗脫狀況的各級分，用重組A蛋白ELISA分析，結果見表5。表4:重組A蛋白ELISA結果—CV表示柱體積<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>)表5:結合方式DEAE-Sepharose分離(Miles方法)；運作5期間所獲得洗脫峰的洗出液各級分中重組A蛋白的水平<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>Miles的方法，表5:雖然主要的蛋白和抗體峰位于洗出液的級分2-4中(始于隨意編號；所述級分以*作標記)，但A蛋白在急劇上升峰中滯后洗出^作標記的級分)；鑒于A蛋白污染可接受的閾值最高是2ng/mg抗體，在級分4最末尾處結束抗體回收能除去大多數凝聚物，雖然未能回收上述洗出液中發(fā)現的約35%抗體。相反，對于A蛋白含量標準，非結合方式的運作l-3能良好地回收抗體。非結合方法總能得到與傳統(tǒng)結合方法所得同樣的抗體蛋白質尖峰，峰形沒有任何特征性變形。當然應該注意加載體積不足以使抗體樣品遷移并從交換劑柱上流出，因為柱的空體積遠大于加載體積。因此，本非結合方法的加載后加入的流動相在上述方法中也稱為"加載后洗滌"?？紤]到柱空體積，隨著加載緩沖液前端遷移入柱的頭部，產生自層析柱收集的含抗體產物峰的流通液。因此，在收集產物蛋白質峰前，流出的一倍柱體積液體不含產物蛋白質。本發(fā)明方法無需洗脫緩沖液，對于本發(fā)明的非結合方法，如運作l-3所示例的那樣，雖然所用術語類似，但這種加載后洗滌當然仍不會使抗體或產物蛋白靜電結合，這與Miles的加載后洗滌緩沖液條件相反；在理論上，對于本發(fā)明方法，加載后洗滌緩沖液甚至可以與加載緩沖液不同，只要保留了上述非結合條件的要求，但這樣做當然也不會更有益。然后，所有這種緩沖液流過柱后可產生收集的流通液。因此，為簡明起見，運作1-3的加載與加載后洗滌緩沖液相同。流通方法中，運作1-3的抗體峰一般在約1-2個，通常是1.5個柱的空體積處流下。但是即使在約2-3個柱空體積的流通液中產生產物峰"洗脫"的非結合條件下(數據未顯示)，仍未觀察到峰變寬或拖尾，表明非結合條件在操作上有一致性。在本發(fā)明的非結合方和與本段的實驗指導中，所用術語"洗脫"體積與Miles的真正結合和洗脫操作方式的術語相反對。在非結合條件下，此抗體(6A1;pi6.5-7.5)的最高回收率(85%)是用20mM磷酸鈉pH6.5/80mMNaCl緩沖液(對應于運作3)在Q-Sepharose(柱)上獲得的。運作1也顯示了良好的回收率(82%)，然而此運作的"洗脫液"體積略高，雖然未觀察到抗體蛋白峰有實質性變寬；未分析糖基化形式的分布。提高NaCl濃度(運作2與運作1相比)降低了重組A蛋白的清除率，因此運作3和l所用的緩沖液系統(tǒng)更適合于此抗體。我們以前的觀察是運作1所用的緩沖液系統(tǒng)更適合于高pl的抗體，運作3所用的緩沖液系統(tǒng)對中性或略酸性的抗體更有用。鑒于運作l的數據，可以預計用此非結合方法甚至有更高的容量(>30mg/ml)。與Miles方法相比，非結合方法更易于大規(guī)模生產，因為除了能克服Miles方法的主要缺陷(即需要小心地注意分級洗出液以避免只是A蛋白峰分級)外，還可應用于較高容量等；一旦需要同時遵守多個參數(凝聚物加上A蛋白污染物閾值)的組合，Miles方法將更困難(如果可能的話)。以運作5(Miles方法)為例，如表5所示在主要洗脫峰中觀察到有重組A蛋白級分。因此，需要小心合并各級分以確保良好清除重組A蛋白。這對回收率(70%)有影響，即使在此例中，也未得到用非結合方法所得相同的良好清除率。因此，在觀察到極高脫落(例如用單點相連的基質通常獲得的)的情況中，Miles方法更難實現對于細胞系/抗體的良好清除率與高回收率。運作5的數據代表了采用Miles專利方法所獲得的結果與其所述的條件。方法比較的總結與所得到的數據見下表6。表6.1抗體純化的不同階段的重組A蛋白水平總結*EAlJS號中顯示了重組A蛋白的水平[iig/mg；注意不是所有NSO克隆細胞系的上清液都得到類似的A蛋白污染水平。NSO的6Al(cp.實施例7)培養(yǎng)上清液濃度/滲濾(50mMTrisHCl/100mMNaClpH8.00)(71.40)I陰離子交換Q(2.94)(50mMTrisHCl/100mMNaClpH8.00)非結合(運作2)重組A蛋白Sepharose(130)濃度/滲濾(20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6.50)(50.80)I陰離子交換Q(0.73)(20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6.50)濃度/滲濾(25mMTrisHCl/pH8.60/25mMNaCl),包括柱洗滌(46.70)IDEAESepharose(1.55)"Miles"梯度洗脫(25mMTrisHCl，pH8.60,線性鹽梯度25mMNaCl-250mMNaCl)結合(Miles，運作5)非結合(運作3)*所有實施例以7.5mg/ml加載陰離子交換劑進行與表6.1中左側的運作2相似，以非結合方式進行運作l，但用15mg/ml的加載容量并進一步降低了離子強度(表6.2)，從而極佳地除去污染性A蛋白表6.2(運作1)NSO的6Al(cp.實施例7)培養(yǎng)上清液重組A蛋白Sepharose(130)I濃度/滲濾(50mMTrisHCl/75mMNaClpH8.00)(70.1)I陰離子交換Q(20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6,50)(<0.4)發(fā)現利用陰離子交換Q-Sepharose，也利用不同的例如高pl抗體得到的此極佳結果完全可重現。6.利用陶瓷Q-HyperD⑧F作為陰離子交換劑純化基本上如以上比較實驗3所述進行Mab-SelectA蛋白層析的洗出液的非結合陰離子交換層析。Q-HyperD②F(Biosepra牌層析支持物)購自英國，Guildford,CiphergenBiosystemsLtd.?；旧先鐚嵤├?所述采用Mab-SelectA蛋白親和層析處理NSO細胞表達的pi8-9抗體。然后基本上如實施例5(運作l-3)所述，對A蛋白親和層析柱洗出液以流通方式實施Q陰離子交換層析，除了在不同緩沖液鹽、緩沖液pH和電導率條件下用Q-HyperDF(Biosepra⑧)替換Q-Sepharose進行比較性運作外。表7所示方案概述了各條件；對于最大程度除去污染性A蛋白和獲得與用SepharoseQ材料相同的結果，證實應用小于2mS/cm的極低電導率，即約1.26mS/cm較好。分析時也觀察到流通級分有凝聚物拖尾(數據未顯示)，拖尾的延伸也取決于所應用的緩沖液。取決于基本目標與離子交換材料的類型，必須為給定的分離任務確定緩沖液所定義的最佳條件或補償條件。然而，對于大規(guī)模工業(yè)生產，陶瓷HyperD材料的優(yōu)點是壽命長、堅固和抗壓縮(處理時間、流速)。因此，對于不同柱材料，電導率是待測試和優(yōu)化的最重要參數。也應注意電導率非常嚴重地影響聚陰離子DNA的污染水平。通過合適地微調緩沖條件，可同時盡可能減少污染性DNA和A蛋白水平。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>A蛋白0.78ng/mgA蛋白1.06ng/mgA蛋白3.3ng/mg為比較利用相同的抗體，Q-Sepharose得到0.4ngA蛋白/mg抗體，測定的污染性DNA水平為10.9pg/mg抗體；然而，利用Q所得的結果是利用極為不同的緩沖液(20mMTrisHC1/50mMNaClpH8.00，測定的電導率為6.1mS/cm)獲得的。7.A蛋白層析后用非結合方式離子交換層析同時減少凝聚物和A蛋白這些實驗的目的是評估以非結合方式操作離子交換層析時凝聚物-單體的分離效果(利用從克隆細胞系NS0-6A1收集的，pl為6.5-7.5的cB72.3IgG抗體，所述細胞系含有谷氨酰胺合成酶(GS)和新霉素選擇標記并能組成型表達抗體)。選擇用于評估的基質是在兩種不同緩沖液條件下運作的Q-Sepharose陰離子交換劑(AmershamBiosciences)。已詳細描述了培養(yǎng)NSO-GS細胞與收集B72.3抗體的方法(見同一申請人的WO03/027300和WO03/064630)。按照布達佩斯條約，生產細胞系NS0-6A1在2002年8月30日由英國，Salisbury/WiltshireSP4OJG，PortonDown,應用微生物與研究中心，歐洲細胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)代表AndyRacher(LonzaBiologicals，224BathRoad，Slough,Berkshire,SL14DY，英國)以登錄號02083031保藏，代碼"6Al-Neo";所給的地址是英國，LonzaBiologiespic的公司地址，該項委托受LonzaBiologiespic委托并具有LonzaBiologiespic的所有授予權利。此外，AndyRacher先生有時可視作合法的保藏人，其目前私人地址是英國，Reading/BerkshireRG74UY，Aldermaston，5KingfisherClose,根據保藏文件的這種合法解釋，Racher先生無條件且不可撤銷地授權本申請人，LonzaBiologiespic提交所申請的保藏材料，使之為公眾可用并給本申請人指定了保藏物的所有名稱。Whittle等(ProteinEng.,1987，6:499-505)與(Colcher等，CancerResearch,49，1738-1745，(1989))描述了小鼠-人嵌合型抗體cB72.3的基因結構。該抗體也可從NSO-6Al-Neo細胞系表達。NSO6A1抗體(cB72.3)的純化方法包括兩個層析步驟rmpA蛋白Sepharose(層析)，然后進行非結合Q-Sepharose陰離子交換層析。rmpA蛋白Sepharose層析柱基質rmpA蛋白Sepharose(AmershamBiosciences)柱尺寸1.8cm內徑X15cm床高柱體積30.1ml操作流速150cm/小時清潔6M鹽酸胍(2個柱體積)加載容量35mg/ml基質平衡50mM磷酸鈉pH7.0/250mMNaCl(8個柱體積)加載后洗滌50mM磷酸鈉pH7.0/250mMNaCl(8個柱體積)洗脫緩沖液0.1M甘氨酸/0.1MNaClpH3.0(6個柱體積)剝離0.1M檸檬酸pH2.1(2個柱體積)利用與ATKAFPLC系統(tǒng)相連的rmpA蛋白柱(30ml)純化含有6A1抗體的細胞培養(yǎng)上清液。所用條件如上表所述。利用0.1M甘氨酸/0.1MNaClpH3.0洗脫抗體。洗脫后，將洗出液pH調節(jié)到pH3.7，維持60分鐘，然后中和至pH6.5。需要進行兩輪。將第一輪的洗出液濃縮至25mg/ml，緩沖液替換為20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6.5，在如下所示"運作1"-洗脫條件下加載到Q-Sepharose柱上。將第二輪的洗出液濃縮至25mg/ml，緩沖液替換為20mMTrisHC1/75mMNaClpH8.0，在如下文運作2所述加載到Q-Sepharose柱上。收集不結合級分(流通物)的各組分，采用凝膠滲透(permation)-HPLC分析?；厥张c洗脫體積如表1所示。GP-HPLC結果見表2。凝聚物分布狀況如圖4和5所示，'洗脫液分布狀況如圖6和7所示。O-Sepharose層析運作1柱基質Q-SepharoseFF(AmershamBiosciences)柱尺寸l.Ocm內徑X15cm床高柱體積12mL操作流速100cm/小時清潔O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)加載容量50mg/ml基質平衡20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6.5加載后洗滌20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6.5剝離20mM磷酸鈉/2MNaClpH6.5(2個柱體積)UV-監(jiān)測色譜圖見圖6。O-Sepharose層析運作2柱基質Q-SepharoseFF(AmershamBiosciences)柱尺寸l.Ocm內徑X15cm床高柱體積12mL操作流速100cm/小時清潔O.IM氫氧化鈉(2個柱體積)加載容量50mg/ml基質平衡20mMTrisHC1/75mMNaClpH8.0加載后洗滌20mMTrisHC1/75mMNaClpH8.0剝離20mMTrisHC1/2MNaClpH8.0(2個柱體積)運作編號回收(%)洗脫液體積(cc)Q-Sepharose運作1洗出液735.8Q-Sepharose運作2洗出液7711UV-監(jiān)測色譜圖(260nm處的OD)見圖7。對于凝膠滲透/尺寸排阻層析，應用豐余三聯檢測(redundanttripledetection)(RALS,ViscometerandRefractiveIndex)來檢測凝膠柱流出的蛋白級分。光散射檢測器可直接檢測分子量且無需進行柱校驗。黏度計能(測定)直接可見的結構差異。它也能測定整個分布中的分子大小。三聯檢測的另一優(yōu)點是可采用一種狹義和一種廣義的標準來測定儀器參數。三聯檢測能在一次檢測中測定"絕對"分子量、固有的黏度與分子大小。它能提供聚合物樣品的分枝、構象、結構和凝聚的有關信息。層析條件溶劑0.2M磷酸鈉緩沖液，pH=7.0流速0.7ml/分鐘注射體積100柱/檢測器溫度29°C柱Superdex200HR檢測器樣品的三聯檢測色譜圖顯示該檢測器有極佳的信噪比。單體峰的重現性非常好。對于所有的樣品，分子量約為140k-147k道爾頓，固有黏度IV約是0.065-0.079dl/g，水動力半徑(hydrodynamicradius)Rh為5.3-5.5，重量級分80-99%。第二峰分子量約為300k，IV是0.08dl/g,Rh是7nm，這與二聚體的結果一致。圖8-17顯示了選自表2各級分用三聯檢測運作的一式兩份GP色譜圖(見交叉參照的濃度數據)圖8/級分1.2:Q-FT-01-F2濃度=3.58mg/ml圖9/F丄5:Q-FT-01-F5濃度=15.5mg/ml*7.75mg/ml圖10/F丄ll:Q-FT-01-F11濃度=7.41mg/ml*3.71mg/ml圖ll/F.1.15:Q-FT-01-F15濃度4.38mg/ml圖12/F.1.19:Q-FT-01-F19濃度=0.334mg/ml圖13/F.2.2:Q-FT-02-F2濃度=5.9mg/ml*2.95mg/ml圖14/F.2.5:Q-FT-02-F5濃度=15.5mg/ml*7.75mg/ml圖15/F.2.10:Q-FT-02-F10濃度=8.95mg/ml*4.48mg/ml圖16/F.2.20:Q-FT-02-F20濃度-1.57mg/ml圖17/F.2.33:Q-FT-02-F33濃度=0.37mg/ml*用磷酸緩沖液作1/2稀釋。表2:GP-HPLC分析結果:凝聚物分布狀況<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>170.6215,4190.3319.3210.2322.7230.1725.0合并的洗出液6.362.9運作2加載20.73.925.90.6515.50.99108.950.6143.590.3172.440.4201.570.5270.611.6330.372.9450.196.8合并的洗出液3.40.9在用20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6.5與20mMTrisHCl/75mMNaClpH8.0緩沖液運作的兩個Q-Sepharose中，較高含量的單體存在于前期級分中，而絕大多數凝聚物在拖尾級分中洗脫。與用20mMTrisHCl/75mMNaClpH8.0緩沖液的運作2相比，運作l(用20mM磷酸鈉/80mMNaClpH6.5緩沖液)的拖尾級分中含有較高水平的凝聚物。合并合適的不含凝聚物的蛋白質峰級分，避免(凝聚物)峰級分。尺寸排阻HPLC顯示合并的不含凝聚物級分所含的單體抗體>99.1%。同時測定了合并的單體級分中污染性A蛋白的水平，經測定選擇的合并級分中污染性A蛋白的水平為<<1.5ng/mg抗體。權利要求1.一種純化抗體，優(yōu)選IgG抗體的方法，所述方法包括以下步驟1).通過A蛋白親和層析純化抗體，其中A蛋白是天然A蛋白或其功能衍生物，2).在使污染性A蛋白或其功能衍生物與離子交換劑材料結合并通過流通液的分級來分辨流通液中的抗體凝聚物和未與A蛋白或A蛋白衍生物復合的抗體單體的條件下，將含有抗體凝聚物和A蛋白或A蛋白衍生物的純化抗體加載至離子交換材料上，與3).分級流通液并從離子交換劑流通液中收集與加載于該離子交換材料前的抗體組成相比，A蛋白或A蛋白衍生物與抗體凝聚物含量都降低的至少一種抗體單體級分。2.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述A蛋白是經工程改造從而與柱材料單點連接的重組A蛋白。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述重組A蛋白的氨基酸序列中含有半胱氨酸。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸包含在所述重組A蛋白氨基酸序列的C-末端最后30個氨基酸構成的區(qū)段中。5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述重組A蛋白至少50%通過硫醚硫鍵與A蛋白親和層析的層析支持材料相連。6.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，離子交換劑流通液中所述A蛋白或其功能衍生物的濃度降低至〈1ng/mgIgG。7.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所收集抗體的單體比例至少為99%,且該比例是通過將流通液的抗體峰分級為至少兩個級分并棄去尾級分來實現的。8.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體，優(yōu)選IgG抗體，其中所述IgG抗體可以是嵌合型或CDR嫁接的IgG抗體。9.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，從細胞培養(yǎng)物中收集所述抗體，然后通過A蛋白親和層析純化所述抗體。10.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，從哺乳動物細胞培養(yǎng)物中收集所述抗體。11.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，待用A蛋白親和層析純化的抗體不經滅活蛋白酶的處理，優(yōu)選不與至少一種蛋白酶抑制劑混合。12.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑選自PMSF、蛋白酶抑制肽、e-己酸或還原性巰基化合物。13.—種純化產物蛋白的方法，所述方法包括以下步驟1).在通過流通液的分級來分辨流通液中的所述產物蛋白凝聚物和優(yōu)選不與第二蛋白質配體形成復合物的所述產物蛋白單體的條件下，將含有產物蛋白的溶液加載到離子交換材料上，所述產物蛋白包含所述蛋白的單體和凝聚形式；和進一步2).分級流通液并從離子交換劑流通液中收集與加載于用于純化的離子交換材料上的產物蛋白組成相比，產物蛋白凝聚物含量降低的至少一種產物蛋白單體級分。14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，通過將流通液的產物蛋白峰分級或分為至少兩個級分并棄去尾級分來實現分級，所收集抗體的單體比例優(yōu)選至少為99%。15.如權利要求12或13所述的方法，其特征在于，根據單體比例的評估至少棄去其中產物蛋白的單體程度低于所述第一級分的至少一個第二級分。16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，至少用一種緩沖液加載和洗滌離子交換劑，其中從離子交換劑流出的至少一種緩沖液構成含有產物蛋白峰的流通液。17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的pH設為待純化產物蛋白單體的pl或平均pl，其范圍是所述pI士0.5個pH單位。18.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的pH設為不同于待純化產物蛋白單體的pl或平均pl，所述pH使產物蛋白單體具有表面電荷，當接觸或浸沒于所述緩沖液中時所述電荷導致產物蛋白單體與離子交換材料的帶電荷基團之間離子吸引。19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，在采用陽離子交換劑時，所述緩沖液的pH值設為低于待純化產物蛋白單體的平均pl，優(yōu)選將值設為比所述平均pl低0.5-3個pH單位。20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，在采用陰離子交換劑時，所述緩沖液的pH值設為高于待純化產物蛋白單體的平均pl，優(yōu)選將值設為比所述平均pl高0.5-3個pH單位。21.如權利要求13所述的方法，其特征在于，對于產物蛋白單體與離子交換材料的結合，所述條件是非結合條件，從而能從通過離子交換材料的流通液中回收70。/。以上(w/w)、更優(yōu)選80。/。以上(w/w)的加載于離子交換材料上的產物蛋白。全文摘要設計了一種純化抗體與其它產物蛋白同時除去由單一產物蛋白組成的凝聚物的新方法。文檔編號B01D15/38GK101120017SQ200580035236公開日2008年2月6日申請日期2005年8月30日優(yōu)先權日2004年8月30日發(fā)明者A·普倫塔,J·邦納杰,K·凱勒曼,M·R·戴維斯,R·P·布拉克申請人:英國龍沙生物醫(yī)藥股份有限公司