專利名稱：凈化α－玉米赤霉醇及其代謝物的方法與免疫親和色譜柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凈化α-玉米赤霉醇及其代謝物的方法及其專用免疫親和色譜柱，特別涉及一種凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的方法及其專用免疫親和色譜柱。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人們對生物體內(nèi)的物質(zhì)及其變化產(chǎn)生了越來越濃厚的興趣，而生物樣本的分析就成為探索和發(fā)現(xiàn)生命奧秘的必要手段。由于生物樣本成分復(fù)雜，待測物濃度較低，而且大多數(shù)取樣量很少，這就對分析方法的選擇性及靈敏度提出了更高的要求。免疫親和色譜(IAC，immunoaffinity chromatography)應(yīng)用于獸藥殘留分析，其高度選擇性和高親和性無疑使凈化過程簡化。與GC，HPLC聯(lián)用，可使免疫學(xué)技術(shù)和理化技術(shù)在選擇性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接測定樣品的諸多不足。目前，該方法在抗體、激素、多肽、酶、重組蛋白、受體病毒及小分子化合物的分析中被廣泛應(yīng)用。
α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇屬于雷羧酸內(nèi)酯類非甾體同化激素，α-玉米赤霉醇曾作為生長促進(jìn)劑應(yīng)用于反芻動物，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成作用，β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮是α-玉米赤霉醇的代謝產(chǎn)物。α-玉米赤霉烯醇是玉米赤霉烯酮的代謝產(chǎn)物。α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇具有弱雌激素作用，它在動物組織中的殘留會影響人類健康，輕者引起人體性機(jī)能紊亂，重者影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘導(dǎo)下，這類物質(zhì)可能致癌。同時，玉米赤霉醇排出動物體外后，還可經(jīng)飲水和食物造成二次污染和環(huán)境污染，1998年歐盟明確禁止將激素類藥物應(yīng)用于家畜生產(chǎn)。我國也于2002年禁止其用于所有食品動物，在所有食用組織不得檢出。
目前檢測α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。這些方法的前處理多利用液-液分配，常規(guī)的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果差、有機(jī)溶劑浪費多、所需時間長等缺點。免疫親和技術(shù)是90年代在分析領(lǐng)域得到應(yīng)用的新技術(shù)，但用免疫親和柱同時凈化基質(zhì)中的α-玉米赤霉醇(α-Zearalanol，ZER)、β-玉米赤霉醇(TAL)、玉米赤霉酮(ZEN)和α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)未見報道，更無商品化的IAC柱出售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的方法及其專用免疫親和吸附劑。
本發(fā)明所提供的凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的對β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都有交叉反應(yīng)的α-玉米赤霉醇單克隆抗體組成；所述對β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都有交叉反應(yīng)的α-玉米赤霉醇單克隆抗體是以α-玉米赤霉醇半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述α-玉米赤霉醇半抗原是將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)得到的ZER-7-半琥珀酸酯，即為α-玉米赤霉醇半抗原。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用載體蛋白。
α-玉米赤霉醇是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)，形成半抗原，這樣突出了α-玉米赤霉醇半抗原決定簇的特征結(jié)構(gòu)，然后再將α-玉米赤霉醇采用混合酸酐法與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。α-玉米赤霉醇半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對免疫不利，α-玉米赤霉醇半抗原與卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的結(jié)合摩爾比分別為8∶1和10∶1。
所述α-玉米赤霉醇單克隆抗體優(yōu)選為α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體。
所述α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體優(yōu)選為對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCCNo.1603分泌的單克隆抗體。
所述對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等，優(yōu)選為Sepharose 4B。
所述免疫親和吸附劑可裝載入柱中制成免疫親和色譜柱，該免疫親和色譜柱也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
含有上述免疫親和吸附劑或免疫親和色譜柱的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液可為甲醇。
所述試劑盒中還包括洗滌液、保存液；所述洗滌液為pH7.4，0.0lmol/L的磷酸鹽緩沖液，所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液為1L中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g的溶液；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
該免疫親和吸附劑基于免疫反應(yīng)和色譜反應(yīng)，適合從生物樣品(如肌肉、肝、肺、腎、血漿)中提純α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇，便于殘留分析。在該免疫親和吸附劑中，對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體和溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率是96.7±1.5％，該單克隆抗體對β-玉米赤霉醇、或玉米赤霉酮和和α-玉米赤霉烯醇都有很高的交叉反應(yīng)，α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇動態(tài)柱容量分別為2640、2840、2731、2736ng/mL，絕對柱容量分別為377、405、390、391ng/mg，在使用了15次后柱容量為總柱容量的43％左右，保存期為1年。
本發(fā)明所提供的凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理將動物組織樣品以5g的量加入5mL甲醇，渦動混勻，3500g離心10分鐘，收集上清液，置于-20℃1小時，過0.25μM微孔濾膜得到樣品溶液。
2)將步驟1)得到的樣品溶液過免疫親和色譜柱，然后用洗滌液洗滌，再用上述洗脫液洗脫，得到凈化的α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇溶液。
本發(fā)明的免疫親和吸附劑使樣品前處理過程大大簡化，尤其適用于肌肉、肝和血漿中微量α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇的前處理，分析質(zhì)量得到改善。免疫親和吸附劑的高選擇性使得α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇分析方法的檢測限將主要取決于取樣量，這是單純理化手段難以達(dá)到的；本發(fā)明的免疫親和吸附劑對待測組分有很強(qiáng)的保留和濃縮能力，只要加樣量不超過柱容量，在實測樣品條件下免疫親和吸附劑對組分的保留能力幾乎不受樣品體積或組分濃度的影響。本發(fā)明的方法對組分凈化的同時還可提供定性信息。本發(fā)明的方法水相操作，操作簡單，凈化效果好，免疫親和色譜柱能重復(fù)使用，能節(jié)省大量的有機(jī)溶劑，降低分析成本和環(huán)境污染。本發(fā)明的提純方法結(jié)合色譜法高效檢測α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測定技術(shù)直接測定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學(xué)技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機(jī)制的互補(bǔ)性。


圖1為添加α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇牛肌肉樣品凈化效果氣質(zhì)色譜2為α-玉米赤霉醇單克隆抗體免疫原的制備流程圖具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的免疫色譜柱的制備1、α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體的制備半抗原的合成將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)得到ZER-7-半琥珀酸酯，即為α-玉米赤霉醇半抗原。具體步驟如下所述1)取α-玉米赤霉醇520mg，琥珀酸酐480mg，溶于20ml吡啶中，在氮氣環(huán)境下加熱回流4小時。
2)步驟1)的反應(yīng)產(chǎn)物減壓蒸發(fā)，將殘留物溶于乙酸乙酯中，然后用0.5mol/L硫酸洗滌3次，棄去水相，得到有機(jī)相。
3)步驟2)得到的有機(jī)相用飽和碳酸鈉溶液萃取3次，保留水相，再用乙酸乙酯洗滌3次。
4)水相用4mol/L的HCl調(diào)pH至4.0，得到ZER-7-半琥珀酸酯沉淀，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，ZER-7-半琥珀酸酯即溶于有機(jī)相中。有機(jī)相用蒸餾水洗滌2次，用無水硫酸鈉干燥，氮氣吹干，溶于氯仿中，再加入石油醚，得到ZER-7-半琥珀酸酯沉淀即為α-玉米赤霉醇半抗原。
半抗原合成的反應(yīng)式為 免疫原的制備采用混合酸酐法，將α-玉米赤霉醇半抗原與蛋白質(zhì)載體牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，制成BSA-ZER或OVA-ZER偶聯(lián)物，即免疫原。
具體步驟如下所述(免疫原制備流程圖如圖2所示)1)取ZER-7-半琥珀酸酯300mg，三正丁胺132mg，溶于20ml二噁烷中，溶液冷卻至10℃，邊攪拌邊加入氯甲酸異丁酯100mg，溶液冷卻至4℃，攪拌45min。
2)4℃條件下，取BSA 650mg，加入2.5ml lmol/L氫氧化鈉，加入130ml二噁烷與水按1∶1比例配制的混合液，最終得到BSA溶液，將步驟1)中得到的反應(yīng)液體加入該BSA溶液中，4℃攪拌1小時后加入lml 1mol/L氫氧化鈉，4℃攪拌4小時，蒸餾水透析12小時。
3)用lmol/L鹽酸將步驟2)得到的溶液調(diào)pH至2.0，即產(chǎn)生Z7BSA沉淀，將沉淀置于100ml蒸餾水中，用1M氫氧化鈉調(diào)pH至11.0，沉淀溶解。加入丙酮(4℃，300ml)，用1M鹽酸調(diào)pH至2.0，Z7BSA再次沉淀出來，收集，再重復(fù)丙酮沉淀過程3次。
4)將步驟3)得到的Z7BSA沉淀溶于300ml蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至11.0。2000g離心10min，棄沉淀，上清液對蒸餾水4℃透析48h，每6～8小時換一次透析液。透析后，加入0.0l％硫柳汞，小瓶分裝，-20℃保存。
動物免疫采用BALA/C小鼠作為免疫動物、以上述α-玉米赤霉醇半抗原與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)物BSA-ZER或OVA-ZER偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為100μg/只，加等體積的完全弗氏佐劑乳化，進(jìn)行首次免疫。兩周后，取同樣量免疫抗原加不完全弗氏佐劑，乳化，進(jìn)行第二次免疫。間隔兩周，進(jìn)行第三次免疫，方法同第二次免疫。再隔兩周，進(jìn)行第四次免疫，方法同第二次免疫。融合前3天再對BALB/C小鼠加強(qiáng)免疫一次，腹腔注射100μg抗原，不加佐劑。融合前摘眼球放血，獲得陽性血清，然后將小鼠拉頸脫臼處死，取脾臟。
細(xì)胞融合脾細(xì)胞按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
雜交瘤細(xì)胞克隆化采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到完全同質(zhì)的對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)性，單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株-對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCCNo.1603。對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
單克隆雜交瘤細(xì)胞的保存在液氮-20℃下保存，使用時37℃水浴快速解凍。
單克隆抗體大量生長及提純采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603 5×105-106個/只，7-10天后采集腹水。
2、單克隆抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨法純化單克隆抗體。其具體步驟如下取上述方法腹腔注射對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603得到的腹水5mL，加入0.06mol/L、pH4.0的NaAc-HAc緩沖液10mL，攪拌均勻，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.2。在室溫下邊攪拌邊加入165μL辛酸，攪拌30min。在4℃ 6000g離心30min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.2。然后在4℃條件下，邊攪拌邊加入15mL飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的最終質(zhì)量百分含量為50％，攪拌30min后，在4℃6000g離心30min，棄上清液，將沉淀懸浮于5.5mL 0.01M pH7.2的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)中。將沉淀懸浮液邊攪拌邊加入4.5mL飽和硫酸銨溶液，此操作在4℃條件下完成。此時硫酸銨終濃度為45％，攪拌30min后，4℃6000g離心30min，棄上清液，將沉淀懸浮于1mL 0.01M pH7.2PBS中。將沉淀懸浮液裝入透析袋中，用0.01MpH7.2PBS透析，4～6小時換液一次，換液2～3次。用紫外分光光度計測定IgG溶液在280nm和260nm處的OD值，得到對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體，純化后的IgG在-20℃冰箱保存。
3、免疫色譜柱(IAC)的制備基質(zhì)的準(zhǔn)備取溴化氰活化的Sepharose 4B干凍粉，在盛有1.0mmol 1-1HCl的G3漏斗中膨脹。
抗體IgG的準(zhǔn)備用0.1mol/L的NaHCO3溶液將純化的對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體稀釋，調(diào)溶液的pH值為8.4。
偶聯(lián)反應(yīng)將膨脹的溶膠用0.1mol/L的NaHCO3溶液平衡后，轉(zhuǎn)入上述NaHCO3溶液稀釋的對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體溶液中，混合，4℃下緩慢攪拌20-24小時。40mLPBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉29.3g)洗去未偶聯(lián)抗體并測其偶聯(lián)率，偶聯(lián)率的檢測結(jié)果表明，對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率是96.7±1.5％。
活化位點的封閉將上述偶聯(lián)后的凝膠轉(zhuǎn)入盛有0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，混合，4℃下緩慢攪拌2hr，以封閉未偶聯(lián)的活化位點。
洗滌凝膠用5倍體積的0.1mol/L、pH4.0醋酸鹽緩沖液和0.1mol/L、pH8.0Tris-HCl緩沖液交替沖洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡后，抽干的凝膠轉(zhuǎn)入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸鹽緩沖液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN31g)中，4℃下存放備用。
裝柱將偶聯(lián)有對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體的免疫吸附劑轉(zhuǎn)入到含G3濾板的層析柱里，制成偶聯(lián)有對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱(IAC柱)。
5、IAC柱容量的確定將步驟4制備的偶聯(lián)有對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱，分別用10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)洗柱，輕輕上下晃動IAC柱，趕走柱里的氣泡，再以10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡。分別將含有100ng·ml-1α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇的PBS-甲醇溶液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，200mL甲醇)連續(xù)加到IAC柱，自然重力下流出。當(dāng)柱達(dá)到飽和后(流出液中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇與加樣液濃度相同)，用10ml PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)、15ml水洗滌IAC柱，再用4ml 30％(體積百分含量)的甲醇水溶液洗滌，除去提取液中干擾雜質(zhì)。最后用4ml甲醇將α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇洗脫，自然重力下流出，收集，吹干，加入0.05ml的雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)試劑，渦動，60℃衍生化15min，進(jìn)行GC/MS測定。計算出動態(tài)柱容量和絕對柱容量。動態(tài)柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升免疫吸附劑(或柱床體積)對待測物的最大吸收值。絕對柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗體對待測物的最大結(jié)合容量。結(jié)果表明偶聯(lián)有對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCCNo.1603分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇動態(tài)柱容量分別為2640、2840、2731、2736ng/mL，該免疫色譜柱對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇絕對柱容量分別為377、405、390、391ng/mg。
實施例2、偶聯(lián)有鼠單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒的制備及其對α-玉米赤霉醇的凈化效果1、凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的試劑盒的制備主要由盒體，免疫色譜柱(IAC柱)，標(biāo)準(zhǔn)α-玉米赤霉醇試劑，洗滌液，洗脫液，保存液，海綿托架所組成，海綿托架上設(shè)有孔和凹槽。海綿托架的凹槽內(nèi)有裝有標(biāo)準(zhǔn)α-玉米赤霉醇試劑，洗滌液，洗脫液，保存液的試劑瓶，海綿托架的孔內(nèi)裝有IAC柱。其中免疫色譜柱為實施例1制備的偶聯(lián)有對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCCNo.1603分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱。
洗滌液為磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)，配制方法為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g。
洗脫液為色譜級的甲醇。
保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
上述免疫色譜柱的試劑盒分別放在4℃有效期為12個月。
2、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇的凈化效果實驗IAC提取原理是，將特異性抗體對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體和惰性基質(zhì)偶聯(lián)，制備免疫吸附劑，裝柱。當(dāng)含α-玉米赤霉醇或/和β-玉米赤霉醇或/和玉米赤霉酮或/和α-玉米赤霉烯醇的混合物流過IAC柱時，固定抗體選擇性地結(jié)合α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇，其它不被識別的樣品雜質(zhì)則不受阻礙地流出IAC柱，經(jīng)洗滌后，將抗原-抗體復(fù)合物解離洗脫，α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇得到凈化或分離。IAC柱經(jīng)再生處理后可重復(fù)使用。
檢測樣品的處理取牛肌肉樣品(取自未接觸過α-玉米赤霉醇類物質(zhì)的牛)各5g于50ml塑料離心管中，每個樣本按2.5μg/kg濃度分別添加α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，再分別加入5mL甲醇，渦動1min，3500g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一個干凈的離心管中，重復(fù)提取，合并上清液。放入-20℃冰柜1hr，過0.25μM微孔濾膜。取過膜溶液5mL與20mL上述試劑盒中的洗滌液混勻，備用。
將上述制備的偶聯(lián)有對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱平衡到室溫，用10ml上述試劑盒中的洗滌液沖洗，然后將上述的樣品溶液過柱，用15ml水洗滌，然后再加入4ml30％(體積百分含量)的甲醇水溶液洗滌，目的是為了除去非特異性吸附的雜質(zhì)。用4ml洗脫液洗脫，在50℃ N2氣流下吹干，然后加入50μl衍生化試劑BSTFA，渦動，60℃衍生化15分鐘，然后進(jìn)行GC/MS分析，測定α-玉米赤霉醇的含量，以α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇標(biāo)準(zhǔn)品為對照。IAC柱用20ml的保存液平衡保存在4℃冰箱里備用。測定結(jié)果表明，用IAC進(jìn)行樣品凈化，不干擾藥物色譜峰，能夠完全分離，說明制備的IAC非特異性吸附極小。其中偶聯(lián)有對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱對于添加2.5μg/kg濃度的α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇標(biāo)準(zhǔn)品的牛肌肉樣品中的凈化效果如圖1所示，圖中1為玉米赤霉酮，2為α-玉米赤霉醇，3為β-玉米赤霉醇，4為α-玉米赤霉烯醇；A為添加α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇牛肉樣品(各2.5ng/g)，B為α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇標(biāo)準(zhǔn)品(各2.0ng/g)。
權(quán)利要求
1.一種凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的免疫親和吸附劑，是由固相載體和與其偶聯(lián)的α-玉米赤霉醇單克隆抗體組成；所述α-玉米赤霉醇單克隆抗體是以α-玉米赤霉醇半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述α-玉米赤霉醇半抗原是將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)得到的ZER-7-半琥珀酸酯，即為α-玉米赤霉醇半抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠，優(yōu)選為Sepharose 4B；所述α-玉米赤霉醇單克隆抗體為α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的吸附劑，其特征在于所述α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體為對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α-玉米赤霉烯醇都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-1 CGMCC No.1603分泌的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.裝載有權(quán)利要求1-4中任一所述的免疫親和吸附劑的免疫親和色譜柱。
6.含有權(quán)利要求1-4中任一所述的免疫親和吸附劑的試劑盒或含有權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液為甲醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗滌液、保存液；所述洗滌液為pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液為1L中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g的溶液；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
9.一種凈化α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理將動物組織樣品以5g的量加入5mL甲醇，渦動混勻，3500g離心10分鐘，收集上清液，置于-20℃1小時，過0.25μM微孔濾膜得到樣品溶液；2)將步驟1)得到的樣品溶液過權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱，然后用權(quán)利要求8所述的洗滌液洗滌，再用權(quán)利要求7所述的洗脫液洗脫，得到凈化的α-玉米赤霉醇和/或β-玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α-玉米赤霉烯醇溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述動物組織樣品包括肌肉、肝、肺、腎和血漿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凈化α－玉米赤霉醇及其代謝物的方法與免疫親和色譜柱。該凈化α－玉米赤霉醇和/或β－玉米赤霉醇和/或玉米赤霉酮和/或α－玉米赤霉烯醇的專免疫親和色譜柱裝載有免疫親和吸附劑，該免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的α－玉米赤霉醇單克隆抗體組成；所述α－玉米赤霉醇單克隆抗體是以α－玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；本發(fā)明的提純方法結(jié)合色譜法高效檢測α－玉米赤霉醇、β－玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和α－玉米赤霉烯醇的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測定技術(shù)直接測定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足。
文檔編號B01J20/281GK1830545SQ200610007239
公開日2006年9月13日 申請日期2006年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日
發(fā)明者沈建忠, 史為民, 張偉, 何方洋, 王鶴佳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)